DB33_T 2269-2020豬圓環(huán)病毒2型與3型雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法(高清正版）

1、ICS 11.220B 41DB33浙江省地方標(biāo)準(zhǔn)DB33/T 22692020豬圓環(huán)病毒 2 型與 3 型雙重?zé)晒舛?PCR檢測(cè)方法Duplex fluorescence quantitative PCR method for the detection of porcine circovirus type 2 and type 32020 - 06 - 30 發(fā)布2020 - 07 - 30 實(shí)施浙江省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā) 布DB33/T 22692020I前 言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1-2009給出的規(guī)則起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。

2、本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省畜牧獸醫(yī)和飼料標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：浙江農(nóng)林大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：宋厚輝、邵春艷、周瑩珊、王曉杜、孫靜、姜?jiǎng)?、楊永春、程昌勇、章先、楊楊、衛(wèi)芳芳。DB33/T 22692020 PAGE 5豬圓環(huán)病毒 2 型與 3 型雙重?zé)晒舛?PCR 檢測(cè)方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬圓環(huán)病毒2型與3型雙重?zé)晒舛縋CR的檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬圓環(huán)病毒2型與3型的核酸檢測(cè)。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T

3、 6682-2008 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。Ct值：達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)（Cycle threshold） DNA：脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid） PBS：磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer Solution）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction） PCV-2：豬圓環(huán)病毒2型（Porcine Circovirus 2） PCV-3：豬圓環(huán)病毒3型（Porcine Circovirus 3） Taq酶：Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）試劑和材料除非另有說(shuō)明，所

4、用試劑均為分析純；滅菌水，0.01 mol/L PBS和8 mmol/L NaOH配制中所使用的水應(yīng)符合GB/T 6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法中一級(jí)水的要求。DNAzol Reagent：DNA 抽提試劑，2 8 保存。無(wú)水乙醇：4 預(yù)冷。75%乙醇：用無(wú)水乙醇和滅菌水配制，-20 預(yù)冷。8 mmol/L NaOH 溶液：配制方法見附錄A。0.01 mol/L PBS，pH 7.2：配制方法見附錄 A。2Premix HS Taq（內(nèi)含 PCR buffer，HS Taq，dNTPs，Mg2+，RNaseH 等）。陽(yáng)性對(duì)照：豬圓環(huán)病毒 2 型滅活疫苗和豬圓環(huán)病毒 3 型陽(yáng)性克

5、隆質(zhì)粒。PCV-3 目的基因（ORF2） 序列見附錄A。空白對(duì)照：滅菌水。用于熒光定量PCR 的引物濃度為 10 mol/L，Taqman 探針濃度 5 mol/L，其序列分別為：PCV-2-F：5-TCACCTATGACCCCTATG-3；PCV-2-R：5-GGAAGTAATCAATAGTGGAATC-3；PCV-2-P：5-FAM-ACTCCTCTCGCCATACCATAACC-BHQ1-3；PCV-3-F：5-TGGCTCAACACATATGAC-3；PCV-3-R：5-ACGGACTTGTAACGAATC-3；PCV-3-P：5-HEX-TGCCGTAGAAGTCTGTCATTCCA

6、-BHQ1-3。一次性耗材：乳膠手套、1.5 mL 離心管、15 mL 離心管、熒光PCR 反應(yīng)管和吸頭。器材和設(shè)備電熱干燥箱。高壓滅菌鍋。高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：可控溫至 4 ，最大離心速度可達(dá) 12 000 r/min 以上。冷藏冰箱，超低溫冰箱（-80 ）。熒光 PCR 檢測(cè)儀。組織勻漿器。移液器。研缽。實(shí)驗(yàn)室分區(qū)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有相應(yīng)的生物安全設(shè)施和功能分區(qū)，包括樣品處理區(qū)、核酸提取區(qū)、試劑配制區(qū)和擴(kuò)增區(qū)。各功能區(qū)有專用的試劑和實(shí)驗(yàn)材料，不可交叉使用。樣品的采集與處理采樣注意事項(xiàng)采樣及樣品前處理過(guò)程中應(yīng)注意無(wú)菌操作，防止樣本交叉污染。采樣工具藥匙、剪刀、鑷子，經(jīng) 160 干熱滅菌 2 h。采樣

7、方法與處理內(nèi)臟樣品采取病死或剖殺豬的主要臟器（淋巴結(jié)、脾臟、肺臟和腎臟）裝入 15 mL 滅菌離心管中，按 1：4 倍體積加入滅菌的 0.01 mol/L PBS。運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室后，再用研缽或組織勻漿器對(duì)組織進(jìn)行充分研磨混勻，反復(fù)凍融 3 次。在 4 條件下以 3 000 r/min 離心 20 min，取上清液轉(zhuǎn)入 1.5 mL 離心管中編號(hào)備用，待檢。血清樣品血清樣品無(wú)需處理，直接用于核酸提取。存放與運(yùn)送采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，在6 h8 h之內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。采集或處理的樣品在2 8 條件下保存應(yīng)不超過(guò)24 h；需長(zhǎng)期保存時(shí)，應(yīng)放置-80 冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍融不

8、超過(guò)3次）。核酸提取一般要求應(yīng)在核酸提取區(qū)進(jìn)行。DNAzol 法抽提核酸取 n 個(gè)滅菌的 1.5 mL 離心管，其中n 為待檢樣品數(shù)、2 管陽(yáng)性對(duì)照及 2 管空白對(duì)照之和，對(duì)每個(gè)離心管進(jìn)行編號(hào)。每管加入 500 L DNAzol，分別加入待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照各 250 L，顛倒 10 次混勻，靜置 5 min；于 4 ，10 000 r/min 離心 10 min。取 900 L 上清，置于新的 1.5 mL 滅菌離心管中，每使用 1 mL DNAzol，加 500 L 無(wú)水乙醇， 顛倒混勻 5 次8 次，室溫放置 1 min3 min；于 4 ，5 000 r/min 離心 5 mi

9、n。棄上清，沿管壁緩緩加入 1 mL 75%乙醇，顛倒混勻 3 次6 次，靜置 0.5 min1 min；4 ， 1 000 r/min 離心 2 min。反復(fù)洗滌兩次后，將離心管倒扣于吸水紙上，自然晾干（以無(wú)乙醇味為準(zhǔn)）。用 50 L 8 mmol/L NaOH 溶液溶解沉淀，于-20 冰箱保存?zhèn)溆?。核酸提取等效方法可采用核酸提取試劑盒或自?dòng)化核酸抽提儀及配套核酸抽提試劑進(jìn)行核酸抽提。實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增體系的配制在試劑配制區(qū)進(jìn)行。設(shè) PCR 反應(yīng)數(shù)為n，其中n 為待檢樣品數(shù)、2 管陽(yáng)性對(duì)照及 2 管空白對(duì)照之和，每個(gè)樣本測(cè)試反應(yīng)體系配制見表 1。配制完畢的反應(yīng)液分裝時(shí)

10、應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡，轉(zhuǎn)移至核酸提取區(qū)加樣。表1 每個(gè)樣品反應(yīng)體系配制表體系組分用量2Premix HS Taq10 LPCV-2-F0.4 LPCV-2-R0.4 LPCV-2-P0.8 LPCV-3-F0.4 LPCV-3-R0.4 LPCV-3-P0.8 LDEPC 水4.8 L總量18 L加樣在核酸提取區(qū)進(jìn)行。在各設(shè)定的熒光 PCR 管中分別加入本標(biāo)準(zhǔn) 8.2.5 中制備的 2 L DNA 溶液，蓋緊管蓋后，3 000 r/min 離心 30 s；上機(jī)前應(yīng)檢查各反應(yīng)管是否蓋緊。實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增在擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行。將本標(biāo)準(zhǔn) 9.2 中離心后的 PCR 管放入熒光 PCR 檢測(cè)儀內(nèi)，記錄樣品擺

11、放順序。循環(huán)條件設(shè)置：95 條件下預(yù)變性 30 s；95 條件下變性 5 s；60 條件下擴(kuò)增 30 s，40 個(gè)循環(huán)；60 時(shí)設(shè)置采集熒光。熒光通道設(shè)定PCV-2 Report Dye設(shè)定為FAM，Quencher Dye設(shè)定為BHQ；PCV-3 Report Dye設(shè)定為HEX，Quencher Dye 設(shè)定為BHQ。結(jié)果判定閾值設(shè)定閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過(guò)陽(yáng)性對(duì)照品“S”型曲線指數(shù)擴(kuò)增初期的熒光值為準(zhǔn)。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照品 FAM 和 HEX 通道的 Ct 值均應(yīng)30.0，并出現(xiàn)典型的“S”型擴(kuò)增曲線；空白對(duì)照品 FAM 和 HEX 通道均無(wú) Ct 值，且無(wú)典

12、型擴(kuò)增曲線。陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照同時(shí)成立可判定試驗(yàn)有效，否則試驗(yàn)無(wú)效。結(jié)果描述及判定若被檢樣品 FAM 通道 Ct 值36.0，且出現(xiàn)典型的“S”型擴(kuò)增曲線，判定為 PCV-2 核酸陽(yáng)性；若被檢樣品 FAM 通道無(wú) Ct 值，且無(wú)典型的擴(kuò)增曲線，判定為 PCV-2 核酸陰性；若被檢樣品 FAM 通道 Ct 值36.0，且出現(xiàn)典型“S”型擴(kuò)增曲線，建議對(duì)該樣品進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果 Ct 值38.0 且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線者判為 PCV-2 核酸陽(yáng)性，否則判為 PCV-2 核酸陰性。若被檢樣品 HEX 通道 Ct 值36.0，且出現(xiàn)典型的“S”型擴(kuò)增曲線，判定為 PCV-3 核酸陽(yáng)性；若被檢樣品

13、HEX 通道無(wú) Ct 值，且無(wú)典型的擴(kuò)增曲線，判定為 PCV-3 核酸陰性；若被檢樣品 HEX 通道 Ct 值36.0，且出現(xiàn)典型“S”型擴(kuò)增曲線，建議對(duì)該樣品進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果 Ct 值38.0 且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線者判為 PCV-3 核酸陽(yáng)性，否則判為 PCV-3 核酸陰性。附 錄 A（規(guī)范性附錄） 配制方法8 mmol/L NaOH溶液的配制稱量0.32 g NaOH，溶解到1 000 mL二級(jí)水中，混勻，分裝，常溫保存。0.01 mol/L PBS（pH 7.2）的配制稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O) 3.0 g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2 g，氯化鉀（KCl）0

14、.2 g，氯化鈉（NaCl) 8 g，加二級(jí)水定容至1 000 mL，完全溶解后用3 mol/L的NaOH調(diào)pH為7.2，經(jīng)121 （2）， 高壓滅菌15 min，室溫保存。PCV-3 目的基因（ORF2）序列ATGAGACACAGAGCTATATTCAGAAGAAGACCCCGCCCAAGGAGACGACGACGCCACAGAAGGCGCTATGCCAGAAGAAGACTAT TCATTAGGAGGCCCACAGCTGGCACATACTACACAAAGAAATACTCCACCATGAACGTCATTTCCGTTGGAACTCCTCAGAATAATAAG CCCTGGCACGCCAACCACTTCATTACCCGCCTAAACGAGTGGGAAACTGCAATTAGCTTTGAATATTATAAGATACTAAAGATGAAAGT TACACTAAGCCCTGTAATTTCTCCAGCTCAGCAAACAAAAACTATGTTCGGGCACACAGCCATAGATCTAGACGGCGCCTGGACCACAA ACACTTGGCTCCAAGACGACCCTTATGCGGAAAGTTCCACTCGTAAAGTTATGACTTCTAAAAA