RNAi的制備和方法講課稿

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。RNAi的制備和方法近年來(lái)的研究表明，將與mRNA對(duì)應(yīng)的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞，可以使mRNA發(fā)生特異性的降解，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默。這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)被稱為RNA干擾（RNAi）。一、RNAi的分子機(jī)制通過(guò)生化和遺傳學(xué)研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應(yīng)階段(inititationandeffectorsteps)。在起始階段，加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長(zhǎng)的小分子

2、干擾RNA片段(smallinterferingRNAs,siRNAs)。證據(jù)表明；一個(gè)稱為Dicer的酶，是RNaseIII家族中特異識(shí)別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由HYPERLINK/Article/Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=%D7%AA%BB%F9%D2%F2&Submit=+%CB%D1%CB%F7+轉(zhuǎn)基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個(gè)片段的3端都有2個(gè)堿基突出。在RNAi效應(yīng)階段，siRNA雙鏈結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物從而

3、形成所謂RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC）。激活RISC需要一個(gè)ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過(guò)程。激活的RISC通過(guò)堿基配對(duì)定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA3端12個(gè)堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機(jī)制尚不明了，但每個(gè)RISC都包含一個(gè)siRNA和一個(gè)不同于Dicer的RNA酶。另外，還有研究證明含有啟動(dòng)子區(qū)的dsRNA在植物體內(nèi)同樣被切割成21-23nt長(zhǎng)的片段,這種dsRNA可使內(nèi)源相應(yīng)的DNA序列甲基化,從而使啟動(dòng)子失去功能,使其下游基因沉默.二、如何進(jìn)行RNAi試驗(yàn)(一)siRNA的設(shè)計(jì)1.在設(shè)計(jì)RNAi實(shí)

4、驗(yàn)時(shí)，可以先在以下網(wǎng)站進(jìn)行目標(biāo)序列的篩選：HYPERLINK/business/products/order2.htm/business/products/order2.htmHYPERLINK/techlib/misc/siRNA_finder.html/techlib/misc/siRNA_finder.htmlHYPERLINK/Stu/shilin/rnai.html/Stu/shilin/rnai.htmlHYPERLINK/rnadesign/default.aspx?SID=45358710/rnadesign/default.aspx?SID=453587102.RNAi目標(biāo)序

5、列的選取原則：(1)從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開(kāi)始，尋找“AA”二連序列，并記下其3端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示GC含量在45%55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議在設(shè)計(jì)siRNA時(shí)不要針對(duì)5和3端的非編碼區(qū)（untranslatedregions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。(2)將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同

6、源的序列。例如使用BLAST（/BLAST/）(3)選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。3.陰性對(duì)照一個(gè)完整的siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有陰性對(duì)照，作為陰性對(duì)照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒(méi)有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和目的靶細(xì)胞中其他基因沒(méi)有同源性。4.目前已證實(shí)的siRNA可以在下面的網(wǎng)頁(yè)找到：HYPERLINK/catalog/category.aspx?key=49/catalog/category.aspx?key=49HYPERLINK/

7、techlib/tb/tb_502.html/techlib/tb/tb_502.htmlHYPERLINK/mmcmanus/www/siRNADB.html/mmcmanus/www/siRNADB.htmlHYPERLINK/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published(二)siRNA的制備目前為止較為常用的方法有通過(guò)化學(xué)合成，體外轉(zhuǎn)錄，長(zhǎng)片斷dsRNAs經(jīng)RNaseIII類降解(e.g.Dicer,E.coli,RNase

8、III)體外制備siRNA，以及通過(guò)siRNA表達(dá)載體或者病毒載體，PCR制備的siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生siRNA。體外制備1.化學(xué)合成許多國(guó)外公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA。主要的缺點(diǎn)包括價(jià)格高，定制周期長(zhǎng)，特別是有特殊需求的。由于價(jià)格比其他方法高，為一個(gè)基因合成34對(duì)siRNAs的成本就更高了，比較常見(jiàn)的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進(jìn)行化學(xué)合成。最適用于：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進(jìn)行研究不適用于：篩選siRNA等長(zhǎng)時(shí)間的研究，主要原因是價(jià)格因素2.體外轉(zhuǎn)錄以DNAOligo為模版，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成siRNAs，成本相對(duì)化學(xué)

9、合成法而言比較低，而且能夠比化學(xué)合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實(shí)驗(yàn)的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs，但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學(xué)合成相比，還是需要占用研究人員相當(dāng)?shù)臅r(shí)間。值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs毒性小，穩(wěn)定性好，效率高，只需要化學(xué)合成的siRNA量的1/10就可以達(dá)到化學(xué)合成siRNA所能達(dá)到的效果，從而使轉(zhuǎn)染效率更高。最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學(xué)合成的價(jià)格成為障礙時(shí)。不適用于：實(shí)驗(yàn)需要大量的，一個(gè)特定的siRNA。長(zhǎng)期研究。3.用RNaseIII消化長(zhǎng)片斷雙鏈RNA制備siRN

10、A其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設(shè)計(jì)和檢驗(yàn)多個(gè)siRNA序列以便找到一個(gè)有效的siRNA。而用這種方法制備一份混合有各種siRNAs“混合雞尾酒”就可以避免這個(gè)缺陷。選擇通常是2001000堿基的靶mRNA模版，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長(zhǎng)片斷雙鏈dsRNA，然后用RNaseIII(orDicer)在體外消化，得到一種siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒(méi)有被消化的dsRNA后，這個(gè)siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，方法和單一的siRNA轉(zhuǎn)染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。dsRNA消化法的主要優(yōu)點(diǎn)在于可以跳過(guò)檢測(cè)和篩選有效siRNA序列

11、的步驟，為研究人員節(jié)省時(shí)間和金錢（注意：通常用RNAseIII通常比用Dicer要便宜）。不過(guò)這種方法的缺點(diǎn)也很明顯，就是有可能引發(fā)非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關(guān)的基因?，F(xiàn)在多數(shù)的研究顯示這種情況通常不會(huì)造成影響。最適用于：快速而經(jīng)濟(jì)地研究某個(gè)基因功能缺失的表型不適用于：長(zhǎng)時(shí)間的研究項(xiàng)目，或者是需要一個(gè)特定的siRNA進(jìn)行研究，特別是基因治療體內(nèi)表達(dá)前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs，并且需要專門的RNA轉(zhuǎn)染試劑將siRNAs轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)。而采用siRNA表達(dá)載體和基于PCR的表達(dá)框架則屬于：從轉(zhuǎn)染到細(xì)胞的DNA模版中在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到siRNAs。這兩種方法的優(yōu)點(diǎn)在于不需要直接

12、操作RNA。4.siRNA表達(dá)載體多數(shù)的siRNA表達(dá)載體依賴三種RNA聚合酶III啟動(dòng)子(polIII)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾RNA(shorthairpinRNA,shRNA)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。這三類啟動(dòng)子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動(dòng)子和人H1啟動(dòng)子。之所以采用RNApolIII啟動(dòng)子是由于它可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)更多的小分子RNA，而且它是通過(guò)添加一串（3到6個(gè)）U來(lái)終止轉(zhuǎn)錄的。要使用這類載體，需要訂購(gòu)2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，HYPERLINK/Article/Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=%BF%C

13、B%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+克隆到相應(yīng)載體的polIII啟動(dòng)子下游。由于涉及到HYPERLINK/Article/Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+克隆，這個(gè)過(guò)程需要幾周甚至數(shù)月的時(shí)間，同時(shí)也需要經(jīng)過(guò)測(cè)序以保證HYPERLINK/Article/Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+克隆的序列是正確的。siRNA表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)在于可以進(jìn)行較長(zhǎng)期

14、研究帶有抗生素標(biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。病毒載體也可用于siRNA表達(dá)，其優(yōu)勢(shì)在于可以直接高效率感染細(xì)胞進(jìn)行基因沉默的研究，避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來(lái)的種種不便,而且轉(zhuǎn)染效果更加穩(wěn)定。最適用于：已知一個(gè)有效的siRNA序列，需要維持較長(zhǎng)時(shí)間的基因沉默。不適用于：篩選siRNA序列（其實(shí)主要是指需要多個(gè)HYPERLINK/Article/Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+克隆和測(cè)序等較為費(fèi)時(shí)、繁瑣的工作）。5.siRNA表達(dá)框架siRNA表達(dá)框

15、架(siRNAexpressioncassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達(dá)模版，包括一個(gè)RNApolIII啟動(dòng)子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA，一個(gè)RNApolIII終止位點(diǎn)，能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無(wú)需事前HYPERLINK/Article/Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+克隆到載體中。和siRNA表達(dá)載體不同的是，SECs不需要載體HYPERLINK/Article/Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=%BF%C

16、B%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+克隆、測(cè)序等頗為費(fèi)時(shí)的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時(shí)間。因此，SECs成為篩選siRNA的最有效工具，甚至可以用來(lái)篩選在特定的研究體系中啟動(dòng)子和siRNA的最適搭配。如果在PCR兩端添加酶切位點(diǎn)，那么通過(guò)SECs篩選出的最有效的siRNA后，可以直接HYPERLINK/Article/Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+克隆到載體中構(gòu)建siRNA表達(dá)載體。構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達(dá)siRNA和長(zhǎng)效抑制的研究。這個(gè)方

17、法的主要缺點(diǎn)是PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中（晶賽公司的Protocol可以解決這一問(wèn)題）不能進(jìn)行序列測(cè)定，PCR和DNA合成時(shí)可能差生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致結(jié)果不理想。最適用于：篩選siRNA序列，在HYPERLINK/Article/Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+克隆到載體前篩選最佳啟動(dòng)子不適用于：長(zhǎng)期抑制研究。（如果HYPERLINK/Article/Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB

18、%D1%CB%F7+克隆到載體后就可以了）(三)siRNA的轉(zhuǎn)染將制備好的siRNA，siRNA表達(dá)載體或表達(dá)框架轉(zhuǎn)導(dǎo)至真核細(xì)胞中的方法主要有以下幾種：1.磷酸鈣共沉淀將氯化鈣，RNA(或DNA)和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜并通過(guò)胞飲進(jìn)入目的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。沉淀物的大小和質(zhì)量對(duì)于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。在實(shí)驗(yàn)中使用的每種試劑都必須小心校準(zhǔn)，保證質(zhì)量，因?yàn)樯踔疗x最優(yōu)條件十分之一個(gè)pH都會(huì)導(dǎo)致磷酸鈣轉(zhuǎn)染的失敗。2.電穿孔法電穿孔通過(guò)將細(xì)胞暴露在短暫的高場(chǎng)強(qiáng)電脈沖中轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。將細(xì)胞懸浮液置于電場(chǎng)中會(huì)誘導(dǎo)沿細(xì)胞膜的電壓差異，據(jù)認(rèn)為這種

19、電壓差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜暫時(shí)穿孔。電脈沖和場(chǎng)強(qiáng)的優(yōu)化對(duì)于成功的轉(zhuǎn)染非常重要，因?yàn)檫^(guò)高的場(chǎng)強(qiáng)和過(guò)長(zhǎng)的電脈沖時(shí)間會(huì)不可逆地傷害細(xì)胞膜而裂解細(xì)胞。一般，成功的電穿孔過(guò)程都伴隨高水平（50%或更高）的毒性。3.DEAE-葡聚糖和polybrene帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體復(fù)合物和帶負(fù)電的DNA分子使得DNA可以結(jié)合在細(xì)胞表面。通過(guò)使用DMSO或甘油獲得的滲透休克將DNA復(fù)合體導(dǎo)入。兩種試劑都已成功用于轉(zhuǎn)染。DEAE-葡聚糖僅限于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。4.機(jī)械法轉(zhuǎn)染技術(shù)也包括使用機(jī)械的方法，比如顯微注射和基因槍（biolisticparticle）。顯微注射使用一根細(xì)針頭將DNA，RNA或蛋白直

20、接轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核?；驑屖褂酶邏簃icroprojectile將大分子導(dǎo)入細(xì)胞。5.陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑在優(yōu)化條件下將陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑加入水中時(shí)，其可以形成微小的（平均大小約100-400nm）單層脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)體帶正電，可以靠靜電作用結(jié)合到DNA的磷酸骨架上以及帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面。因此使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理與以前利用中性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理不同。使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑，DNA并沒(méi)有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物。據(jù)稱，一個(gè)約5kb的質(zhì)粒會(huì)結(jié)合2-4個(gè)脂質(zhì)體。被俘獲的DNA就會(huì)被導(dǎo)入培養(yǎng)的細(xì)胞?，F(xiàn)存對(duì)DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)原理的證據(jù)來(lái)源于內(nèi)

21、吞體和溶酶體。為了達(dá)到高的轉(zhuǎn)染效率，在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，需要注意以下幾點(diǎn)：1.純化siRNA在轉(zhuǎn)染前要確認(rèn)siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結(jié)合，洗脫或通過(guò)15-20%丙烯酰胺膠除去反應(yīng)中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學(xué)合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。2.避免RNA酶污染微量的RNA酶將導(dǎo)致siRNA實(shí)驗(yàn)失敗。由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)，所有徒手接觸過(guò)的物品或暴露在空氣中的物品等，此保證實(shí)驗(yàn)每個(gè)步驟不受RNA酶污染非常重要。3.健康的細(xì)胞培養(yǎng)物和嚴(yán)格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性通常，健康的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高。此外，

22、較低的傳代數(shù)能確保每次實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞的穩(wěn)定性。為了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，推薦用50代以下的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率會(huì)隨時(shí)間明顯下降。4.避免使用抗生素Ambion公司推薦從細(xì)胞種植到轉(zhuǎn)染后72小時(shí)期間避免使用抗生素?？股貢?huì)在穿透的細(xì)胞中積累毒素。有些細(xì)胞和轉(zhuǎn)染試劑在siRNA轉(zhuǎn)染時(shí)需要無(wú)血清的條件。這種情況下，可同時(shí)用正常培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)基做對(duì)比實(shí)驗(yàn)，以得到最佳轉(zhuǎn)染效果。5.選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑針對(duì)siRNA制備方法以及靶細(xì)胞類型的不同，選擇好的轉(zhuǎn)染試劑和優(yōu)化的操作對(duì)siRNA實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。6.通過(guò)合適的陽(yáng)性對(duì)照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測(cè)條件對(duì)大多數(shù)細(xì)胞，看家基因是較好的陽(yáng)性對(duì)照。將不同濃度的陽(yáng)性對(duì)照的siR

23、NA轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞（同樣適合實(shí)驗(yàn)靶siRNA），轉(zhuǎn)染48小時(shí)后統(tǒng)計(jì)對(duì)照蛋白或mRNA相對(duì)于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的降低水平。過(guò)多的siRNA將導(dǎo)致細(xì)胞毒性以至死亡。7.通過(guò)標(biāo)記siRNA來(lái)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)熒光標(biāo)記的siRNA能用來(lái)分析siRNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。標(biāo)記的siRNA還可用作siRNA胞內(nèi)定位及雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（配合標(biāo)記抗體）來(lái)追蹤轉(zhuǎn)染過(guò)程中導(dǎo)入了siRNA的細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染與靶蛋白表達(dá)的下調(diào)結(jié)合起來(lái)。三、RNAi的應(yīng)用前景1.研究基因功能的新工具已有研究表明RNAi能夠在哺乳動(dòng)物中滅活或降低特異性基因的表達(dá)，制作多種表型，而且抑制基因表達(dá)的時(shí)間可以隨意控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。線蟲(chóng)和果蠅的全部基

24、因組序列已測(cè)試完畢，發(fā)現(xiàn)大量未知功能的新基因，RNAi將大大促進(jìn)對(duì)這些新基因功能的研究。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，這一技術(shù)具有投入少，周期短，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，近來(lái)RNAi成功用于構(gòu)建HYPERLINK/Article/Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=%D7%AA%BB%F9%D2%F2&Submit=+%CB%D1%CB%F7+轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的報(bào)道日益增多，標(biāo)志著RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具。2.研究信號(hào)傳導(dǎo)通路的新途徑聯(lián)合利用傳統(tǒng)的缺失突變技術(shù)和RNAi技術(shù)可以很容易地確定復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中不同基因的上下游關(guān)系，Clemensy等

25、應(yīng)用RNAi研究了果蠅細(xì)胞系中胰島素信息傳導(dǎo)途徑,取得了與已知胰島素信息傳導(dǎo)通路完全一致的結(jié)果,在此基礎(chǔ)上分析了DSH3PX1與DACK之間的關(guān)系,證實(shí)了DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶.RNAi技術(shù)較傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好，克服了轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中重組蛋白特異性聚集和轉(zhuǎn)染效率不高的缺點(diǎn)，因此認(rèn)為RNAi技術(shù)將可能成為研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的新途徑。3.開(kāi)展基因治療的新策略RNAi具有抵抗病毒入侵，抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)，防止自私基因序列過(guò)量增殖等作用，因此可以利用RNAi現(xiàn)象產(chǎn)生抗病毒的植物和動(dòng)物，并可利用不同病毒轉(zhuǎn)錄序列中高度同源區(qū)段相應(yīng)的dsRNA抵抗多種病毒。腫瘤是多個(gè)基因相互作

26、用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果，傳統(tǒng)技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長(zhǎng),而RNAi可以利用同一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性,設(shè)計(jì)針對(duì)這一區(qū)段序列的dsRNA分子，只注射一種dsRNA即可以產(chǎn)生多個(gè)基因同時(shí)剔除的表現(xiàn)，也可以同時(shí)注射多種dsRNA而將多個(gè)序列不相關(guān)的基因同時(shí)剔除。盡管目前RNAi技術(shù)在哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用還處于探索階段，但它在斑馬魚和老鼠等脊椎動(dòng)物中的成功應(yīng)用預(yù)示著RNAi將成為基因治療中重要的組成部分，人工合成的dsRNA寡聚藥物的開(kāi)發(fā)將可能成為極具發(fā)展前途的新興產(chǎn)業(yè)。RNAiGlossaryDicer-Dicerisamemberofthe

27、RNaseIIIfamilyofnucleasesthatspecificallycleavedouble-strandedRNAs.DicerprocesseslongdsRNAintosiRNAof21-23nt.Interferon-Asmallandhighlypotentmoleculethatfunctionsinanautocrineandparacrinemanner,andthatinducescellstoresistviralreplication.ThistermisrelatedtoRNAibecauseinmammalsintroductionofdsRNAlong

28、erthan30ntinducesasequence-nonspecificinterferonresponse.Micro-RNA-Micro-RNAs(miRNA)aresingle-strandedRNAsof22-ntthatareprocessedfrom70-nthairpinRNAprecursorsbyRnaseIIInucleaseDicer.SimilartosiRNAs,miRNAscansilencegeneactivityviadestructionofhomologousmRNAinplantsorblockingitstranslationinplantsanda

29、nimals.Post-TranscriptionalGeneSilencing-Post-transcriptionalgenesilencing(PTGS)isasequence-specificRNAdegradationsystemdesignedtoactasananti-viraldefensemechanism.AformofPTGStriggeredbytransgenicDNA,calledco-suppression,wasinitiallydescribedinplantsandarelatedphenomenon,termedquelling,waslaterobser

30、vedinthefilamentousfungusNeurosporacrassaRibozyme-RibozymesareRNAmoleculesthatactasenzymesintheabsenceofproteins.RNAInterference-RNAInterference(RNAi),atermcoinedbyFireetalin1998,isaphenomenonthatsmalldouble-strandedRNA(referredassmallinterferenceRNAorsiRNA)caninduceefficientsequence-specificsilence

31、ofgeneexpression.RNA-DirectedDNAMethylation-RNA-directedDNAmethylation(RdDM)isanRNAdirectedsilencingmechanismfoundinplants.SimilartoRNAinterference(RNAi),RdDMrequiresadouble-strandRNAthatiscutintoshort21-26-ntfragments.DNAsequenceshomologoustotheseshortRNAsarethenmethylatedandsilenced.RNA-InducedSil

32、encingComplex-RNA-inducedsilencingcomplex(RISC)isansiRNA-directedendonuclease,catalyzingcleavageofasinglephosphodiesterbondontheRNAtarget.RNAiTrigger-RNAitriggersaredouble-strandedRNAscontaining21-23ntsenseandantisensstrandshybridizedtohave2ntoverhangsatboth3ends.SmallInterferingRNA-SmallInterferingRNA(siRNA)is21-23-ntdouble-strandRNA.ItguidesthecleavageanddegradationofitscognateRNA.RNAi原理圖解作者：未知來(lái)源：本站原創(chuàng)點(diǎn)擊：164更新：2005-7-9【HYPERLINK/bio101/RNA/knowwhy/200507/2620.h