HLA分型技術(shù)回顧上課講義

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。HLA分型技術(shù)回顧-HLA分型技術(shù)回顧（1）主要組織相容性復(fù)合物（MHC）是脊椎動(dòng)物體內(nèi)最復(fù)雜且具有高度多態(tài)性的基因群。1984年GeorgeSnell首次發(fā)現(xiàn)小鼠MHC即H2，1958年Dausset發(fā)現(xiàn)了人的MHC即HLA基因。MHC的表達(dá)產(chǎn)物稱為主要組織相容性抗原，MHC抗原是有核細(xì)胞表面膜蛋白分子，對(duì)抗原遞呈和免疫信號(hào)傳遞起關(guān)鍵作用。HLA基因，位于6號(hào)染色體上短臂上，長(zhǎng)約4000Kb。HLA是目前所知人體最復(fù)雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)，有幾十個(gè)基因座位，每個(gè)基因座位又有幾十個(gè)等位基因，且呈共顯性表達(dá)。

2、由于MHC基因位于同一條染色體上，其多基因座位上的基因型組合相對(duì)穩(wěn)定，很少發(fā)生同源染色體間交換，這就構(gòu)成了以單元型（HAPLOTYPE，即在同一條染色體上緊密連鎖的一系列等位基因的特殊組合）為特征的遺傳。按中國(guó)人常見(jiàn)的A座位基因有13個(gè)，B座位基因有30個(gè)計(jì)算，可組成的單元型約有1330390種之多。理論上估計(jì)，父母各給一串單元型給子女，便會(huì)形成4.3萬(wàn)種HLAAB血型。事實(shí)上，HLA各基因并非完全隨機(jī)地組成單元型，而是呈現(xiàn)出連鎖不平衡（linkagedisequilibrium,LD）的特點(diǎn)。理論推測(cè)的HLA分型數(shù)量巨大，但對(duì)一個(gè)具體的民族來(lái)說(shuō)并非如此。世界上各個(gè)民族人群的HLA多態(tài)性和單元

3、型都有各自的特點(diǎn)。總體來(lái)講，中國(guó)北方漢族、北美白人和北美黑人人群的多態(tài)性較中國(guó)南方漢族和日本人群豐富。即使在中國(guó)，地區(qū)間也存在差異。在中國(guó)漢族群體中抗原A1、A3、B13、B44和B51頻率呈北高南低分布，而抗原A24、B46、B60呈北低南高分布。在中國(guó)漢族群體中常見(jiàn)的A30-B13-DRB1*07，A1-B37-DRB1*10單體型頻率呈北高南低分布，在江浙滬漢族人群中頻率較北方漢族人群下降，而A2-B46-DRB1*09，A33-B58-DRB1*17，A33-B58-DRB1*13單體型頻率呈北低南高分布。HLA多態(tài)性程度可見(jiàn)一斑。HLA研究涉及免疫學(xué)、生物學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)

4、等多個(gè)學(xué)科，并已發(fā)展成為一個(gè)獨(dú)立的學(xué)科分支。迄今HLA研究已達(dá)到相當(dāng)深入的水平，并在諸多方面取得顯著進(jìn)展，包括HLA復(fù)合體結(jié)構(gòu)；HLA分子結(jié)構(gòu)及其表達(dá)的調(diào)控；HLA分子功能，尤其是在抗原處理、呈遞及T細(xì)胞識(shí)別中的作用；HLA的DNA分型及多態(tài)性研究；HLA與疾病的關(guān)系；HLA與移植的關(guān)系等。HLA研究不僅使器官移植成為一種極有價(jià)值的治療手段，并給基礎(chǔ)與臨床免疫帶來(lái)了突破性進(jìn)展。已經(jīng)證實(shí)，HLA復(fù)合體中存在控制免疫應(yīng)答的基因以及HLA參與約束免疫細(xì)胞間相互作用，這表示HLA涉及生命活動(dòng)的各個(gè)水平與多個(gè)方面?？梢灶A(yù)期，對(duì)HLA的研究將繼續(xù)成為免疫遺傳學(xué)最活躍的部分；對(duì)HLA的應(yīng)用將擴(kuò)展到基礎(chǔ)、臨床

5、、預(yù)防醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。縱觀HLA系統(tǒng)的研究過(guò)程，其發(fā)展無(wú)不與技術(shù)的手段的突破與運(yùn)用有密切關(guān)系。70年代到80年代末期主要是血清學(xué)研究；90年代以來(lái)，HLA進(jìn)入了分子水平研究階段，進(jìn)展尤為顯著。HLA分型技術(shù)同樣走過(guò)了這一歷程。建立于60年代并不斷完善的血清學(xué)及細(xì)胞學(xué)分型技術(shù)主要側(cè)重于分析HLA產(chǎn)物特異性。血清學(xué)分型借助的是微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)（microlymphocytotoxicitytest）或稱補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒試驗(yàn)（complementdependentcytotoxicitytest，CDC）。取已知HLA抗血清加入待測(cè)外周血淋巴細(xì)胞，作用后加入兔補(bǔ)體，充分作用后加入染料，著染的細(xì)胞為

6、死亡細(xì)胞，依據(jù)特異性抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體系統(tǒng)對(duì)靶細(xì)胞溶解的原理，待檢淋巴細(xì)胞表面具有已知抗血清所針對(duì)的抗原。血清學(xué)分型存在諸多缺點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)分型抗體親和力較弱、效價(jià)較低、易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，缺少某些單價(jià)抗血清；某些病理過(guò)程可能導(dǎo)致外周血淋巴細(xì)胞表面抗原性質(zhì)發(fā)生改變干擾抗原抗體反應(yīng)；國(guó)內(nèi)供HLAI類抗原分型的血清板來(lái)源困難、質(zhì)量欠佳。上述因素均嚴(yán)重影響了HLA分型結(jié)果的可靠性及該技術(shù)的推廣應(yīng)用。細(xì)胞學(xué)分型技術(shù)指的是通過(guò)純合分型細(xì)胞（homozygotetypingcell,HTC）及預(yù)致敏淋巴細(xì)胞試驗(yàn)（primedlymphocytetest,PLT）對(duì)HLA分型。二種方法的基本原理均是判斷淋巴細(xì)胞在識(shí)別非己

7、HLA抗原決定簇后發(fā)生的增殖反應(yīng)。由于分型細(xì)胞來(lái)源困難以及操作手續(xù)繁瑣，細(xì)胞學(xué)分型技術(shù)下正逐漸淘汰。1991年第11屆國(guó)際HLA專題討論上提出了HLA的DNA分型方法，這類方法近年來(lái)在研究和應(yīng)用方面發(fā)展非?？欤腥〈渌椒ǖ内厔?shì)。DNA分型方法主要分為兩種：基于核酸序列識(shí)別的方法和基于序列分子構(gòu)型的方法。下面簡(jiǎn)要的闡述各方法的原理和優(yōu)缺點(diǎn)。基于核酸序列識(shí)別的方法主要有：PCR-RFLP，PCR-SSO，PCR-SSP和PCR-SBT。PCR-RFLP：CAPs(cleavedamplificationpolymorphismsequence-taggedsites)CAPs技術(shù)又稱為PCR-

8、RFLP，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）技術(shù)。其原理是將目的基因片段PCR擴(kuò)增后，利用多種限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，不同的基因序列會(huì)產(chǎn)生不同的酶切產(chǎn)物，從而產(chǎn)生不同的電泳圖譜。它以其簡(jiǎn)單、敏感、準(zhǔn)確，無(wú)需同位素等優(yōu)點(diǎn)成為目前較常用的HLA基因分型技術(shù)之一，但是無(wú)法分辨雜合子，且只能區(qū)分有限的多態(tài)性。PCR-RFLP的基本原理是用PCR擴(kuò)增目的DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物再用特異性內(nèi)切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位點(diǎn)分布不同，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的DNA片段條帶。此項(xiàng)技術(shù)大大提高了目的DNA的含量和相對(duì)特異性，而且方法簡(jiǎn)便，分型時(shí)間短?；玖鞒?/p>

9、1.根據(jù)基因名稱查詢序列，設(shè)計(jì)引物。2.提取基因組DNA。3.PCR擴(kuò)增。4.產(chǎn)物酶切，凝膠電泳。PCR-SSO（sequencespecificoligonucleotide）：也稱順序特異寡核苷酸法原理是PCR基因片段擴(kuò)增后利用序列HYPERLINK/view/552529.htmt_blank特異性HYPERLINK/view/62497.htmt_blank寡核苷酸探針，通過(guò)HYPERLINK/view/107223.htmt_blank雜交的方法進(jìn)行擴(kuò)增片段的分析鑒定。探針與PCR產(chǎn)物在一定條件下雜交具有高度的特異性，嚴(yán)格遵循堿基互補(bǔ)的原則。探針可用放射性同位素標(biāo)記，通過(guò)HYPERL

10、INK/view/963570.htmt_blank放射自顯影的方法檢測(cè)，也可以用HYPERLINK/view/3853529.htmt_blank非放射性標(biāo)記如地高辛、生物素、HYPERLINK/view/1312174.htmt_blank過(guò)氧化物酶等進(jìn)行相應(yīng)的HYPERLINK/view/1494103.htmt_blank標(biāo)記物檢測(cè)。用以同位素或非放射性標(biāo)記的探針與PCR擴(kuò)增的目標(biāo)片斷產(chǎn)物雜交，根據(jù)陽(yáng)性斑點(diǎn)判斷個(gè)體基因型。由于HLA等位基因非常多，就需要很多的探針對(duì)每個(gè)DNA樣品要進(jìn)行多次雜交（甚至十幾次）才能完成定型分析操作也十分繁瑣。于是在此基礎(chǔ)上又發(fā)展起來(lái)一種反向雜交法（reve

11、rsehybridization）。將各種不同的探針固定于同一張膜上，再將PCR產(chǎn)物標(biāo)記，以PCR產(chǎn)物（待檢測(cè)基因DNA）反過(guò)來(lái)與探針雜交。這樣一次雜交即可完成多個(gè)等位基因分析。此方法具有靈敏度、特異性強(qiáng)、需樣本量少等優(yōu)點(diǎn)，但不同探針的雜交條件的須嚴(yán)格統(tǒng)一（如溫度，離子強(qiáng)度）,易出現(xiàn)誤差;不能檢測(cè)新等位基因，試劑盒需不斷升級(jí);對(duì)某些雜合子分辨率也不好;。很多HLA基因型含有相同的多態(tài)性，而僅僅由于排列方式不同，因此分辨率不及SSP和SBT（4.01113）。此方法適宜大量和高純度樣本，雜交條帶將作為書(shū)面原始記錄長(zhǎng)期保存（三種效果比較）。PCR-ASO探針?lè)ǎ≒CR-allelespecific

12、oligonucleotide,ASO）：即等位基因特異性寡核苷酸探針?lè)āＴ赑CR擴(kuò)增DNA片段后，直接與相應(yīng)的寡核苷酸探針雜交，即可明確診斷是否有突變及突變是純合子還是雜合子。其原理是：用PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物進(jìn)行斑點(diǎn)雜交或狹縫雜交，針對(duì)每種突變分別合成一對(duì)寡核苷酸片段作為探針，其中一個(gè)具有正常序列，另一個(gè)則具有突變堿基。突變堿基及對(duì)應(yīng)的正常堿基勻位于寡核苷酸片段的中央，嚴(yán)格控制雜交及洗脫條件，使只有與探針序列完全互補(bǔ)的等位基因片段才顯示雜交信號(hào)，而與探針中央堿基不同的等位基因片段不顯示雜交信號(hào)，如果正常和突變探針都可雜交，說(shuō)明突變基因是雜合子，如只有突變探針可以雜交，說(shuō)明突變基因?yàn)榧兒献?，若?/p>

13、能與含有突變序列的寡核苷探針雜交，但能與相應(yīng)的正常的寡核苷探針雜交，則表示受檢者不存在這種突變基因。若與已知的突變基因的寡核苷探針勻不能雜交，提示可能為一種新的突變類型。PCR-SSP：序列特異性引物分析即根據(jù)各等位基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)出一套針對(duì)每一等位基因特異性的（allele-specific）、或組特異性(group-specific)的引物，此即為序列特異性引物（SSP）。SSP只能與某一等位基因特異性片段的堿基序列互補(bǔ)性結(jié)合，通過(guò)PCR特異性地?cái)U(kuò)增該基因片段，從而達(dá)到分析基因多態(tài)性的目的。上述的PCR/RFLP、PCR/SSO等，最終均需用標(biāo)記的特性探針與擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，再分析結(jié)

14、果。PCR/SSP方法用乃設(shè)計(jì)出一整套等位基因組特異性引物（sequencespecificprimer,SSP），借助PCR技術(shù)獲得HLA型別特異的擴(kuò)增產(chǎn)物，可通過(guò)電泳直接分析帶型決定HLA型別，從而大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟。優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單易行,分辨率可從低到高,成本低。缺點(diǎn)是不易自動(dòng)化;不能檢測(cè)新的等位基因，試劑盒需不斷升級(jí)。此方法適宜零散和純度低樣本，重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)要重提DNA和必須使用紫外凝膠成象儀保留原始資料，增加實(shí)驗(yàn)成本（三種效果比較）。PCR-SSP和PCR-SSO均需大量試劑（引物）,且不能識(shí)別非經(jīng)典的HLA基因和假基因（綠）。針對(duì)HLA外顯子和內(nèi)含子序列精心設(shè)計(jì)引物可避免這些問(wèn)題。PCR-

15、SBT:以PCR擴(kuò)增所要分析的基因片斷，然后對(duì)DNA序列進(jìn)行分析，可以直接得到基因型。分辨率高，可大規(guī)模進(jìn)行，精確度高，能直接發(fā)現(xiàn)新的等位基因。但是由于雜合子的存在，無(wú)法分辨單元型。以上各個(gè)方法都存在無(wú)法克服的缺陷，如能配合使用，則能大大提高分型能力。國(guó)外有學(xué)者對(duì)60個(gè)樣本進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)單用SBT，只有18的樣本能將A，B位點(diǎn)同時(shí)分型成功，如結(jié)合SSO，則能將所有樣本成功分型。基于核酸序列識(shí)別的分型方法始終無(wú)法越過(guò)雜合子的難關(guān)。HSE(Haplotype-specificextention)技術(shù)完美地解決了這一問(wèn)題。它是利用磁珠與其中一條同源染色體的特異位點(diǎn)結(jié)合，達(dá)到分離同源染色體的目的，雜合

16、子問(wèn)題不攻自破。因此，HSE無(wú)論與SSO還是SBT結(jié)合使用，都有極好的效果（1.0112，4.0194）。近年來(lái)，測(cè)序新技術(shù)發(fā)展層出不窮，紛紛運(yùn)用到HLA分型中。如MSNE(multiplexsinglenucleaotideextention),應(yīng)用鏈中止法原理，根據(jù)等位基因SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物和生物素?zé)晒鈽?biāo)記的ddNTP進(jìn)行分型，有重復(fù)性好，可分辨雜合子等優(yōu)點(diǎn)，已應(yīng)用到A位點(diǎn)的分型中。（4.0193）又如pyrosequencing法分型，分辨率好，可分辨雜合子，自動(dòng)化程度也高。DNA芯片技術(shù)，作為一項(xiàng)檢測(cè)SNP的成熟技術(shù)，也已應(yīng)用到HLA分型中.基于序列分子構(gòu)型的分型方法在理論上就避

17、開(kāi)了雜合子這個(gè)難題。SSCP(PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，PCR-singlestrandconformationalpolymorphism)是最常用的根據(jù)構(gòu)型的分型方法。擴(kuò)增的目標(biāo)產(chǎn)物變形后形成單鏈，不同的序列，甚至僅有一個(gè)堿基的差異，就會(huì)形成不同的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而電泳速率不同。但此方法僅限于分辨僅限于200300bp（綠16），且即使是同一單鏈DNA在相同情況下也會(huì)形成不同的構(gòu)型，使得電泳條帶很難分析;也有可能會(huì)出現(xiàn)當(dāng)某些位置的點(diǎn)突變對(duì)單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變不起作用或作用很小的情況,使聚丙烯酰胺凝膠電泳無(wú)法分辨造成漏檢。HA(異源二聚體電泳多態(tài)性，HeteroduplexAnalysi

18、s)是另一種基于序列分子構(gòu)型的分型方法，根據(jù)異源二聚體未配對(duì)區(qū)域的長(zhǎng)度和分布而顯示出電泳條帶不同（綠18）。但與單鏈DNA相比，異源二聚體電泳條帶過(guò)于復(fù)雜，難以分析。新發(fā)展的RSCA（ReferenceStrandMediatedConformationAnalysis）技術(shù)根據(jù)HA的原理，設(shè)計(jì)了位點(diǎn)特異性熒光標(biāo)記的參照DNA片段，與樣本DNA分子的正反鏈形成異源二聚體.帶有熒光標(biāo)記的電泳條帶易于分析，能夠克服HA的不足。另外，提取基因組模板的技術(shù)也在不斷發(fā)展。用于分型的DNA來(lái)源也已不局限于血液，口腔涂片、唾液中提取的DNA也有相似的效果（7.01261）。針對(duì)微量基因組模板的情況，現(xiàn)已開(kāi)發(fā)

19、出基于滾環(huán)復(fù)制的全基因組擴(kuò)增技術(shù)，可以將1ng的模板擴(kuò)大至100ng，足以應(yīng)付PCR-RFLP、PCR-SBT等分型技術(shù)的要求。相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，未來(lái)HLA分型技術(shù)會(huì)向著更便捷，準(zhǔn)確的方向前進(jìn)。HLA分型技術(shù)回顧（2）HLA分型并不只是一種應(yīng)用性的臨床檢測(cè)指標(biāo)，免疫遺傳學(xué)研究的發(fā)展，很大程度上依賴于以分型為主要手段的HLA多態(tài)性分析。60年代建立的并不斷完善的血清學(xué)及細(xì)胞學(xué)分型技術(shù)主要側(cè)重于分析HLA產(chǎn)物特異性；80年代起建立的DNA分型方法則側(cè)重于基因的分型。一、血清學(xué)分型技術(shù)（一）HLA-類抗原的檢測(cè)HLA-A、B、C抗原型別鑒定均借助微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)（microlympho

20、cytotoxicitytest）或稱補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒試驗(yàn)（complementdependentcytotoxicitytest）。原理為取已知HLA抗血清加入待測(cè)外周血淋巴細(xì)胞，作用后加入免補(bǔ)體，充分作用后加入染料，在倒置顯微鏡下判斷結(jié)果，著染的細(xì)胞為死亡細(xì)胞，表示待檢淋巴細(xì)胞表面具有已知抗血清所針對(duì)的抗原。標(biāo)準(zhǔn)抗原清取自多次經(jīng)產(chǎn)婦或計(jì)劃免疫志愿者。（二）HLA-DR、DQ抗原檢測(cè)該二抗原分型方法同HLA-類抗原，但所用抗血清須經(jīng)過(guò)血小板吸收以去除針對(duì)類抗原的HYPERLINK/antibody/t_blank抗體。另外，待測(cè)細(xì)胞須是經(jīng)純化的B細(xì)胞。血清學(xué)分型是一項(xiàng)古老的技術(shù)，雖然近年來(lái)已

21、建立許多新的分型技術(shù)，但血清學(xué)方法目前仍是HLA分型的基礎(chǔ)。二、細(xì)胞學(xué)分型技術(shù)HLA-Dw特異性與HLA-DP特異性可分別通過(guò)純合分型細(xì)胞（homozygotetypingcell,HTC）及預(yù)致敏淋巴細(xì)胞試驗(yàn)（primedlymphocytetest,PLT）檢測(cè)。二種方法的基本原理均是判斷淋巴細(xì)胞在識(shí)別非已HLA抗原決定簇后發(fā)生的增殖反應(yīng)。由于分型細(xì)胞來(lái)源困難以及操作手續(xù)繁瑣，細(xì)胞學(xué)分型技術(shù)下正逐漸淘汰。三、HLA的DNA分型技術(shù)上述傳統(tǒng)的HLA分型方法有許多不足之處，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外已將HLA分型技術(shù)由抗原水平發(fā)展到基因水平。（一）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)這是首先建立的對(duì)多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)的

22、DNA分析技術(shù)。個(gè)體間抗原特異性來(lái)自氨基酸順序的差別，后者由編碼基因的堿基順序不同所決定。這種堿基順序的差別造成限制性內(nèi)切酶識(shí)位置及酶切位點(diǎn)數(shù)目的不同，從而產(chǎn)生數(shù)量和長(zhǎng)度不一的DNA酶切片段。用特異性探針對(duì)整個(gè)HYPERLINK/biology/Special/genomics/Index.shtml基因組DNA酶切片段進(jìn)行雜交，即可分析限制性長(zhǎng)度片段多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）。一定的內(nèi)切酶組合所得到的HLA-RFLP可以和傳統(tǒng)方法測(cè)定的HLA特異性型別相關(guān)。80年代末發(fā)展起來(lái)的PCR（polymerasechainreact

23、ion）技術(shù)已被用于RFLP分析，即用等位特異限制酶裂解PCR擴(kuò)增的片段，然后再進(jìn)行分析，從而大提高了靈敏度。（二）PCR/SSO技術(shù)此法乃用人工合成的HLA型別特異的寡核苷酸序列作為探針，與待檢細(xì)胞經(jīng)PCR擴(kuò)增的HLA基因片段雜交，從而確定HLA型別，PCR技術(shù)可將HLA復(fù)合體上指定基因片段特異性地?cái)U(kuò)增56個(gè)數(shù)量級(jí)；而專門(mén)設(shè)計(jì)的SSO（序列特異的寡核苷酸sequencedpecificoligonucleotide）探針又能探測(cè)出等位基因間12個(gè)核苷酸的差異，故PCR/SSO技術(shù)具有靈敏度、特異性強(qiáng)、需樣本量少等優(yōu)點(diǎn)。（三）PCR/SSP技術(shù)目前常規(guī)的HLA-DNA分型技術(shù)，包括上述的PCR

24、/RFLP、PCR/SSO等，最終均需用標(biāo)記的特性探針與擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，再分析結(jié)果。PCR/SSP方法用乃設(shè)計(jì)出一整套等位HYPERLINK/biology/Special/genomics/Index.shtml基因組特異性引物（sequencespecificprimer,SSP），借助PCR技術(shù)獲得HLA型別特異的擴(kuò)增產(chǎn)物，可通過(guò)電泳直接分析帶型決定HLA型別，從而大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟。由于傳統(tǒng)方法在類抗原分型方面困難較大，故上述幾種基因分析型方法目前主要用于類基因座。此外，目前已建立的HLA基因分型技術(shù)還包括PCR單鏈構(gòu)像多態(tài)性分析（PCR-singlestrandconformati

25、onalpolymorphism，PCR-SSCP）和PCR異源二聚體電泳多態(tài)即PCR指紋圖（PCrfingerprinting）分析。DNA分型技術(shù)的應(yīng)用，使HLA型別分析達(dá)到了更精細(xì)的水平，并因此發(fā)現(xiàn)了更多的HLA多態(tài)性。HLA的DNA分型技術(shù)現(xiàn)已成為血清學(xué)方法的競(jìng)爭(zhēng)者，并可能在不久的將來(lái)完全取而代之。HLA是目前所知人體最復(fù)雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)。HLA研究涉及免疫學(xué)、生物學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等多個(gè)學(xué)科，并已發(fā)展成為一個(gè)獨(dú)立的學(xué)科分支。迄今HLA研究已達(dá)到相當(dāng)深入的水平，并在諸多方面取得顯著進(jìn)展，包括HLA復(fù)合體結(jié)構(gòu)；HLA分子結(jié)構(gòu)及其表達(dá)的調(diào)控；HLA分子功能，尤其是在抗原處理、呈

26、遞及T細(xì)胞識(shí)別中的作用；HLA的DNA分型及多態(tài)性研究；HLA與疾病的關(guān)系；HLA與移植的關(guān)系等。HLA研究不僅使器官移植成為一種極有價(jià)值的治療手段，并給基礎(chǔ)與臨床免疫帶來(lái)了突破性進(jìn)展。已經(jīng)證實(shí)，HLA復(fù)合體中存在控制免疫應(yīng)答的基因以及HLA參與約束免疫細(xì)胞間相互作用，這表示HLA涉及生命活動(dòng)的各個(gè)水平與多個(gè)方面?？梢灶A(yù)期，對(duì)HLA的研究將繼續(xù)成為免疫遺傳學(xué)最活躍的部分；對(duì)HLA的應(yīng)用將擴(kuò)展到基礎(chǔ)、臨床、預(yù)防醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。HLA分型第一節(jié)概述主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)系編碼主要組織相性抗原的基因群，是早期從組織器官移植實(shí)驗(yàn)中發(fā)

27、現(xiàn)的，也是當(dāng)今免疫遺傳學(xué)的主要內(nèi)容。已發(fā)現(xiàn)，在人群或同種動(dòng)物不同個(gè)體間進(jìn)行皮膚移植時(shí)出現(xiàn)的排斥反應(yīng)，具有記憶性、特異性和可轉(zhuǎn)移性等免疫反應(yīng)的基本特征，故從廿世紀(jì)40年代起就確認(rèn)移植排斥反應(yīng)是一種典型的免疫現(xiàn)象。引起排斥反應(yīng)的抗原稱移植抗原(transplantationantigen)或組織相容性抗原(histocompatibilityantigen)。此等抗原存在于細(xì)胞表面，無(wú)器官特異性，不同個(gè)體間其抗原特異性互不相同，但同卵雙生及純系動(dòng)物不同個(gè)體之間，其抗原特異性完全一致。組織相容性抗原包括多種復(fù)雜的抗原系統(tǒng)。凡能引起快而強(qiáng)的排斥反應(yīng)者稱為主要組織相容性抗原系統(tǒng)，引起慢而弱的排斥反應(yīng)者稱

28、為次要組織相容性抗原系統(tǒng)。若供者、受者雙方的多個(gè)次要組織相容性抗原不匹配，同樣會(huì)迅速發(fā)生明顯的排斥反應(yīng)。現(xiàn)已證明，MHC不僅控制著同種移植排斥反應(yīng)，更重要的是與機(jī)體免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)及某些病理狀態(tài)的產(chǎn)生均密切相關(guān)。因此，MHC的完整概念是指脊椎動(dòng)物某一染色體上編碼主要組織相容性抗原、控制細(xì)胞間相互識(shí)別、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的一組緊密連鎖基因群。關(guān)于MHC的發(fā)現(xiàn)、基因組成和功能的了解，多基于小鼠實(shí)驗(yàn)。因此，從廿世紀(jì)30年代起已確定小鼠的MHC位于第17號(hào)染色體上，稱為H2復(fù)合體。H2復(fù)合體由K區(qū)、I區(qū)、S區(qū)和D區(qū)組成，其中I區(qū)又分為IA和IE兩個(gè)亞區(qū)，其基因編碼產(chǎn)物稱為I區(qū)相關(guān)抗原(Iregionass

29、ociatedantigen，Ia)，見(jiàn)圖5.1。圖5.1小鼠H-2復(fù)合體結(jié)構(gòu)示意圖1958年Dausset等發(fā)現(xiàn)，多次接受輸血的患者、多產(chǎn)婦和用同種白細(xì)胞免疫的志愿者血清中，存在不同特異性的白細(xì)胞抗體，用這些抗體鑒定出許多不同特異性的白細(xì)胞抗原，稱為人類白細(xì)胞抗原(humanleucocyteantigen，HLA)。通過(guò)家系和人群遺傳分析發(fā)現(xiàn)，人類MHC位于第6號(hào)染色體上，稱為HLA復(fù)合體。各種脊椎動(dòng)物都有自己的MHC，除了人的HLA和小鼠的H2外，恒河猴、黑猩猩、狗、兔、豚鼠、大鼠和雞的MHC分別稱為RhLA、ChLA、DLA、RLAGpLA、AgB(H1)和B。本章主要介紹人類HLA復(fù)

30、合體及其編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、分布和功能，及HLA抗原檢測(cè)在醫(yī)學(xué)上的意義等內(nèi)容。第二節(jié)HLA復(fù)合體的基因組成HLA復(fù)合體位于第6號(hào)染色體短臂上大約4000kb范圍內(nèi)，由一群密切連鎖的基因組成。HLA復(fù)合體是迄今已知的人體最復(fù)雜的基因體系。從著絲點(diǎn)一側(cè)起依次為類基因、類基因和類基因區(qū)域所在(圖5.2)圖5.2HLA復(fù)合體基因簡(jiǎn)圖類基因區(qū)包括HLAA、B、C位點(diǎn)的等位基因，編碼HLAA抗原、B抗原和C抗原等經(jīng)典的類抗原(分子)。近年來(lái)相繼發(fā)現(xiàn)大量與類基因結(jié)構(gòu)相似的基因，已被正式命名的有HLA-E、F、G、H、J、K、L。其中HLA-E、F、G基因可編碼非多態(tài)性的類樣抗原(或非經(jīng)典類抗原)，但它們的確切功

31、能尚未清楚。HLA-H、J、K、L則屬于假基因。類基因區(qū)十分復(fù)雜，主要包括HLA-DP、DQ、DR三個(gè)亞區(qū)和新近確定的DN、DO、DM等3個(gè)亞區(qū)。該區(qū)的基因是以它們所編碼的肽鏈(、)直接命名，如DRA、DRB1、DRB2等。已知該區(qū)至少存在7個(gè)編碼鏈和16個(gè)編碼鏈的基因，其中有的基因有表達(dá)功能，有的功能不明，有的屬于假基因?，F(xiàn)在證明，在類基因區(qū)內(nèi)存在與內(nèi)源性抗原處理和遞呈相關(guān)的基因，即LMP和TAP。LMP又稱蛋白酶體相關(guān)基因(proteasomerelatedgene)，由LMP2和LMP7兩個(gè)基因組成，其編碼產(chǎn)物L(fēng)MP(lowmolecularmasspolypeptideorlargem

32、ultifunctionalprotease)與內(nèi)源性抗原的處理有關(guān)。TAP為多肽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因，包括TAP1和TAP2兩個(gè)基因，其編碼產(chǎn)物TAP(transporterofantigenicpeptides)與抗原肽的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。HLA復(fù)合體類和類區(qū)基因名稱見(jiàn)表5.1。類基因區(qū)內(nèi)已定位的至少有36個(gè)基因，其中與免疫系統(tǒng)有關(guān)的基因有C4B、C4A、C2、Bf、腫瘤壞死因子(TNFA、TNFB)和熱休克蛋白70(HSP70)，分別編碼C4、C2、B因子、TNF-、TNF和HSP70分子。在C4B兩側(cè)，還有與免疫系統(tǒng)無(wú)明顯關(guān)系的CYP21B和CYP21A兩個(gè)基因，編碼21羥化酶。大多數(shù)類基因產(chǎn)物合成后分

33、泌到體液中去。具體內(nèi)容見(jiàn)有關(guān)章節(jié)。HSP70主要在胞漿內(nèi)，與其他蛋白質(zhì)肽鏈的折疊、轉(zhuǎn)位有關(guān)，亦可見(jiàn)于M細(xì)胞和B細(xì)胞的內(nèi)體(endosome)和膜表面，其作用為阻止內(nèi)體中抗原的降解，并使之與類分子聯(lián)合(詳見(jiàn)第八章)。表5.1HLA復(fù)合體類和類基因區(qū)內(nèi)的基因名稱I類基因區(qū)II類基因區(qū)HLA-AHLA-DRAHLA-DQA1HLA-DRBHLA-BHLA-DRB1HLA-DQB1HLA-DRBHLA-CHLA-DRB2HLA-DQA2HLA-DRBHLA-EHLA-DRB3HLA-DQB2HLA-DRBHLA-FHLA-DRB4HLA-DQB3HLA-GHLA-DRB5TAP1HLA-HHLA-DR

34、B6HLA-DPA1TAP2HLA-JHLA-DRB7HLA-DPB1LMP2HLA-KHLA-DRB8HLA-DPA2LMP7HLA-LHLA-DRB9HLA-DPB2第三節(jié)HLA的結(jié)構(gòu)和分布一、HLA抗原的分子結(jié)構(gòu)(一)HLA類抗原HLA-A、B、C抗原是由第6號(hào)染色體相應(yīng)類基因編碼的鏈(44kD)與第15號(hào)染色體編碼的2微球蛋白(2microglobulin，2m，12kD)非共價(jià)結(jié)合的糖蛋白。鏈由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。胞外區(qū)可進(jìn)一步分為1、2和33個(gè)功能區(qū)?？缒^(qū)含疏水性氨基酸，排列成螺旋，跨越脂質(zhì)雙分子層。胞內(nèi)的氨基酸被磷?；笥欣诩?xì)胞外信息向胞內(nèi)傳遞。2m無(wú)同種特異性，與3

35、功能區(qū)連接，其功能為有助于類抗原的表達(dá)和穩(wěn)定性，見(jiàn)圖5.3。圖5.3HLA類、類分子結(jié)構(gòu)示意圖根據(jù)線晶體衍射資料表明，類抗原分子頂部1和2區(qū)組成的抗原肽結(jié)合區(qū)呈溝槽狀結(jié)構(gòu)，1和2區(qū)各含4股片層和1個(gè)螺旋，呈對(duì)稱排列而連接成一個(gè)溝槽，片層組成槽底，其兩側(cè)由螺旋組成。溝槽大小為2.5nm1.0nm1.1nm，可容納812個(gè)氨基酸殘基組成的短肽(圖5.4A)。溝槽內(nèi)氨基酸變化大，是類抗原多態(tài)性的基礎(chǔ)。雖然抗原肽與類分子的結(jié)合有一定的選擇性，但并不像抗原與抗體那樣高度特異地結(jié)合，只要被結(jié)合的多肽有23個(gè)關(guān)鍵的氨基酸能恰當(dāng)?shù)剡B接到溝槽內(nèi)的多肽結(jié)合基序(bindingmotif)的相應(yīng)位置上，多肽即可與之

36、結(jié)合，并被運(yùn)送到細(xì)胞表面遞呈給T細(xì)胞。所以每個(gè)類抗原分子能與一定廣度的多肽譜結(jié)合。3與2m具有Ig恒定區(qū)樣結(jié)構(gòu)。3為T(mén)細(xì)胞CD8分子的識(shí)別部位。(二)HLA類抗原HLA-DP、DQ、DR等類抗原是由類基因編碼的鏈(34kD)和鏈(29kD)非共價(jià)連接的糖蛋白。鏈和鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分別合成后，很快與第3條鏈鏈(或稱Ii鏈)結(jié)合成復(fù)合體，當(dāng)復(fù)合體到達(dá)WTHZMCWT(內(nèi)體/溶酶體樣結(jié)構(gòu))，鏈解離、降解。鏈的存在，使、鏈不能與其他胞內(nèi)蛋白結(jié)合，并協(xié)助復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)到MC，使之與抗原結(jié)合。鏈和鏈，均由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。胞外區(qū)各含兩個(gè)功能區(qū)1、2和、2(圖5.3)。線晶體衍射圖像顯示，1和1區(qū)各自盤(pán)繞成

37、一個(gè)螺旋和片層構(gòu)成溝槽的一個(gè)側(cè)壁和半個(gè)底面(圖5.4B)。由于它的末端是開(kāi)放的，故可容納較長(zhǎng)的多肽(約1220個(gè)氨基酸)。該溝槽與多肽結(jié)合的特點(diǎn)基本上與類抗原相似，但被結(jié)合的多肽一般來(lái)自外源性抗原經(jīng)加工處理降解的產(chǎn)物。2、2區(qū)靠近細(xì)胞膜，具有Ig樣結(jié)構(gòu)，2為T(mén)細(xì)胞CD4分子的識(shí)別部位。圖5.4類分子構(gòu)槽(A)和類分子構(gòu)槽(B)示意圖二、HLA抗原的分布經(jīng)典的HLA類抗原(HLAA、B、C系列)廣泛分布于人體各種組織的有核細(xì)胞表面，包括血小板和網(wǎng)織紅細(xì)胞。除某些特殊血型外，成熟紅細(xì)胞一般不表達(dá)類抗原，神經(jīng)細(xì)胞和成熟的滋養(yǎng)層細(xì)胞也不表達(dá)此類抗原。各種組織細(xì)胞表達(dá)HLA類抗原的數(shù)量不同，以外周血白細(xì)

38、胞和脾、淋巴結(jié)、胸腺細(xì)胞的含量最豐富，其次為肺、肝、腎、皮膚、主動(dòng)脈和肌肉。HLA-E、G、F抗原多特異地表達(dá)于組織發(fā)生時(shí)期的細(xì)胞。研究證明，滋養(yǎng)層細(xì)胞雖不表達(dá)經(jīng)典的HLA-A、B、C抗原，卻表達(dá)HLA-G抗原，后者可以保護(hù)滋養(yǎng)層細(xì)胞免受NK細(xì)胞的殺傷。類抗原(HLADR、DP、DQ系列)的分布面較窄，主要分布于B細(xì)胞、M細(xì)胞及其他的抗原遞呈細(xì)胞(APC)、胸腺上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞等，被活化的T細(xì)胞及精細(xì)胞上亦有類抗原表達(dá)。有些組織在病理情況下(如病毒感染或F等細(xì)胞因子誘導(dǎo)時(shí))亦可表達(dá)類抗原。近年研究表明，HLADM并不表達(dá)于細(xì)胞表面，而局限于胞質(zhì)的MC內(nèi)，它能使類抗原的鏈與鏈解離，從而促進(jìn)

39、外源性抗原肽與類分子結(jié)合。分布在細(xì)胞表面的HLA、類抗原，也可以可溶性形式出現(xiàn)在血清、尿液、唾液、精液及乳汁中。第四節(jié)HLA的生物學(xué)功能HLA抗原(分子)最初是作為同種抗原誘發(fā)移植排斥反應(yīng)而被發(fā)現(xiàn)的，但很快就認(rèn)識(shí)到它在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和某些疾病的易感性中起重要作用。一、對(duì)蛋白質(zhì)抗原的處理與遞呈HLA最主要的功能之一是作為抗原遞呈分子。已知兩類HLA分子所遞呈的抗原有不同的特點(diǎn)。細(xì)菌、蛋白質(zhì)等非自身細(xì)胞產(chǎn)生的外源性抗原由APC吞噬或內(nèi)化后，在內(nèi)體中降解成肽段后移行到MC，并與從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到MC中的HLA類分子結(jié)合成抗原肽類分子復(fù)合體，運(yùn)送到細(xì)胞表面供CD4T細(xì)胞識(shí)別(圖5.5)。病毒抗原、腫瘤抗原等

40、內(nèi)源性抗原，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)首先經(jīng)LMP降解成肽段，通過(guò)TAP(在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上)轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，使之與新合成的HLA類分子結(jié)合成抗原肽類分子復(fù)合體，經(jīng)高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面，供CD8T細(xì)胞識(shí)別(圖5.5)。.5HLA分子對(duì)抗原的處理、轉(zhuǎn)運(yùn)示意圖最近研究發(fā)現(xiàn)，HLA類分子亦可與那些從吞噬小泡進(jìn)入胞質(zhì)中的外源性抗原(經(jīng)LMP、TAP作用)結(jié)合，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面，引起CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。同樣，在某些情況下，HLA類分子亦可與內(nèi)原性抗原結(jié)合，引起CD4+T細(xì)胞應(yīng)答?？梢?jiàn)，HLA對(duì)抗原的處理與遞呈是十分復(fù)雜的過(guò)程。二、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答實(shí)驗(yàn)證明MHC分子在多方面參與免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。(一)抗原肽-MHC-TCR三分子復(fù)

41、合體啟動(dòng)免疫應(yīng)答抗原經(jīng)APC處理成肽段后，一方面經(jīng)配位或抗原限制位(agretope)與MHC的溝槽結(jié)合，一方面經(jīng)表位(epitope)與相應(yīng)的T細(xì)胞抗原受體(TCR)結(jié)合，組成抗原肽MHCTCR三分子復(fù)合體，啟動(dòng)免疫應(yīng)答。(二)MHC是協(xié)同刺激分子當(dāng)抗原肽MHC復(fù)合體與TCR結(jié)合的同時(shí)，MHC類分子或類分子分別與T細(xì)胞表面的CD8或CD4分子結(jié)合，以穩(wěn)定抗原肽MHC分子與TCR的特異性結(jié)合，并使與CD4/CD8相關(guān)聯(lián)的酪氨酸蛋白激酶P56lck活化。后者是T細(xì)胞活化的一個(gè)重要協(xié)同刺激信號(hào)，故MHC分子是協(xié)同刺激分子。(三)MHC限制性無(wú)論在免疫應(yīng)答識(shí)別階段T細(xì)胞與APC之間的作用，還是效應(yīng)階

42、段T細(xì)胞與靶細(xì)胞之間的作用，都涉及到T細(xì)胞對(duì)與其作用細(xì)胞的自身MHC分子的識(shí)別，即只有當(dāng)相互作用細(xì)胞雙方的MHC分子一致時(shí)，免疫應(yīng)答才能發(fā)生。這一現(xiàn)象稱為MHC限制性(MHCrestriction)。這是Doherty和Zinkernagel于1974年最早從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明的，兩學(xué)者因此而榮獲1996年諾貝爾獎(jiǎng)?，F(xiàn)已明確，細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc)與靶細(xì)胞之間相互作用受MHC類分子限制，APC與輔助性T細(xì)胞(TH)之間、TH細(xì)胞與B細(xì)胞之間、T細(xì)胞與T細(xì)胞之間相互作用時(shí)受MHC類分子限制。關(guān)于MHC限制性的本質(zhì)，目前認(rèn)為，T細(xì)胞識(shí)別抗原時(shí)有兩種識(shí)別，一是TCR識(shí)別與MHC結(jié)合的抗原肽，而MHC與抗原

43、肽的結(jié)合是有一定選擇性的，二是TCR尚需識(shí)別MHC分子多態(tài)部分的螺旋。因此限制了TCR只能識(shí)別自身MHC分子遞呈的抗原。TCR識(shí)別自身MHC分子的能力是T細(xì)胞在胸腺發(fā)育中獲得的(詳見(jiàn)第六章)。(四)對(duì)免疫應(yīng)答強(qiáng)弱的影響不同個(gè)體所具有的不同MHC分子譜，可能控制著對(duì)特異性抗原應(yīng)答的能力。如某個(gè)體的MHC分子與抗原配位的結(jié)合具有高度親和力，則該個(gè)體對(duì)此抗原的免疫刺激呈高應(yīng)答;相反，如與抗原配位呈疏松結(jié)合，則該個(gè)體對(duì)此抗原呈低應(yīng)答。因此免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱直接決定于MHC分子與抗原配位結(jié)合的緊密性。此外，細(xì)胞表面MHC分子的密度亦影響免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱程度。三、參與T細(xì)胞分化過(guò)程胸腺上皮細(xì)胞表達(dá)的MHC、類分

44、子和胸腺中APC表面的MHC自身抗原復(fù)合物，參與了胸腺細(xì)胞的陽(yáng)性與陰性選擇，使胸腺細(xì)胞分化發(fā)育成具有免疫功能的成熟T細(xì)胞(詳見(jiàn)第六章)。四、誘導(dǎo)同種免疫應(yīng)答在同種移植免疫應(yīng)答中，HLA抗原既是激發(fā)同種免疫應(yīng)答的抗原，又是同種免疫應(yīng)答中效應(yīng)階段被攻擊的靶抗原。在同種組織器官移植或輸血中，它可在受者體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體和特異的Tc細(xì)胞，從而攻擊移植物細(xì)胞而發(fā)生排斥反應(yīng)。HLA抗原呈現(xiàn)很強(qiáng)的免疫原性，無(wú)論是類或類抗原，都能在體外直接誘導(dǎo)出強(qiáng)烈的初次T細(xì)胞免疫應(yīng)答，即可導(dǎo)致CD4T細(xì)胞的活化和產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，并能誘導(dǎo)CD8T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷效應(yīng)或誘導(dǎo)部分CD4T細(xì)胞對(duì)表達(dá)類抗原的靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。這

45、種情況可見(jiàn)于兩個(gè)不同遺傳背景的供者、受者淋巴細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中，即混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixedlymphocytereaction，MLR)和特異的殺傷性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)反應(yīng)。第五節(jié)HLA復(fù)合體的遺傳特點(diǎn)及分型技術(shù)一、HLA復(fù)合體的遺傳特點(diǎn)(一)單倍型遺傳連鎖在一條染色體上的HLA各位點(diǎn)的基因組合稱為HLA單倍型(HLAhaplotype)。兩個(gè)同源單倍型構(gòu)成HLA的基因型(HLAgenotype)。由于一條染色體上HLA各位點(diǎn)之間距離非常近，很少發(fā)生同源染色體間的交換。當(dāng)親代的遺傳信息傳給子代時(shí)，HLA單倍型作為一個(gè)單位遺傳給下一代。因此

46、，子女的HLA基因型中，一個(gè)單倍型與父親相同，另一個(gè)與母親相同。例如父親的HLA單倍型為a和b，母親的是c和d，則其子女可出現(xiàn)ac、bc、ad和bd4種基因型的組合(圖5.6)。這樣，親代與子代間有一個(gè)單倍型是相同的。同胞間，HLA基因型完全相同的機(jī)率為25，完全不相同的機(jī)率亦為25，一個(gè)單倍型相同的機(jī)率為50。因此，從家庭內(nèi)尋找器官移植的供者，其供、受者HLA抗原型別相同的機(jī)率比在無(wú)血緣關(guān)系的供、受者中高得多。圖5.6HLA家系遺傳示意圖(二)共顯性遺傳HLA復(fù)合體為共顯性遺傳，即每對(duì)等位基因都能編碼抗原，共同表達(dá)于細(xì)胞膜上，而不形成ABO血型系統(tǒng)中的隱性基因及免疫球蛋白基因中的等位基因排斥

47、現(xiàn)象，這就大大增加了HLA抗原系統(tǒng)的復(fù)雜性和多態(tài)性。(三)高度多態(tài)性高度多態(tài)性是HLA復(fù)合體最顯著的遺傳特點(diǎn)。多態(tài)性是指在隨機(jī)婚配的群體中，同一基因位點(diǎn)可存在兩個(gè)或兩個(gè)以上的基因，有的可多達(dá)幾十個(gè)，甚至百余個(gè)基因。由于HLA復(fù)合體是多位點(diǎn)的共顯性復(fù)等位基因系統(tǒng)，故具有高度多態(tài)性。到1996年WHO命名委員會(huì)公布的HLA類基因中，已發(fā)現(xiàn)HLA-A位點(diǎn)有61個(gè)復(fù)等位基因，B位點(diǎn)和C位點(diǎn)各有136個(gè)和37個(gè)復(fù)等位基因，HLA-E和G位點(diǎn)各有4個(gè)復(fù)等位基因。HLA-類基因多態(tài)性更為顯著，HLA-DPA1、DPB1、DQA1、DQB1、DRA、DRB1位點(diǎn)分別有8、67、16、26、2和141個(gè)復(fù)等位基

48、因數(shù)。因而在遠(yuǎn)交人群中，有數(shù)以百億計(jì)的HLA單倍型和基因型。根據(jù)共顯性遺傳規(guī)則，在無(wú)血緣關(guān)系人群中，可檢出各不相同的HLA表現(xiàn)型，這給同種移植時(shí)選擇供體造成極大困難，但HLA復(fù)合體的高度多態(tài)性，是賦于機(jī)體具有能夠適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境多變的巨大潛力，因而具有重要的生物學(xué)意義。(四)連鎖不平衡單倍型基因非隨機(jī)分布的現(xiàn)象稱為連鎖不平衡(linkagedisequilibrium)。如某些基因(A1與B8)經(jīng)常在一起出現(xiàn)，其單倍型頻率比理論值高，而另一些基因又較少出現(xiàn)。連鎖不平衡產(chǎn)生原因尚不清楚。有人認(rèn)為，連鎖不平衡與某些疾病的發(fā)生有關(guān)。二、HLA的分型技術(shù)HLA分型不僅能應(yīng)用于臨床，更是免疫遺傳學(xué)研究所必需

49、。傳統(tǒng)的血清學(xué)分型和細(xì)胞學(xué)分型技術(shù)主要側(cè)重于HLA抗原特異性的分型，80年代建立的DNA分型技術(shù)則側(cè)重于基因分析。(一)血清學(xué)分型技術(shù)1.HLA類抗原的檢測(cè)HLA-A、B、C抗原型別鑒定均使用微量補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒試驗(yàn)(complementdependentcytotoxicity，CDC)?；驹硎菢?biāo)準(zhǔn)分型血清中含有針對(duì)某種抗原特異性的細(xì)胞毒抗體，可與待測(cè)細(xì)胞表面相應(yīng)HLA抗原結(jié)合、激活隨后加入補(bǔ)體，使細(xì)胞損傷或死亡。利用染料排斥試驗(yàn)判斷受檢細(xì)胞，受損或死亡細(xì)胞被染色為細(xì)胞毒陽(yáng)性。細(xì)胞毒陽(yáng)性細(xì)胞的HLA抗原型別與標(biāo)準(zhǔn)分型血清所針對(duì)的抗原相當(dāng)。2.HLA-DQ、DR抗原的檢測(cè)該兩抗原的檢測(cè)方法同

50、HLA類抗原，但所用的抗血清必須經(jīng)過(guò)吸收(通常用多個(gè)個(gè)體的血小板來(lái)吸收)以除去其中的抗類抗原的抗體，待測(cè)細(xì)胞須用經(jīng)過(guò)純化的B細(xì)胞。標(biāo)準(zhǔn)分型血清多取自經(jīng)產(chǎn)婦、計(jì)劃免疫志愿者，或制備的HLA單克隆抗體。血清學(xué)分型是一項(xiàng)古老的技術(shù)，盡管近年來(lái)已建立許多新的技術(shù)，但它仍是目前HLA分型的基本方法。(二)細(xì)胞學(xué)分型技術(shù)HLA-DP抗原特異性可應(yīng)用純合子分型細(xì)胞(homozygoustypingcell，HTC)和預(yù)致敏淋巴細(xì)胞試驗(yàn)(primedlymphocytetest，PLT)檢測(cè)。兩種方法的原理均是通過(guò)單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)判斷淋巴細(xì)胞在識(shí)別非己HLA抗原后發(fā)生的增殖反應(yīng)。由于分型細(xì)胞來(lái)源困難以及實(shí)

51、驗(yàn)方法繁瑣，細(xì)胞學(xué)分型技術(shù)正逐漸被淘汰。(三)DNA分型技術(shù)近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已將HLA分型技術(shù)從抗原水平發(fā)展到基因水平。DNA分型技術(shù)是在分子雜交基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，通過(guò)分析受檢者細(xì)胞基因組DNA片段的多態(tài)性特點(diǎn)來(lái)判斷抗原特異性型別。1.RFLP技術(shù)即HYPERLINK/course/yxmyx/chapter5/RFLP.htm限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)分析技術(shù)，其基本原理是，個(gè)體間抗原特異性來(lái)自氨基酸順序的差別，后者由編碼基因的堿基順序不同所決定。此種堿基順序的差別造成限制性內(nèi)切酶識(shí)別位置及酶切位點(diǎn)數(shù)目的不同，從

52、而產(chǎn)生數(shù)量和長(zhǎng)度不一的DNA酶切片段。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后，用標(biāo)記的特異cDNA探針與之雜交，經(jīng)放射自顯影顯示出不同長(zhǎng)度的雜交條帶。根據(jù)雜交條帶的格局來(lái)判定HLA的型別。將聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)與RFLP結(jié)合起來(lái)，可明顯提高其靈敏度。由于本法僅能反映某限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的改變，故有一定的局限性。2.PCR/SSO技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，與標(biāo)記的順序特異的寡核苷酸(sequencespecificoligonucleotide，SSO)探針進(jìn)行雜交，從出現(xiàn)的雜交條帶來(lái)判斷HLA型別。該法能測(cè)出等位基因間12個(gè)核苷酸的差異，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和

53、樣本用量少等優(yōu)點(diǎn)。3.PCR/SSP技術(shù)該法的特點(diǎn)是設(shè)計(jì)一組順序特異性引物(sequencespecificprimerSSP)，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得不同型別的HLA特異擴(kuò)增產(chǎn)物，可通過(guò)電泳法直接分析帶型來(lái)判定HLA型別。省去了上述方法中使用特異性探針作雜交的步驟，因而大大減少了實(shí)驗(yàn)步驟。此外，近來(lái)又建立了PCR指紋圖(PCRfingerprints)和PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCRsinglestrandconformationpolymorphism，PCRSSCP)分析等技術(shù)，使HLA型別分析達(dá)到了更精細(xì)的水平，并因此而發(fā)現(xiàn)了更多的HLA多態(tài)性。目前，DNA分型法主要用于HLA類基因的分型，并有可能在不久的將來(lái)取代血清學(xué)方法。第六節(jié)HLA在醫(yī)學(xué)上的意義