免疫分析技術(shù)基本原理

1、 WORD 10/10免疫分析技術(shù)基本原理利用抗原、抗體之間的特異性結(jié)合來測定、分析特定物質(zhì)的方法抗原：可誘導(dǎo)動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì)。按其引起免疫應(yīng)答的能力分半抗原、抗原、超抗原。抗體：由動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生，可特異性結(jié)合某種物質(zhì)的免疫球蛋白。分IgG、 IgM、 IgE、 IgA、 IgD五個亞型。不同亞型針對同一抗原表位的結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)一樣。不同亞型出現(xiàn)的先后順序不同，在血清中的含量不同，在機體中出現(xiàn)的地點不同。 抗原抗體反應(yīng)的特性1可逆性 抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：Ag+AbAgAb抗體的親和力（affinity），可以用平衡常數(shù)K表示：K=A

2、gAbAgAb ,AgAb的解離程度與K值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性2特異性 抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補關(guān)系，具有高度的特異性。 測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。最適比例4敏感性化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平。酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5-10g/ml。免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿。標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/ml水平。例如，HBsAg，其敏感度可達(dá)0.1ng/ml。固相免疫測定的原理基礎(chǔ):抗原或抗

3、體的固相化與抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進行定性或定量分析。雙抗體夾心法原理此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。雙抗原夾心法原理用特異性抗原進行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAg的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。間接法原理間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗

4、抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。競爭法的原理小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。俘獲法原理IgM的檢測常用于傳染病的診斷。用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早期診斷。生物素親合素法：固相支持物；：固相化抗原；：特異性IgG（待檢物）；：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）

5、；：辣根過氧化物酶HRP-酶標(biāo)鏈親和素（Avidin）；：底物與顯色劑；：顯色。陽性/假陽性陽性（positive, P）：在給定的某一判定標(biāo)準(zhǔn)下，某一測量結(jié)果符合存在條件的稱為陽性。例如ELISA實驗中規(guī)定，標(biāo)本的測量結(jié)果大于界值判定為陽性。假陽性：真實結(jié)果不滿足存在的條件，由于某些因素的干擾，導(dǎo)致測量結(jié)果滿足存在條件的稱為假陽性。在表述陽性或者假陽性時，測量方法、測量對象和適用圍一定要具體。例如，我們經(jīng)常說某人HCV陽性，嚴(yán)格的說這是一個不規(guī)的說法。因為可以理解為這么多的意思：此人是丙肝患者；此人HCV抗原陽性；此人HCV抗體陽性（可能是患者也可能不是患者）；此人HCV RNA陽性；等等等

6、等。陰性/假陰性陰性（Negtive,N）：在給定的某一判定標(biāo)準(zhǔn)下，某一結(jié)果不符合存在條件的稱為陽性。假陰性：真實結(jié)果滿足存在的條件，由于某些因素的干擾，導(dǎo)致測量結(jié)果不滿足存在條件的稱為假陰性。在表述陰性和假陰性時，和表述陽性/假陽性一樣，測量方法、測量對象和適用圍一定要具體。樣本/標(biāo)本/臨床標(biāo)本樣本：在統(tǒng)計里, 我們把所要考察對象的全體叫做總體, 其中每一個考察對象叫做個體, 從整體中所抽取的一部分個體叫做總體的一個樣本。樣本是一個統(tǒng)計學(xué)的概念，樣本往往不只包含一個個體。標(biāo)本（Sample, S）：在給定的考察或測量方法中的具體測量對象，往往和統(tǒng)計學(xué)的個體等價。例如在ELISA實驗里，HCG

7、有測血樣的也有測尿樣的，對應(yīng)的血樣或尿樣叫這個測量方法的標(biāo)本。臨床標(biāo)本：在檢驗技術(shù)中，直接從機體采集的，經(jīng)過處理而適用于臨床檢驗的標(biāo)本。例如從人體采集的抗凝血清叫臨床標(biāo)本，而經(jīng)過稀釋或濃縮的標(biāo)本只能稱為稀釋標(biāo)本或濃縮標(biāo)本而不能稱之為臨床標(biāo)本。醫(yī)學(xué)決定水平醫(yī)學(xué)決定水平（Medicinedecidelevel, MDL）：是指不同于參考值的另一些限值，通過觀察測定值是否高于或低于這些限值，可在疾病診斷中起排除或確認(rèn)的作用，或?qū)δ承┘膊∵M行分級或分類，或?qū)︻A(yù)后作出估計，以提示醫(yī)師在臨床上應(yīng)采取何種處理方式，如進一步進行某一方面的檢查，或決定采取某種治療措施等等。隨著檢測技術(shù)的進步，某一檢測指標(biāo)檢測靈

8、敏度的提高，臨床意義的改變，往往能改變某一疾病的醫(yī)學(xué)決定水平。例如某些激素項目的超敏試劑盒能幫助醫(yī)師判定疾病的進程與處理對策。金標(biāo)準(zhǔn)金標(biāo)準(zhǔn)：現(xiàn)有條件下最科學(xué)最準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)。在檢驗學(xué)中指的是某種疾病標(biāo)志物的確證實驗。如菌體培養(yǎng)，組織切片，組織活檢，抗體條帶免疫印跡（WB），核算診斷等等。 ELISA方法往往只檢驗?zāi)撤N疾病眾多表征或標(biāo)志物中最具代表性或最具操作性的一種或幾種，即通常所說的初篩實驗，追求的是靈敏、簡便和快速，而這些表征或標(biāo)志物的檢出不能確證患病與否，所以需要更進一步的確證實驗。對照實驗對照實驗（control experiment ）：一般進行某種試驗以闡明一定因于對一個對象的影響和處

9、理效應(yīng)或其意義時，除了對試驗所要求研究的因子或操作處理外，其他因素都保持一致，并把試驗的結(jié)果進行比較，這種試驗稱為對照試驗。目的是通過對比實驗的結(jié)果找到想要研究的因素對實驗的影響作用，從而為科學(xué)的研究提供事實依據(jù)和直接證據(jù)。對照試驗有對照組和實驗組。有以下常見的類型：1.空白對照：即不作任何實驗處理的對照組。2.自身對照：即實驗與對照在同一對象上進行，不另設(shè)對照組（通常意義上的重復(fù)）。3.條件對照：即給對象施以某種實驗處理，但這種處理不是實驗假設(shè)所給定的實驗變量。例如我們通常在進行配方改進的時候，所改變的條件相對于原來的配方來說就屬于條件按對照?？瞻祝╞lank,BL）空白實驗（blank t

10、est）和空白樣品：空白試驗指對不含待測物質(zhì)的樣品用與實際樣品同樣的操作進行的試驗。對應(yīng)的樣品稱為空白樣品（簡稱：空白）?，F(xiàn)場空白和實驗室空白：現(xiàn)場空白指帶到監(jiān)測現(xiàn)場而模擬現(xiàn)場監(jiān)測過程的空白樣品。實驗室空白指沒有帶到監(jiān)測現(xiàn)場的空白樣品。標(biāo)準(zhǔn)空白、試劑空白和全程空白：標(biāo)準(zhǔn)空白是指配標(biāo)準(zhǔn)溶液（標(biāo)準(zhǔn)系列溶液）時“零”濃度的空白，或不添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的空白。試劑空白是指隨同試樣分析步驟的空白樣品。全程空白即全程試劑空白，是指經(jīng)歷試樣分析全部步驟的空白樣品。本底/非特異結(jié)合本底（background ）：亦稱背景，指某一測量方法中陰性樣本的信號值或計數(shù)值。非特異結(jié)合（nonspecific bind, NS

11、B）：由非待檢物產(chǎn)生的有用檢測信號。表現(xiàn)形式為高本底陰性或陽性。CO值CO值（Cut Off Value, CO）：界值或陽性判定值，指某儀測量方法中用于區(qū)分陽性和陰性的數(shù)值。有兩種判斷方式：一種是大于CO值判為陽性，否則為陰性，常見于ELISA實驗中除競爭抑制法以外的方法，判斷方法較為直觀；另一種是小于CO值判為陽性，否則為陰性，常見于ELISA實驗中的競爭抑制法，判斷方法不直觀，要求測量方法穩(wěn)定且重復(fù)性好。CO值的計算方式：往往以某一常數(shù)加上或乘以一個變量，變量的變動圍較小，常數(shù)反映本底信號，變量反映多次測量之間的差異。例如，我公司HIV試劑盒CO值計算公式：CO=NC+0.1（NC0.0

12、5時按照0.05計算）。CO值的設(shè)定：通常采用數(shù)理統(tǒng)計學(xué)的方法，即測量大量的陰性樣本，測量結(jié)果呈正態(tài)分布，取95%或99%為置信區(qū)，取置信區(qū)上線為CO值。S/CO值或P/N值S/CO值：即樣本值和界值的比值，相當(dāng)于一個半定量的判斷。在ELISA檢驗中，S/CO值的判斷方法比將樣本值和CO值直接比較更具科學(xué)性，在不同廠家試劑對比實驗時往往用S/CO值而不是OD值。做長期動態(tài)的觀察時（例如做質(zhì)控圖），用絕對的OD值做質(zhì)控圖不能準(zhǔn)確的反映實驗環(huán)境給實驗帶來的影響，而S/CO值則能盡量的減小這種影響。P/N值：有兩種說法，一種是標(biāo)本值和陰性對照的比值，是早期采用的定性判斷方法；另一種是患者測量值（陽性

13、值）和正常人測量值（陰性值）的比值。第二個個概念比較有用，它反應(yīng)的是試劑的陰陽反差，即有用信號和背景信號的區(qū)分能力，一定程度上體現(xiàn)了試劑靈敏度的高低。校準(zhǔn)品/標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品：1、國際標(biāo)準(zhǔn)品：由WHO或相應(yīng)組織標(biāo)定的，用肯定的、公認(rèn)的、準(zhǔn)確的物理或化學(xué)方法測定的定值材料。如FDA的標(biāo)準(zhǔn)品。2、國際生物學(xué)活性標(biāo)準(zhǔn)品：根據(jù)生物學(xué)反應(yīng)由WHO或相應(yīng)組織標(biāo)定的國際活性單位的材料。3、參考標(biāo)準(zhǔn)血清：國家標(biāo)準(zhǔn)化組織根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的法定材料。可用于鑒定儀器和鑒定方法準(zhǔn)確性。如HBsAg的國家標(biāo)準(zhǔn)血清盤。校準(zhǔn)品：使測量值具有可比性的對照物質(zhì)。對于測量血清標(biāo)本的檢驗手段來說，最佳的校準(zhǔn)品應(yīng)該是用決定性方法定值的

14、新鮮混合血清。校準(zhǔn)品具有系統(tǒng)專一性，不同系統(tǒng)的校準(zhǔn)品不能混用（例如不同廠家或者不同批次的“標(biāo)準(zhǔn)品”不能替換使用）。我們定量產(chǎn)品常所說的標(biāo)準(zhǔn)品嚴(yán)格以上來說應(yīng)當(dāng)叫校準(zhǔn)品，校準(zhǔn)品往上溯源才是標(biāo)準(zhǔn)品。 ISO17511對控制品有較為詳細(xì)的說明。質(zhì)控品/控品質(zhì)控品（control）：是已有靶值的對照物質(zhì)，在每次的常規(guī)檢驗中加入一份或數(shù)份，通過所得結(jié)果來了解本次檢驗的情況。質(zhì)控品檢驗的結(jié)果如能控制其誤差在一定圍，就說明該檢驗沒有發(fā)生不允許的誤差。如果出現(xiàn)超過允許誤差圍的異常結(jié)果，提示該檢驗不合格，應(yīng)尋找原因，糾正后，重檢待測標(biāo)本。IVD行業(yè)中，通常使用的質(zhì)控品有衛(wèi)生部臨床檢驗中心（NCCL）提供的定值質(zhì)控

15、品。在臨床實驗室中，經(jīng)常使用各省疾控中心（CDC）發(fā)放的定值質(zhì)控品。各臨床實驗室每年還在第三方（通常由各省的相關(guān)領(lǐng)導(dǎo)部門擔(dān)任）的組織下進行室間質(zhì)評，以評價實驗室的總體檢驗水平?？仄罚河蓪嶒炇覅⒄諜?quán)威機構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)品或質(zhì)控品自己標(biāo)定的對照物質(zhì)，用于控制本實驗室的實驗誤差。質(zhì)控品和控品都要保證其溯源性！成品成品：通俗來說就是符合客戶要求和滿足法律法規(guī)要求，可以直接交貨或售賣的產(chǎn)品。比如試組裝完畢、檢驗合格，貼上合格簽的試劑盒。對于國家批批檢的產(chǎn)品，必須還要有國家相關(guān)檢驗機構(gòu)出具的合格檢驗報告，并經(jīng)過相關(guān)機構(gòu)做出合格標(biāo)示的試劑盒才能算成品試劑盒。成品與半成品是公司對生產(chǎn)流程的分類，可是對外，就沒有什么成品

16、和半成品之分了，如果客戶要買你的“半成品”，那么“半成品”也就變成你們的成品了，如果客戶不買你的“成品”，那么你的“成品”則連半成品也不是！所以我們一定要把東西賣出去。半成品/中間品半成品：通俗來說，品質(zhì)要求已達(dá)到客戶要求，但還需要經(jīng)過一道或幾道后序加工程序才能成為成品的產(chǎn)品，通常的后序加工程序指的是組裝。例如：檢驗合格的包被板，分裝并檢驗合格的酶結(jié)合物和標(biāo)準(zhǔn)品等。中間品：半成品生產(chǎn)過程中所處的合格的形態(tài)。例如：包被后檢驗合格的包被板，分裝前檢驗合格的酶結(jié)合物和標(biāo)準(zhǔn)品。無論是成品、半成品還是中間品，必須強調(diào)檢驗合格的概念！質(zhì)量檢驗質(zhì)量檢驗：對產(chǎn)品的一個或多個質(zhì)量特性進行觀察、測量、試驗，并將結(jié)

17、果和規(guī)定的質(zhì)量要求進行比較，以確定每項質(zhì)量特性合格情況的技術(shù)性檢查活動。質(zhì)量檢驗的職能：鑒別、把關(guān)、預(yù)防、報告、監(jiān)督。質(zhì)量檢驗的步驟(1)檢驗的準(zhǔn)備。熟悉規(guī)定要求，選擇檢驗方法，制定檢驗規(guī)。在檢驗的準(zhǔn)備階段，必要時要對檢驗人員進行相關(guān)知識和技能的培訓(xùn)和考核，確認(rèn)能否適應(yīng)檢驗工作的需要。(2)測量或試驗。按已確定的檢驗方法和方案，對產(chǎn)品質(zhì)量特性進行定量或定性的觀察、測量、試驗，得到需要的量值和結(jié)果。測量和試驗前后，檢驗人員要確認(rèn)檢驗儀器設(shè)備和被檢物品試樣狀態(tài)正常，保證測量和試驗數(shù)據(jù)的正確、有效。(3)記錄。對測量的條件、測量得到的量值和觀察得到的技術(shù)狀態(tài)用規(guī)化的格式和要求予以記載或描述，作為客觀

18、的質(zhì)量證據(jù)保存下來。質(zhì)量檢驗記錄是證實產(chǎn)品質(zhì)量的證據(jù)，因此數(shù)據(jù)要客觀、真實，字跡要清晰、整齊，不能隨意涂改，需要更改的要按規(guī)定程序和要求辦理。質(zhì)量檢驗記錄不僅要記錄檢驗數(shù)據(jù)，還要記錄檢驗日期、班次，由檢驗人員簽名，便于質(zhì)量追溯，明確質(zhì)量責(zé)任。(4)比較和判定。由專職人員將檢驗的結(jié)果與規(guī)定要求進行對照比較，確定每一項質(zhì)量特性是否符合規(guī)定要求，從而判定被檢驗的產(chǎn)品是否合格。質(zhì)量控制/質(zhì)量保證質(zhì)量控制（Quaility Control, Q.C）：質(zhì)量控制是監(jiān)視全過程，排除誤差，防止變化，維持標(biāo)準(zhǔn)化現(xiàn)狀的一個管理過程。這一過程是通過一個反饋環(huán)路進行的。1）確定控制的對象；2）規(guī)定控制對象的標(biāo)準(zhǔn)（預(yù)期

19、值）；3）制定或選擇控制方法和手段；3）測量實際數(shù)據(jù)；4）比較或較對實際數(shù)據(jù)與預(yù)期值之間的差異，并說明產(chǎn)生這一差異的原因。超出預(yù)定誤差圍，報警系發(fā)出信號，反饋通道中斷。5）采取行動，解決差異?；謴?fù)原狀（原標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)）的手段發(fā)揮作用。質(zhì)量保證（ quality assurance , Q.A ）：提供質(zhì)量要求會得到滿足的信任的一系列活動。質(zhì)量保證的關(guān)鍵詞是“提供信任”，提供信任的對象對可以是管理者，對外可以是顧客；“提供信任”的方法是需要提供能夠證實質(zhì)量要求會得到滿足的證據(jù)。 對或?qū)ν馓峁┊a(chǎn)品質(zhì)量保證文件、過程監(jiān)控記錄、質(zhì)量手冊或認(rèn)證證書，都可以作為“提供信任”的方法?；|(zhì)效應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)（matri

20、x effect）：基質(zhì)指的是樣品中被分析物以外的組分，基質(zhì)常常對分析物的分析過程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，這些影響和干擾被稱為基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)表現(xiàn)在兩個方面：1.標(biāo)本中除分析物以外的其他成分對分析物測定值的影響。2.基質(zhì)對分析方法準(zhǔn)確測定分析物的能力的干擾。廣義說來，基質(zhì)效應(yīng)也應(yīng)包括已知的干擾物（如Chol測定中膽紅素、血紅蛋白、抗壞血酸等都是干擾物），但目前只將基質(zhì)效應(yīng)限于生物材料中未知或未定性的物質(zhì)或因素（如粘度、pH等）的影響?；|(zhì)偏差（matrix bias）基質(zhì)效應(yīng)所致分析結(jié)果的偏差稱為基質(zhì)偏差。用作校準(zhǔn)物質(zhì)或質(zhì)控物的經(jīng)過處理的混合血清，由于血清基質(zhì)的理化性質(zhì)在處理過

21、程中的改變，在常規(guī)測定上往往出現(xiàn)基質(zhì)偏差。基質(zhì)偏差的出現(xiàn)也與分析系統(tǒng)（包括方法、試劑與所用儀器設(shè)備）有關(guān)，所以有人將基質(zhì)效應(yīng)定性為方法、材料與基質(zhì)的特異性反應(yīng)。國外已有不少文獻(xiàn)指出某些在制備過程中經(jīng)過加工或添加某些成分(如制備的LDL)的參考血清，會在某些分析系統(tǒng)中出現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect)，而使標(biāo)本(新鮮血清)的分析結(jié)果出現(xiàn)明顯偏差。用新鮮血清為參考材料是最理想的，但顯然是不現(xiàn)實的，所以對參考材料的研制又提出了新的難題。Naito等（1993年）提出過減少基質(zhì)效應(yīng)的研究方向，至今仍有參考價值：改進室間質(zhì)評樣品，使其作用更像新鮮人血清。改進儀器設(shè)計與試劑組成。選擇方法與方法學(xué)參

22、數(shù)，使其適應(yīng)性更強，且容易掌握，對制備物（校準(zhǔn)物、室間質(zhì)評樣品與質(zhì)控物）基質(zhì)的確切性質(zhì)不敏感。HOOK效應(yīng)高值鉤鐮效應(yīng)（HD-HOOK） 在二位點夾心ELISA中，其劑量反應(yīng)曲線的高劑（HIGH DOSE，HD）區(qū)段，線性走向不是呈平臺狀無限后延，而是向下彎曲狀，似一只鉤子或一把鐮刀（HOOK），MILES（1974）根據(jù)此現(xiàn)象寫實性地稱之為“HD-HOOK”效應(yīng)。在一步法和兩步法中均有HOOK效應(yīng)一步夾心法HOOK效應(yīng)實際上是一種“濃度效應(yīng)”，待測物中抗原數(shù)量過高所致次要因素：標(biāo)記抗體與被捕捉抗原的交叉重疊結(jié)合而導(dǎo)致抗原變構(gòu)只要靶抗原的正常值與病理值之差大于3個數(shù)量級，均應(yīng)警示由于嚴(yán)重的“H

23、D-HOOK效應(yīng)”而發(fā)生的假陰性，假低值兩步夾心法HOOK效應(yīng)僅發(fā)現(xiàn)于少數(shù)具有多重抗原決定簇的大分子蛋白質(zhì)抗原如：SF、AFP、PSA、HCG等）。隨著雜交瘤單抗的問世，F(xiàn)emando等設(shè)計了一個堪稱現(xiàn)代經(jīng)典的實驗?zāi)Ｊ? 使這一課題的研究取得了突破性進展。所選用的試驗方法是二步IRMA,靶抗原是一個已知其WM為22kDa、 僅有 二個不同抗原簇的人生長因子(hGH)。一個單抗用于包被,另一 個作125I標(biāo)記 作二抗。用此實驗系統(tǒng),測定單體hGH抗原時,沒有發(fā)現(xiàn)“HD-HOOK效應(yīng)”問 題奇怪的是,用同樣實驗系統(tǒng),測定非共價結(jié)合的二聚體(D)-hGH則呈現(xiàn)了 “HD-HOOK效應(yīng)”。據(jù)此實驗結(jié)果

24、,推導(dǎo)出一個新理論:即標(biāo)記二抗介導(dǎo)被捕捉抗原分子發(fā)生分子變構(gòu)(Confromational change),使之形成標(biāo)記二抗與變構(gòu)的抗原分子復(fù)合物, 從固相一抗上解離, 最終產(chǎn)生反應(yīng)信號減低的“HD-HOOK”效應(yīng)。這種“抗原分子變構(gòu)理論”的核心是抗原的“質(zhì)”的問題。理論依據(jù)首先,大分子蛋白質(zhì)抗原的可變構(gòu)性是決定性的因。其中構(gòu)象性決定簇是幾條肽鏈(非連續(xù)性)提供的氨基酸組合而成的,比線性(連續(xù)性)決定簇的穩(wěn)定性差,易發(fā)生變構(gòu)(見圖2)。 其次,蛋白質(zhì)分子非共價結(jié)合鍵,也是發(fā)生分子變構(gòu)的在因素。從現(xiàn)有資料看,僅報道鐵蛋白、AFP、PSA與HCG等,具有多重決定蔟的大分子抗原,在二步法中產(chǎn)生“HD

25、-HOOK效應(yīng)”。小分子抗原則否。表明抗原“質(zhì)”的特性是關(guān)鍵性因素。其次,抗體分子是介導(dǎo)抗原分子變構(gòu)的重要外因。已知Igs分子在遇到相應(yīng)抗原時,為了執(zhí)行其固有的(本質(zhì)性)生物學(xué)功能,其分子的Fab臂可圍繞鉸鏈區(qū),作變角折彎(100)、錐形轉(zhuǎn)動以與最N末端的可變區(qū),依托Fab的恒定區(qū)作微小的“球穴”擺動(見3)。 當(dāng)其與被捕捉抗原分子之間,發(fā)生交差重疊結(jié)合之后,由于“立體效應(yīng)(steric effect)”,加之標(biāo)記二抗的親和力大于一抗等輔助因素,是可以迫使已被捕捉的抗原分子從一抗上解離洗滌出去的。很可能與下列因素有關(guān)：包被-抗體親和力低洗滌不合適酶標(biāo)抗體不足過度孵育其他非特異性反應(yīng)窗口期窗口期

26、（window period）：病毒感染后病毒出現(xiàn)在血液中直到可以檢出足夠多的相應(yīng)病毒標(biāo)志物（抗原或抗體）前的時期。在這段時間，血清中無法檢測出相應(yīng)的抗原抗體標(biāo)志物。各種病毒的窗口期是不一樣的，一般所稱的窗口期指的是檢測到病毒抗體的時間，但抗原以與核酸檢測同樣存在窗口期，但時間大大縮短。H B V、H C V、H I V的窗口期的時間分別為56、70和22天，P24抗原的窗口期平均為15天，而應(yīng)用核酸技術(shù)，可分別將H B V、H C V、H I V的窗口期縮短為41、12、11天。由于檢測技術(shù)的局限，某種檢測結(jié)果為陰性并不意味著就沒有感染，因此定期復(fù)查是非常重要的。相信隨著檢測的病毒標(biāo)志物的不

27、同，檢測技術(shù)的提高，可大大縮短窗口期時間。心理窗口期還有一個很重要的“心理窗口期”。由于醫(yī)學(xué)上還沒有絕對明確的窗口期，有個別朋友甚至2年以后還在檢查，不知道他們還要在恐懼中多久才能找到回家的路！所以，每個人都應(yīng)該在深思熟慮后為自己確定一個明確的心理窗口期，也就是說，過了這個期限還是陰性就可以徹底放心，之后的任務(wù)就是如何恢復(fù)到以前的生理和心理狀態(tài)，回到自己以前的生活中去。潛伏期潛伏期（incubation period）是指病原體侵入機體到最初出現(xiàn)癥狀和體征之間的這段時期。各種疾病的潛伏期長短不一，短者數(shù)小時，長者可達(dá)數(shù)月或數(shù)年。如禽類禽流感的潛伏期從幾小時到數(shù)天，最長可達(dá)21天。人類患上禽流感

28、后，潛伏期一般為7天以。非典型性肺炎的潛伏期一般在410天，臨床報告最短病例為1天，最長有20天，甚至有極個別病例達(dá)到28天。一般認(rèn)為潛伏期長短與感染病毒的種類或者型別、病毒的致病性、病毒的數(shù)量、感染途徑、被感染機體的免疫力以與其他非生理因素等有關(guān)。比如艾滋病病毒，經(jīng)輸血感染的劑量一般較大，所以潛伏期相對較短，而性接觸感染艾滋病病毒的劑量較小，因此潛伏期相對較長。HBV感染后的潛伏期一般為20天至6個月，也有報道28160天，平均7080天；HCV感染后臨床表現(xiàn)一般較輕，常為亞臨床型，但輸血后感染的潛伏期一般為20天至6個月，也有資料報道226周，平均8周；HIV感染后1到2個月可能出現(xiàn)急性的

29、癥狀和體征，隨后進入較長的無癥狀期，持續(xù)615年，平均810年，大量輸血的可縮短至15年。梅毒的潛伏期一般為24周灰區(qū)灰區(qū)：把定量分析的正常值圍引入定性分析建立灰區(qū)概念，即將CO值上下的一段區(qū)域定為陽性可疑，需重復(fù)實驗或換試劑重測以確定其陰陽性，如仍落在灰區(qū)圍則報告+（陽性）。灰區(qū)概念對血站系統(tǒng)的獻(xiàn)血員篩查尤為重要。 灰區(qū)的設(shè)置有二種： 1）C.O（1CV）， CV為該試劑的批CV (一般在15-20%間）； 2）C.O2s，s為實驗室做室質(zhì)控ROC（受試者工作特征曲線）的s。酶免疫吸附實驗（EIA）的性能指標(biāo)（定性產(chǎn)品）靈敏度靈敏度（sensitivity）：某一檢測系統(tǒng)檢出極低被檢物質(zhì)的能

30、力。包括兩層意思：1.檢出被檢物質(zhì)最低量的能力；2.對大量樣品中陽性檢出的能力。檢出被檢物質(zhì)最低量的能力：常用檢出最低量被檢物的含量（即分析靈敏度或最低檢出限）來表示。比如0.1ng, 0.1mIu, 0.1NCU等，意思是在某一檢測方法下，檢測系統(tǒng)能將有用信號和背景信號區(qū)分開來時所對應(yīng)的被檢物的濃度。但這種區(qū)分在目前的條件下是否在臨床上有確切的意義并不能全部的肯定。評價方式：用標(biāo)準(zhǔn)被檢物持續(xù)稀釋，直到能區(qū)分有用信號和背景信號的最大稀釋倍數(shù)。也叫滴度。在ELISA實驗里，常用強陽性混合血清系列稀釋，同時用市場反應(yīng)較好的試劑盒同時進行標(biāo)定，選擇這些試劑盒都能檢出的最大稀釋倍數(shù)的血清作為靈敏度血清

31、，通常會有成系列的幾個血清。在標(biāo)定系列靈敏度血清的時候要非常注意一個問題：要注意基質(zhì)效應(yīng)在不同系統(tǒng)（包括不同廠家的試劑盒、工藝、不同原材料）上對靈敏度血清測量值的影響，在改變系統(tǒng)時，必須重新標(biāo)定靈敏度血清。2.為試劑對人群或大量樣品中陽性檢出的能力（假陰性越少越好），取決于包被物的全面性和親和力。選擇原材料一定要選擇親和力高的原料。有些廠家為追求試劑對大多數(shù)陽性標(biāo)本的靈敏度，只選擇最強的一種或少數(shù)幾種優(yōu)勢表位，而犧牲了在患者人群中較少出現(xiàn)的亞型或者原材料片段，這種做法是非常危險的，是對目標(biāo)人群的不負(fù)責(zé)任。特異性特異性：指試劑正確檢定不存在的被檢物質(zhì)的能力（無假陽性），取決于包被抗原（體）與標(biāo)記抗原（體）的純度與特異性，生產(chǎn)工藝對試劑的特異性也有較大影響?？赡苡绊懺噭┖刑禺愋缘囊恍┮蛩夭僮饕蛩兀航徊嫖廴?、洗滌不徹底。試劑盒工藝：試劑盒在生產(chǎn)的時候被污染了。交叉：相似于被檢物的物質(zhì)交叉反應(yīng)，主要由生物原材料不純造成。標(biāo)本因素：高度溶血、脂血標(biāo)本。血清標(biāo)本處理：抗凝劑、反復(fù)凍融。其它存在于血清中的物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，如膽紅素、膽固醇、甘油三酯等。準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度（a