尼克酸(維生素PP-又稱煙酸)的測定方法

1、尼克酸（維生素PP-又稱煙酸）的 測定方法尼克酸(維生素PP,又稱煙酸)的測定方法(1)此處介紹微生物法、比色法以及復(fù)合維生素制劑中的煙酰胺測定方法(分光光度法)一、微生物法.原理一種微生物生長必需某一些維生素，Lactobacillus arabinosus的生長需要尼克酸。尼克酸是指具有尼克酸生物學(xué)活性的叱咤 3-竣酸及其衍生物的總稱。它是白色晶體，是維生素中最穩(wěn)定的一種，對酸、堿、 熱、光及弱氧化劑都很穩(wěn)定，微溶于冷水，易溶于熱水及乙醇。其檢出限為10ng。.適用范圍本方法來源自AOACW國標(biāo)GB12395-90。適用于食物及飼料中的尼克酸的檢測。.儀器(1)電熱恒溫培養(yǎng)箱(37 + 0

2、.5 C )(2)無菌室(紫外燈消毒)(3)電熱手提式壓力蒸汽消毒器(121 C,高壓30min)(4)液體快速混合器離心機(jī)( 3000 轉(zhuǎn)，10min)(6)堿式滴定管(7)硬質(zhì)玻璃試管.試齊I所用試劑皆為分析純；所用水皆為蒸儲水標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制(1)尼克酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液(0.1mg/ml )：準(zhǔn)確稱取50.0mg已干燥恒重并儲于五氧化二磷干燥器中的尼克酸標(biāo)準(zhǔn)，以25叱醇溶液溶解并定容至 500ml,于冰箱中保存。(2)尼克酸標(biāo)準(zhǔn)中間液(1ug/m)：吸取1.00ml尼克酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于 100ml容量瓶中，用25叱醇溶 液定容，混勻，于冰箱中保存。(3)尼克酸標(biāo)準(zhǔn)工作液(0.1ug/m)：臨用

3、時(shí)吸取5.00ml尼克酸標(biāo)準(zhǔn)中間液，置于 50ml容量瓶中，用水 定容，混勻。其它試劑的配制0.5mol/L 硫酸：于2000ml燒杯中加入 700ml水，加入28ml H2SO4,用水稀釋至 1000ml。10mol/L 氫氧化鈉：溶 200g NaOH于水中，稀釋至 500ml。0.1mol/L 氫氧化鈉：，取 10ml 10mol/L NaOH ,用水稀釋至 1000ml。0.04%漠甲酚綠溶液，稱取 0.1g漠甲酚綠于研缽中，加 1.4ml 0.1mol/L NaOH 研磨，加少許水繼續(xù)研磨，直至完全溶解，用水稀釋到250ml。(5)酪蛋白(sigma公司)：稱取50g不含維生素的酪蛋

4、白，力口 200ml ( 3mol/L )鹽酸，121c磅壓力下水解6小時(shí)，將水解物轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿內(nèi)，在水浴上蒸發(fā)至膏狀。加200ml水使之溶解后再蒸發(fā)至膏狀，反復(fù)3次，以除去鹽酸。注意：*酸解酪蛋白是為了去除酪蛋白中的維生素，確保培養(yǎng)基中不含代測的尼克酸，但酸解并不一定徹底，因此選用不含維生素的酪蛋白。*水浴蒸發(fā)時(shí)不可蒸干或使之焦糊，若溶液被蒸干，水解液所含營養(yǎng)物已被破壞用10mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值至3.5,以漠酚藍(lán)作外指示劑。加 20g活性炭，振搖，過濾，反復(fù)操作至濾液無色。濾液加水稀釋至 500ml,加少許甲苯置冰箱中保存。*注意：活性炭不能在溶液中太久，否則容易破壞酪蛋白的營養(yǎng)成分

5、(待續(xù))尼克酸(維生素PP,又稱煙酸)的測定方法(2)(6)漠酚藍(lán)：稱取0.1g漠酚藍(lán)，用1+4乙醇溶解后，再加乙醇稀釋至100ml。(7)甲苯4mol/L 鹽酸溶液，V+V=1+45mol/L 生理鹽水：取 9gNaCl溶于1000ml水中。(10)胱氨酸、色氨酸溶液：稱取 4gL-胱氨酸和1gL-色氨酸溶于800ml水中，加熱至7080C,逐滴加入20%鹽酸，不斷攪拌，直至完全溶解為止。冷至室溫，加水稀釋至1000ml o加少許甲苯于冰箱中保存。(11)腺嗯吟、鳥嗯吟、尿嗑咤溶液：稱取硫酸腺嗯吟，鹽酸鳥嗯吟及尿嗑咤各0.1g ,加75ml水和2ml濃鹽酸，然后加熱使其完全溶解，冷卻，若有沉

6、淀產(chǎn)生，加濃鹽酸數(shù)滴，再加熱。如此反復(fù)，直至冷卻后無沉淀產(chǎn)生為止。用水稀釋至100ml。加少許甲苯于冰箱中保存。(12) D-泛酸鈣、對氨基苯甲酸、鹽酸叱哆醇溶液：稱取D-泛酸鈣、對氨基苯甲酸、鹽酸叱哆醇各 10mg于燒杯中，以水溶解并稀釋至1000ml,將此液置于棕色瓶中，加少許甲苯于冰箱中保存。*注意：此溶液見光分解，因此儲存于棕色瓶中（14）核黃素-鹽酸硫胺素，生物素溶液：溶解1噸生物素結(jié)硒ml OOrnl 0.01747皿）1幾的醋酸中，取此 液4ml （相當(dāng)于40ug生物素），加入20噌核黃素和LOrng鹽酸硫胺素，以0. 01747inOl/L醋酸溶解并稀釋至 1000ml,將此液

7、置于株色瓶中，加少許甲笨于冰箱中保存.*注意此溶液見光分解，因此儲存于棕色瓶中（15）甲鹽溶液：取25g磷酸氫,二鉀和25用硝酸二氫鉀，加水溶解后稀釋至500班，加少許甲荒于泳箱中 保存口（16）乙鹽溶液：取1Q屬硫酸鎂，。.近氯化鈉，0. 5且硫酸亞鐵和0. 5g硫酸鈦，加水溶解后稀稀至500m 1，加5滴濃鹽酸，加少許甲茉于冰箱中保存.（17）乙B?溶液 V/V=l/3（18）嗅酚藍(lán):：稱取0日澳酚藍(lán)，用1+3乙醉溶液溶解后，再稀釋至100皿，0. 0騾溟麝香草酚藍(lán)溶液：稱取0. 1g謨.麝香草酣藍(lán)于研缽中，加1.6mL 0. Imol/L NaOH,研磨*加少許水維續(xù)研磨，直至完全溶解，

8、用水稀釋至250mL0.004%濱嬴香草酚藍(lán)溶液；量取ItXMlO. 04%旗鹿香草酚藍(lán)溶液，加水稀稗至100加I,供滴定用，（21）基本培養(yǎng)基儲備液工酸解酪蛋白50ml胱氨酸、色菰酸溶液50ml腺嚎吟、鳥噫吟、尿喘晚溶液10mlD-泛酸鈣、對氮基笨甲酸、毗哆醇溶液1你1核黃素、盤酸磕胺素、生物素溶液1加1甲鹽溶液Ittal乙鹽溶液ICiul無水菊葡糖10g無水醋酸鈉1。（或結(jié)晶醋酸鈉NaAJ 3H20 16.6g）將上列試劑混合，用水稀釋至500ml用氫氧化拋調(diào)PH至6. 日以謨麝香草酚藍(lán)作外指示劑,（持續(xù)）尼克酸（維生素PP,又稱煙酸）的測定方法（3）(22)瓊脂培養(yǎng)基：無水葡萄糖1g 醋

9、酸鈉1g 蛋白陳0.8g酵母提取物干粉0.2g 甲鹽溶液0.2ml乙鹽溶液0.2ml 瓊脂1.2g混合，加水至100ml，加熱至瓊脂完全溶化，以漠麝香草酚藍(lán)為外指示劑，用鹽酸趁熱調(diào)PH至6.8 ,盡快倒入試管中，每管 35ml,加塞棉塞，于壓力蒸汽消毒器中121c滅菌10min,取出后豎直試管，冷至室溫后保存于冰箱中。4.3菌種的制備與保存(1) 菌種的制備與保存：以阿拉伯乳酸桿菌？ Lactobacillus arabinosus 17-5 ATCC No.8014 簡稱Lact.A?純菌種接入2個(gè)或多個(gè)瓊脂培養(yǎng)基管中， 在37+ 0.5 C恒溫箱中保溫16-24小時(shí)，取出于冰箱中保存，至多

10、不超過兩周。保存數(shù)周以上的菌種，不能立即用作制備接種液之用，一定要在使用前每天轉(zhuǎn)種一次， 連續(xù)2-3天，方可使用，否則生長不好。(2)種子培養(yǎng)液的制備：加 5ml 0.1ug/ml的尼克酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液于尖頭試管中，加入5ml基本培養(yǎng)基，塞好棉塞，于壓力蒸汽消毒器內(nèi)(高壓鍋)121c下消毒10min,取出，置于冰箱中，此管可保存數(shù)周之久。5.操作步驟5.1樣品制備：取含尼克酸約 5-50ug的均勻樣品于100ml三角瓶中，加0.5mol/LH2SO450ml。放入高壓蒸 汽鍋121c下水解30min,取出，于水中冷卻，用10mol/LNaOH和0.5mol/LH2SO4調(diào)PH值至4.5 ,用漠甲酚

11、綠做指示劑。將三角瓶內(nèi)的溶液轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，用蒸儲水定容至100ml,濾紙過濾，保存濾液于冰箱內(nèi)備測(保存期不超過36小時(shí))。*用0.5mol/L硫酸水解，可以斷開尼克酸和其它物質(zhì)結(jié)合的鍵，使尼克酸游離出來。*觀察漠甲酚綠至草綠色為終點(diǎn)，說明溶液PH值到了 4.5.調(diào)PH值至4.5可以除去樣品中刺激和抑制細(xì)菌 生長的物質(zhì)，如：淀粉、脂肪酸及磷脂。許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)也在PH4.5,所以此PH值也可用來沉淀蛋白質(zhì)。接種液的制備：使用前一天，將阿拉伯乳酸桿菌菌種由儲備菌種管移種于已消毒的種子培養(yǎng)液中，可同時(shí)制備兩管，在 37+ 0.5 C的恒溫箱中培養(yǎng)16-24小時(shí)。取出離心10分鐘(30

12、00rpm)傾去上部液體，用已消毒的生理鹽水淋洗 2次，再加10ml消毒過的生理鹽水，將離心管置于液體快速混合器上混合，使 菌種成為混懸體，將此液倒入已消毒的注射器內(nèi)，立即使用。樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：3組試管各加0, 0.5 , 1.0, 1.5, 2.0, 2.5和3.0ml工作液，每管加水稀釋至 5ml,再加5ml基本培養(yǎng)基，混勻，加棉塞。(待續(xù))尼克酸(維生素PP,又稱煙酸)的測定方法(4)試樣的測定：在試管中分別加入1, 2, 3, 4ml樣液，加水稀釋至 5ml,再加入5ml基本培養(yǎng)基，用棉塞塞住試管，將制備好的標(biāo)準(zhǔn)曲線和試樣測定管放入高壓鍋(121C)高壓10min,冷至室溫備用。接

13、種和培養(yǎng)：每管種一滴接種液，于37 0.5 C恒溫箱中培養(yǎng)72小時(shí)*注意：接種后用振蕩器振蕩混勻試管中的液體。5.6滴定：從恒溫箱中取出后，將試管中培養(yǎng)液倒入50ml三角瓶中，用5ml0.004%漠麝香草酚藍(lán)分二次淋洗試管，洗液倒入該三角瓶中，以 0.1mol/L氫氧化鈉溶液滴定，呈綠色即為終點(diǎn)，止匕時(shí) PH約6.8 ,繪制 尼克酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用測定管得到的值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到測定管內(nèi)所含尼克酸的量。*水解液的PH值調(diào)至6.8是為了不同的試劑加入基本培養(yǎng)基時(shí)，不致改變基本培養(yǎng)基的PH值。(此乳酸菌生長的適宜PH值為6.8 ) 6.計(jì)算以尼克酸標(biāo)準(zhǔn)系列的不同微克數(shù)為橫坐標(biāo)，滴定所需0.1mol

14、/L氫氧化鈉 毫升數(shù)為縱坐標(biāo)，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。X= (CX V/m)XFX ( 100/1000 )X-樣品中尼克酸的含量，mg/100g;C-每毫升樣品中尼克酸含量的平均值，ug/ml ;V-樣品水解液定容總體積，ml;F-樣品試液的稀釋倍數(shù)；m-試樣質(zhì)量，g;100/1000-折算成每100g樣品中尼克酸含量，mg=.舉例取一螺旋藻樣品1.004g (m),處理后定容為100ml (V),從中取1ml稀釋至25ml (F),取1, 2, 3, 4ml 入試管中，加入水和培養(yǎng)基，高壓消毒，培養(yǎng)，滴定，測量根據(jù)曲線分別得出四管C值為0.037 , 0.073 ,0.110, 0.136,所以四管

15、平均值為 C= (0.037+0.073/2+0.110/3+0.136/4) /4=0.036 。代入方程式為：X= (CX V/m)XFX ( 100/1000 ) =(0.036X100/1.004 ) X 25X (100/1000 ) =8.96 (mg/100g)因此得出每100克螺旋藻中含8.96毫克尼克酸。.注意事項(xiàng)(1)當(dāng)管中尼克酸的量少于 0.05或多于0.3ug,即超過標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍時(shí)所得到的數(shù)值不能用于計(jì)算。3mol/L鹽酸的配制方法：取 250ml濃鹽酸，加入750ml蒸儲水，共配成1L 3mol/L的鹽酸(3)試管應(yīng)先用洗衣粉清洗后，用水沖凈，再放入酸缸中浸泡1天左右

16、，撈出后再用自來水和蒸儲水清洗干凈，涼干，方可再用。士尼克酸(維生素PP,又稱煙酸)的測定方法(5)二、比色法.原理煙酸和煙酰胺于Ph=4.5下用稀NH40Hl取，再與CNBr溶液與10%對氨基苯磺酸反應(yīng)，測其比色值。.適用范圍選自A0AC適用范圍：適用于藥物、食物和飼料.儀器設(shè)備容量瓶，100ml錐形并250ml(3)電熱板高壓釜(121 C, 30min)(5)離心管，5ml(6)漏斗(7)通風(fēng)櫥(8)酸式滴定管比色計(jì)(藥物 430-450nm,谷物470nm).試齊I所用試劑皆為分析純；所用水皆為蒸儲水尼克酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(1)尼克酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液(100Mg/ml):將50mgUSp道參比標(biāo)準(zhǔn)(

17、貯于P2O5干燥器中，放于暗處保存。)(2)標(biāo)準(zhǔn)中間液I (10Rg/ml):取少量貯備液放置至室溫。用蒸儲水將10.0ml貯備液稀釋至100ml(3)標(biāo)準(zhǔn)工作液 n (4rg/ml):將恢復(fù)至室溫的貯備液 2.0ml用蒸儲水稀釋至50ml。其它試劑稀氫氧化鏤溶液：5mlNH40Hl H2所釋至250ml稀鹽酸：V+V=1+5磷酸緩沖液(pH= 8):將60gNa2HPO47H20和10gKH2PO始于蒸儲水中并稀釋至 200ml。(4)漠化氫溶液(10%,通風(fēng)櫥中制備)：將370ml H20溫?zé)嶂?0C,并加入40gCNBr。振蕩至溶解冷卻 并稀釋至400ml o溶液在冰箱保存。*CNBr劇

18、毒，切勿與皮膚接觸，必須在通風(fēng)櫥中操作。(5) 10%對氨基苯磺酸溶液：按每次 1ml將NH40Hm到20g對氨基苯磺酸和170ml蒸儲水的混合液中， 直至酸溶解為止。用鹽酸與蒸儲水溶液(1: 1)調(diào)節(jié)pH至4.5 ,采用漠甲酚綠指示劑指示。稀釋至200ml。*注：因?yàn)槿芤河蓄伾珪绊懽詈蠼Y(jié)果，所以稀釋結(jié)束后溶液應(yīng)幾乎無色55%對氯基苯磺酸溶液：在 55g對氨基苯磺酸中加入 27ml蒸儲水和27mlNH40H振搖至溶解。(必要 時(shí)加溫)。用NH4O戡5NHCl調(diào)pH為7,再用蒸儲水稀釋至 100ml。(保存在暗處)(待續(xù))尼克酸(維生素PP,又稱煙酸)白測定方法(6)5.操作步驟樣品制備(1)

19、藥物：將藥品研碎，溶于蒸儲水中，稀釋定容。取10mL樣品于錐形瓶中，加入 10mLHCl在電熱板上加熱蒸發(fā)至約2mL冷卻，加入25-50mL蒸儲水，用40%NaO或KOH容液調(diào)節(jié)pH值至2.5-4.5 。過濾， 棄去10mL處液，轉(zhuǎn)移至容量瓶中定容，使溶液含尼克酸約4 V g/mU*注：溶液的尼克酸含量應(yīng)在 50-200 g g/mL(2)非谷類食品及飼料：稱取約 28g樣品，加入0.5mol/L H2SO4200mL ,混勻，在高壓釜中121c加熱半個(gè)小時(shí)。冷卻，用10mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH值至4.5,以漠甲酚綠作外指示劑，用蒸儲水稀釋至250mL過濾。取17g (NH4 2SO4于50

20、mL容量瓶中，吸取40mL樣品液，用H2所釋定容，強(qiáng)力振搖。過濾，混勻， 取1mL作比色測定用。如果樣品中尼克酸含量為16mg/1b。最終液濃度3.2 gg/mU移取40mL標(biāo)準(zhǔn)工作液 n至盛有17g (NH4 2SO4的50mL容量瓶中，用蒸儲水稀釋定容，此液含尼克酸3.2 ii g/mL。*注：加入H2SO4主要是為了去除樣品中的蛋白及其它雜質(zhì)，以防其對測量結(jié)果造成影響(3)谷類產(chǎn)品：隨同樣品做 1試劑空白和5個(gè)濃度的工作標(biāo)準(zhǔn)液。分別將1.5gCa (OH 2放入7個(gè)錐形瓶中，移入 0、5、10、15、20、25mL標(biāo)準(zhǔn)中間液I和2.5g樣品(含 100Mg煙酸)，加入蒸儲水至90mL振搖

21、混勻。高壓121c下2小時(shí)。趁熱混勻，冷卻至 40 C,轉(zhuǎn)移至1 00mL容量瓶中，稀釋定容。從容量瓶移50mL上清液至離心管中，冰浴 15min或置于冰箱中學(xué)2 小時(shí)。離心15min ,吸取20mL上清液 至盛有8g (NH4 2SO4和2mL磷酸鹽緩沖液的離心管中。振蕩溶解并溫?zé)嶂?5-60 C。離心5min ,過濾。操作程序(1)藥物制劑和非谷類食物和飼料：假如10%勺對氨基苯磺酸溶液，CNBr溶液，在通風(fēng)櫥中用酸式滴定管滴入，用標(biāo)準(zhǔn)工作液 n,如下表制備各管：試劑標(biāo)準(zhǔn)空白樣品空白標(biāo)準(zhǔn)溶液(mD 1.0 1.0H20 (mD 5.0 5.0稀 NH4OH(mD 0.5 0.510%寸氨基

22、苯磺酸 2.0 2.0稀 HCl (mD 0.5 0.5樣品溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液(mD 1.0 1.0稀 NH40H(mD 0.5 0.5CNBr(mD 5.0 5.010%寸氨基苯磺酸(mD 2.0 2.0H20 (mD 0.5 0.5*注：CNBr有毒，注意通風(fēng)每只樣品都要分別制備樣品空白。待續(xù)尼克酸(維生素PP,又稱煙酸)的測定方法(7)將標(biāo)準(zhǔn)和樣品移入試管中，分別加入5mL蒸儲水作為標(biāo)準(zhǔn)空白和樣品空白。轉(zhuǎn)動(dòng)試管內(nèi)的液體，立即加入稀NH4OH轉(zhuǎn)動(dòng)，加對氨基苯磺酸，再次旋轉(zhuǎn)混合。立即加入0.5mL稀HCl,混勻，置于光電比色計(jì)上，加入對氨基苯磺酸后約 30s內(nèi)在430和450nm波長之間任意波長調(diào)

23、節(jié)儀器至 0的A值。從加入稀NH4OHF 始按標(biāo)準(zhǔn)空白同樣的方法處理標(biāo)準(zhǔn)溶液。立即轉(zhuǎn)動(dòng)管子，加CNBr溶液并再次轉(zhuǎn)動(dòng)混勻，在加入 CNBr溶液后30s后轉(zhuǎn)動(dòng)管子，加入對氨基苯磺酸溶液，再轉(zhuǎn)動(dòng)。立即加入0.5mL蒸儲水，混勻，加塞。，測量。(加入對氨基苯磺酸溶液后 1.5min時(shí)顏色最深，保留2min ,然后慢慢褪色。)將樣品空白設(shè)在0A,測樣品溶液的 A值。若標(biāo)準(zhǔn)和樣品液含量大致相等，則尼克酸含量與A值成正比。(2)谷類制品：取5只試管，其中兩只加入 5mL標(biāo)準(zhǔn)液，兩只加入 5mL樣品液，另一只加入 5mL蒸儲水做試劑空白。于一只空白管，一只標(biāo)準(zhǔn)管和一只樣品管各加10mL蒸儲水，將所有管置于冰

24、中冰浴 30min。對剩下的管按順序加入 10mL冷的CNBr, 30s后加入1.0mL55%寸氨基苯磺酸溶液。用標(biāo)準(zhǔn)空白在470nm處，調(diào)比色計(jì)為0A,加入對氨基苯磺酸后 12-15min讀出其它各管的 A值。*放入比色計(jì)前，試管必需冷卻一致，每管必需拭干。如管呈霧狀，浸于熱水中片刻，測定前拭干。.計(jì)算將扣除試劑空白的標(biāo)準(zhǔn) A對尼克酸含量vg/ml作圖，畫出適宜的直線，從此圖上求出已扣除樣品空白和 試劑空白后樣品校正的 A所對應(yīng)的濃度CoMg尼克酸/g樣品=C/10ng樣品.注意事項(xiàng)CNBr溶液有毒，要注意安全。(2)樣品不同，處理方法不同，不要混淆。(3)注意通風(fēng)櫥的通風(fēng)。(4)因?yàn)椴捎帽?/p>

25、色法測量，因此樣品含有色素易干擾測定，影響測定結(jié)果的正確性。(5)試管應(yīng)先用洗衣粉清洗后，用水沖凈，再放入酸缸中浸泡1天左右，撈出后再用自來水和蒸儲水清洗干凈，涼干，方可再用。尼克酸(維生素PP,又稱煙酸)的測定方法(8)三、復(fù)合維生素制劑中的煙酰胺測定-一分光光度法.原理在PH約4.5處將煙酰胺抽提到 KH2PO4溶液中，再與CNBr和巴比士酸反應(yīng)。用分光光度法測定反應(yīng)產(chǎn) 物。煙酸含量超過煙酰胺三倍量時(shí)干擾煙酰胺測定。.適用范圍選自AOAC ;適用于復(fù)合維生素制劑檢測.儀器(1)攪拌器(2)量筒(3)錐形瓶(4)高壓釜(121 C, 15min)分光光度計(jì)(550nm).試劑所用試劑皆為分析純；所用水皆為蒸儲水.煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液：(1)標(biāo)準(zhǔn)儲備液(250Vg/mL) : 50mgUSP煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)力口 60%乙醇溶解并稀釋到 200mL。在10c貯存。(2)標(biāo)準(zhǔn)工作液(5Vg/mL):將少量貯備液溫?zé)嶂潦覝亍Ｈ〕?2mL用0.3%KH2PO4溶液稀釋至100mL o其它試劑(1)漠化氧溶