DB33_T 2254-2020豬流行性腹瀉病毒與豬傳染性胃腸炎病毒 雙重?zé)晒舛?RT-PCR 檢測(cè)方法(高清正版）

1、ICS 65.020.30 B41DB33浙江省地方標(biāo)準(zhǔn)DB33/T 22542020豬流行性腹瀉病毒與豬傳染性胃腸炎病毒雙重?zé)晒舛?RT-PCR 檢測(cè)方法Method of duplex fluorescence quantitative RT-PCR for the detection of porcine epidemic diazhangchenrrhea virus and transmissiblegastroenteritis virus2020 - 04 - 08 發(fā)布2020 - 05 - 08 實(shí)施浙江省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā) 布DB33/T 22542020I前言本標(biāo)準(zhǔn)按照G

2、B/T 1.1-2009給出的規(guī)則起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省畜牧獸醫(yī)和飼料標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：浙江農(nóng)林大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：宋厚輝、邵春艷、王曉杜、孫靜、姜?jiǎng)?、周瑩珊、楊永春、程昌勇、章先、楊楊、衛(wèi)芳芳。DB33/T 22542020DB33/T 22542020 PAGE 32豬流行性腹瀉病毒與豬傳染性胃腸炎病毒雙重?zé)晒舛?RT-PCR 檢測(cè)方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和豬傳染性胃腸炎病

3、毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)方法的材料準(zhǔn)備、樣品采集、核酸提取、熒光定量RT-PCR檢測(cè)及結(jié)果判定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的核酸檢測(cè)。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 6682-2008 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。Ct值：達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)（Cycle threshold） DEPC：焦磷酸二乙酯（Dieth

4、ylpyrocarbonate） DNA：脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid） PBS：磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline）PEDV：豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus) RNA：核糖核酸（Ribonucleic Acid）RT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction） TGEV：豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus）試劑和材料除非另有說(shuō)明，所用試劑均為分析純

5、；所有試劑均用無(wú) RNA 酶的容器分裝。0.01 mol/L PBS 和 DEPC 水配制中所使用的水應(yīng)符合 GB/T 6682-2008 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法中一級(jí)水的要求。Trizol：RNA 抽提試劑，2 8 保存。4.3 氯仿：2 8 預(yù)冷。異丙醇：2 8 預(yù)冷。75%乙醇：用新開(kāi)啟的無(wú)水乙醇和 DEPC 水配制，2 8 預(yù)冷。DEPC 水：配置方法見(jiàn)附錄 A。宜直接購(gòu)買商品化 DEPC 處理的無(wú) DNA 酶和 RNA 酶的水。0.01 mol/L PBS，pH7.2：配制方法見(jiàn)附錄 A。2One Step RT-PCR buffer（內(nèi)含 PCR buffer、dNTPs 和

6、 Mg2+）。DNA 聚合酶：HS Taq DNA 聚合酶（5 U/L）。反轉(zhuǎn)錄酶預(yù)混物（內(nèi)含 RNase 抑制劑）。陽(yáng)性對(duì)照：豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎滅活病毒混合物。陰性對(duì)照：DEPC 水。用于 RT-PCR 反應(yīng)的引物濃度為 10 mol/L，探針濃度 10 mol/L，其序列分別為： PEDV 上游引物 F：5-GCTTGCTTCGGACCCAGAGG -3；PEDV 下游引物 R：5-ACGAACAGCCACATTACCACCAA -3；PEDV 探針 P：5-TTGGAGATGCGGAATTTGTCGAA-3，其 5端和 3端分別標(biāo)記 FAM 和 MGB； TGEV 上游引物 F

7、：5-AAGGAAGATGGCGACCAGATAG-3；TGEV 下游引物 R：5-CACTTCTGATGGGCGAGCAT -3；TGEV 探針 P：5- CACGTTCACACACAAAT -3，其 5端和 3端分別標(biāo)記 HEX 和 MGB；一次性耗材：乳膠手套，滅菌離心管、熒光 RT-PCR 反應(yīng)管、無(wú)菌 PCR 吸頭。器材和設(shè)備電熱干燥箱。高壓滅菌鍋。高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：可控溫至 4 ，最大離心速度可達(dá) 12 000 r/min 以上。冷藏冰箱，冷凍冰箱（-80 ）。熒光 PCR 檢測(cè)儀。微量移液器。實(shí)驗(yàn)室分區(qū)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有相應(yīng)的生物安全設(shè)施和功能分區(qū)，包括樣品處理區(qū)、核酸提取區(qū)、反應(yīng)

8、混合物配置區(qū)、加樣區(qū)和擴(kuò)增區(qū)。各功能區(qū)有專用的試劑和實(shí)驗(yàn)材料，不可交叉使用。樣品的采集與處理采樣注意事項(xiàng)采樣及樣品前處理過(guò)程中應(yīng)無(wú)菌操作，防止樣本交叉污染。采樣工具藥匙、剪刀、鑷子，經(jīng) 160 干熱滅菌 2 h。無(wú)菌棉拭子。采樣方法與樣品處理腸內(nèi)容物的采集與處理無(wú)菌操作采取病死或剖殺豬的小腸內(nèi)容物 1 g2 g，置于 15 mL 離心管中，按 1：4 倍體積加入滅菌的 0.01 mol/L PBS，混勻，反復(fù)凍融 3 次。在 4 條件下以 3 000 r/min 離心 20 min，取上清液轉(zhuǎn)入 1.5 mL 離心管中編號(hào)備用，待檢。糞便的采集與處理用滅菌藥匙采取發(fā)病豬新鮮糞便或用無(wú)菌棉拭子采

9、取直腸內(nèi)糞便，置于 15 mL 離心管中，按 1：4 倍體積加入滅菌的 0.01 mol/L PBS，混勻，反復(fù)凍融 3 次。在 4 條件下以 3 000 r/min 離心 20 min， 取上清液轉(zhuǎn)入 1.5 mL 離心管中編號(hào)備用，待檢。細(xì)胞培養(yǎng)物處理細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融 3 次，轉(zhuǎn)入 1.5 mL 離心管中編號(hào)備用。樣品存放與運(yùn)輸采集的樣品密封后，采用保溫容器加冰袋或干冰，在 6 h8 h 之內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。采集或處理的樣品在 2 8 條件下保存不應(yīng)超過(guò) 24 h；若需長(zhǎng)期保存，應(yīng)放置于-80 冰箱中，且應(yīng)避免反復(fù)凍融，凍融不應(yīng)超過(guò) 3 次。核酸提取一般要求在核酸提取區(qū)進(jìn)行。酚-氯仿法抽提

10、核酸取 n 個(gè) 1.5 mL 離心管，其中 n 為待檢樣品數(shù)、2 管陽(yáng)性對(duì)照及 2 管陰性對(duì)照之和，對(duì)每個(gè)離心管進(jìn)行編號(hào)。每管加入 500 L Trizol，分別加入待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照各 100 L，顛倒 10 次混勻，靜置 5 min；再加入 200 L 氯仿，混勻器上振蕩混勻 5s，也可用手反復(fù)顛倒混勻。于 4，12 000 r/min 離心 15 min。檢測(cè)過(guò)程中不得交叉污染。取與本標(biāo)準(zhǔn)8.2.1 中相同數(shù)量的1.5 mL 離心管，加入500 L 異丙醇，對(duì)每個(gè)離心管進(jìn)行編號(hào)。取本標(biāo)準(zhǔn) 8.2.2 中離心后的上清液約 500 L 轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的離心管中，在吸取上清液時(shí)注意不應(yīng)吸

11、出中間層，顛倒混勻，-20 靜置 30 min。于 4 、12 000 r/min 離心 15 min，棄上清，倒置于吸水紙上，沾干液體，加入 600 L 75% 乙醇，顛倒混勻。于 4 、12 000 r/min 離心 15 min，棄上清，倒置于吸水紙上，沾干液體。不同樣品應(yīng)在吸水紙不同地方沾干。4 000 r/min 離心 10 s，用微量移液器小心將殘余液體吸干，室溫放置 3 min10 min。加入 30 L DEPC 水，輕柔混勻，溶解管壁上的 RNA，冰上保存?zhèn)溆?。提取?RNA 應(yīng)在 2 h 內(nèi)進(jìn)行熒光 RT-PCR 擴(kuò)增；若需長(zhǎng)期保存應(yīng)放置-80 冰箱。核酸提取等效方法可采用

12、核酸提取試劑盒或全自動(dòng)核酸抽提儀及配套核酸提取試劑進(jìn)行核酸抽提。熒光定量 RT-PCR 檢測(cè)DB33/T 22542020DB33/T 22542020 PAGE 6 PAGE 5熒光 RT-PCR 擴(kuò)增體系的配制在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行。設(shè)熒光 RT-PCR 反應(yīng)數(shù)為 n，其中 n 為待檢樣品數(shù)、2 管陽(yáng)性對(duì)照及 2 管陰性對(duì)照之和，每個(gè)樣品測(cè)試反應(yīng)體系配制見(jiàn)表 1。配制完畢的反應(yīng)液分裝時(shí)應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡，轉(zhuǎn)移至加樣區(qū)加樣。表1 每個(gè)樣品反應(yīng)體系配制表體系組分用量2One Step RT-PCR buffer10 LHS Taq 酶0.4 LRT Enzyme Mix0.4 LPEDV 上游

13、引物 F0.4 LPEDV 下游引物 R0.4 LPEDV 探針 P0.4 LTGEV 上游引物 F0.4 LTGEV 下游引物 R0.4 LTGEV 探針 P0.4 LDEPC 水4.8 L總量18 L加樣在加樣區(qū)進(jìn)行。在各設(shè)定的熒光 RT-PCR 管中分別加入按本標(biāo)準(zhǔn) 8.2.7 中制備的 2 L RNA 溶液，蓋緊管蓋后， 3 000 r/min 離心 30 s，上機(jī)前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊。熒光RT-PCR 擴(kuò)增在擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行。將按本標(biāo)準(zhǔn) 9.2 離心后的 RT-PCR 管放入熒光 PCR 檢測(cè)儀內(nèi)，記錄樣品擺放順序。循環(huán)條件設(shè)置如下：42 條件下反轉(zhuǎn)錄 30 min；95 條件下預(yù)變

14、性 10 s；95 條件下變性 5 s；60 條件下擴(kuò)增 30 s，40 個(gè)循環(huán)；60 時(shí)設(shè)置熒光信號(hào)的采集。熒光通道的設(shè)定PEDV Report Dye 設(shè)定為 FAM，Quencher Dye 設(shè)定為 MGB；TGEV Report Dye 設(shè)定為 HEX，Quencher Dye 設(shè)定為 MGB，Reference 設(shè)定為 None。結(jié)果判定閾值設(shè)定閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過(guò)陽(yáng)性對(duì)照品“S”型曲線指數(shù)擴(kuò)增初期的熒光值為準(zhǔn)。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照品FAM 和 HEX 通道的 Ct 值均應(yīng)30.0，并出現(xiàn)典型的 S 型擴(kuò)增曲線；陰性對(duì)照品 FAM 和HEX 通道均無(wú) C

15、t 值，且無(wú)典型擴(kuò)增曲線。陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照同時(shí)成立可判定試驗(yàn)有效，否則試驗(yàn)無(wú)效。結(jié)果描述及判定若被檢樣品 FAM 通道 Ct 值36.0，且出現(xiàn)典型的“S”型擴(kuò)增曲線，判定為 PEDV 核酸陽(yáng)性； 若被檢樣品 FAM 通道無(wú) Ct 值，且無(wú)典型的擴(kuò)增曲線，判為 PEDV 核酸陰性；若被檢樣品 FAM 通道 Ct 值36.0，且出現(xiàn)典型“S”型擴(kuò)增曲線，建議對(duì)該樣品進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果 Ct 值38.0 且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線者判為PEDV 核酸陽(yáng)性，否則判為PEDV 核酸陰性。若被檢樣品 HEX 通道 Ct 值36.0，且出現(xiàn)典型的“S”型擴(kuò)增曲線，判定為 TGEV 核酸陽(yáng)性； 若被檢樣品 HEX 通道無(wú) Ct 值，且無(wú)典型的擴(kuò)增曲線，判為 TGEV 核酸陰性；若被檢樣品 HEX 通道 Ct 值36.0，且出現(xiàn)典型“S”型擴(kuò)增曲線，宜對(duì)該樣品進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果 Ct 值38.0 且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線者判為 TGEV 核酸陽(yáng)性，否則判為 TGEV 核酸陰性。附 錄 A（規(guī)范