生物化學(xué)酶章節(jié)考點(diǎn)總結(jié)

1、第四章酶酶是一類具有高效率、高度專一性、活性可調(diào)節(jié)的高分子生物催化劑。1957巴斯德提出酒精發(fā)酵是酵母細(xì)胞活動(dòng)的結(jié)果。1分子Glc一2分子乙醇+2分子CO2從Glc開(kāi)始，經(jīng)過(guò)12種酶催化，12步反應(yīng)，生成乙醇1897 Buchner兄弟證明發(fā)酵與細(xì)胞的活動(dòng)無(wú)關(guān)，不含細(xì)胞的酵母汁也能進(jìn)行乙醇發(fā)酵。1913 Michaelis和Menten提出米氏學(xué)說(shuō)一酶促動(dòng)力學(xué)原理。1926 Sumner首次從刀豆中提出月尿酶結(jié)晶，并證明具有蛋白質(zhì)性質(zhì)。1969化學(xué)合成核糖核酸酶。1967-1970從中發(fā)現(xiàn)第I、第II類限制性核酸內(nèi)切酶。1986 Cech發(fā)現(xiàn)四膜蟲(chóng)細(xì)胞大核期間26S rRNA前體具有自我剪接功

2、能。ribozyme , deoxyribozyme5GAATTC 33CTTAAG 5限制作用修飾作用5GAATTC 35GAATTC 33CTTAAG 53CTTAAG 5第一節(jié)酶學(xué)概論酶的生物學(xué)意義大腸桿菌生命周期20分鐘，生物體內(nèi)化學(xué)反應(yīng)變得容易和迅速進(jìn)行的根本原因是體內(nèi)普通存 在生物催化劑一酶。沒(méi)有酶，生長(zhǎng)、發(fā)育、運(yùn)動(dòng)等等生命活動(dòng)就無(wú)法繼續(xù)。限制性核酸內(nèi)切酶（限制-修飾）酶的概念及其作用特點(diǎn)1、酶是一種生物催化劑酶是一類具有高效率、高度專一性、活性可調(diào)節(jié)的高分子生物催化劑。生物催化劑：酶（enzyme）,核（糖）酶（ribozyme）,脫氧核（糖）酶（deoxyribozyme）2、

3、酶催化反應(yīng)的特點(diǎn)(1)、催化效率高酶催化反應(yīng)速度是相應(yīng)的無(wú)催化反應(yīng)的108-1020倍，并且至少高出非酶催化反應(yīng)速度幾個(gè)數(shù)量 級(jí)。(2)、專一性高酶對(duì)反應(yīng)的底物和產(chǎn)物都有極高的專一性，幾乎沒(méi)有副反應(yīng)發(fā)生。(3)、反應(yīng)條件溫和溫度低于100C,正常大氣壓，中性pH環(huán)境。(4)、活性可調(diào)節(jié)根據(jù)據(jù)生物體的需要，許多酶的活性可受多種調(diào)節(jié)機(jī)制的靈活調(diào)節(jié)，包括：別構(gòu)調(diào)節(jié)、酶的共 價(jià)修飾、酶的合成、活化與降解等。(5)、酶的催化活性離不開(kāi)輔酶、輔基、金屬離子3、酶與非生物催化劑相比的幾點(diǎn)共性：催化效率高，用量少(細(xì)胞中含量低)。不改變化學(xué)反應(yīng)平衡點(diǎn)。降低反應(yīng)活化能。P234圖4-1非催化過(guò)程及催化過(guò)程自由能

4、的變化反應(yīng)前后自身結(jié)構(gòu)不變。催化劑改變了化學(xué)反應(yīng)的途徑，使反應(yīng)通過(guò)一條活化能比原途徑低的途徑進(jìn)行，催化劑的效應(yīng) 只反映在動(dòng)力學(xué)上(反應(yīng)速度)，不影響反應(yīng)的熱力學(xué)(化學(xué)平衡)。三、酶的化學(xué)本質(zhì)(一)酶的蛋白質(zhì)本質(zhì)經(jīng)典概念：所有的酶都是蛋白質(zhì)，酶是具有催化功能的蛋白質(zhì)，因此酶具有蛋白質(zhì)的一切共性。1、酶的蛋白質(zhì)組成有些酶僅由蛋白質(zhì)組成，例如，月尿酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等有些酶不僅含有蛋白質(zhì)（酶蛋白），還含有非蛋白質(zhì)成分（輔助因子），只有酶蛋白與輔助因子 結(jié)合形成復(fù)合物（全酶）才表現(xiàn)出酶活性，如超氧化物歧化酶Cu2+、Zn2+）、乳酸脫氫酶（NAD+）酶的專一性由酶蛋白的結(jié)構(gòu)決定，輔

5、助因子傳遞電子或某些化學(xué)基團(tuán)。2、酶的輔助因子酶的輔助因子主要有金屬離子（Fe2+、Fe3+、Cu+、Cu2+Mn2+、Mn3+、Zn2+、Mg2+、K+、Na+、Mo6+、Co2+等）和有機(jī)化合物。輔酶：與酶蛋白結(jié)合較松，可透析除去。輔基：與酶蛋白結(jié)合較緊。酶輔助因子CuZn-SODCu2+ Zn2+Mn-SODMn2+過(guò)氧化物酶Fe2+或Fe3+II型限制性核酸內(nèi)切酶Mg2+竣肽酶Zn2+P235表4-1 一些酶的輔助因子（金屬離子）P237表4-2基團(tuán)反應(yīng)中的輔酶和輔基。酶蛋白決定酶專一性，輔助因子決定酶促反應(yīng)的類型和反應(yīng)的性質(zhì)。比如，NAD+可與多種酶蛋白結(jié)合，構(gòu)成專一性強(qiáng)的乳酸脫氫酶

6、、醇脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶。生物體內(nèi)酶種類很多，而輔助因子種類卻很少，原因是一種輔助因子可與多種酶蛋白結(jié)合。（二）ribozyme核酶（具有催化功能的RNA）1980以前，已知所有的生物催化劑，具化學(xué)本質(zhì)都是蛋白質(zhì)。80年代初，美國(guó)科羅拉多大學(xué)博爾彳惠分校的Thomas Cech和美國(guó)耶魯大學(xué)Sidney Altman各自獨(dú)立發(fā)現(xiàn)RNA具有生物催化功能，此發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是近十年生化領(lǐng)域最令人鼓舞的發(fā)現(xiàn)，此二人分 亨1989諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。ribozyme種類：自我剪接ribozyme 自我剪切ribozyme催化分子間反應(yīng)ribozyme后邊細(xì)講四、按酶蛋白的亞基組成及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分類1、

7、單體酶由一條或多條共價(jià)相連的肽鏈組成的酶分子牛胰RNase124a.a單鏈雞卵清溶菌酶129a.a單鏈胰凝乳蛋白酶三條肽鏈單體酶種類較少，一般多催化水解反應(yīng)。2、寡聚酶由兩個(gè)或兩個(gè)以上亞基組成的酶，亞基可以相同或不同，一般是偶數(shù)，亞基間以非共價(jià)鍵結(jié)合。含相同亞基的寡聚酶蘋果脫胱氫酶（鼠肝），2個(gè)相同的亞基含不同亞基的寡聚酶琥珀酸脫氫酶（牛心），a B 2個(gè)亞基寡聚酶中亞基的聚合，有的與酶的專一性有關(guān)，有的與酶活性中心形成有關(guān)，有的與酶的調(diào)節(jié) 性能有關(guān)。大多數(shù)寡聚酶是胞內(nèi)酶，而胞外酶一般是單體酶。3、多酶復(fù)合體由兩個(gè)或兩個(gè)以上的酶，靠非共價(jià)鍵結(jié)合而成，其中每一個(gè)酶催化一個(gè)反應(yīng)，所有反應(yīng)依次進(jìn) 行

8、，構(gòu)成一個(gè)代謝途徑或代謝途徑的一部分。如脂肪酸合成酶復(fù)合體。例如：大腸桿菌丙酮酸脫氫酶復(fù)合體由三種酶組成丙酮酸脫氫酶（Ei）以二聚體存在2X9600二氫硫辛酸轉(zhuǎn)乙酰基酶（E2）70000二氫硫辛酸脫氫酶（E3）以二聚體存在2X56000復(fù)合體：12個(gè)Ei二聚體 24X9600024 個(gè) E2 單體24X700006 個(gè) E3二聚體12X56000總分子量560萬(wàn)4、多酶融合體一條多肽鏈上含有兩種或兩種以上催化活性的酶，這往往是基因融合的產(chǎn)物。例如：大冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I融合體（雙頭酶）該酶是四聚體a 4,每條肽鏈含兩個(gè)活性區(qū)域：N-端區(qū)域是Asp激酶，C端區(qū)域是高Ser脫氫酶。五、酶

9、在細(xì)胞中的分布一個(gè)細(xì)胞內(nèi)含有上千種酶，互相有關(guān)的酶往往組成一個(gè)酶體系，分布于特定的細(xì)胞組分中，因 此某些調(diào)節(jié)因子可以比較特異地影響某細(xì)胞組分中的酶活性，而不使其它組分中的酶受影響。41,分布于細(xì)胞核的酶核被膜酸性磷酸酶三磷酸核甘酶核仁核內(nèi)可溶性部分2,分布于細(xì)胞質(zhì)的酶參與糖代謝的酶核糖核酸酶酵解酶系、乳酸脫氫酶參與脂代謝的酶參與a.a蛋白質(zhì)的酶參與核酸合成的酶3,分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的酶光滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)：（細(xì)胞質(zhì)一側(cè)）4,分布于線粒體的酶 外膜：?；o酶A合成酶 內(nèi)膜：NADH脫氫酶 基質(zhì)：三竣酸循環(huán)酶系脂肪酸B -氧化酶系酵解酶系磷酸戊糖途徑酶系脂肪酸合成酶復(fù)合體Asp氨基轉(zhuǎn)移酶核甘激酶核甘酸

10、激酶膽固醇合成酶系 蛋白質(zhì)合成酶系染色質(zhì)5,分布于溶酶體的酶水解蛋白質(zhì)的酶水解糖甘類的酶水解核酸的酶水解脂類的酶6.標(biāo)志酶有些酶只分布于細(xì)胞內(nèi)某種特定的組分中,核:尼克酰胺單核甘酸腺甘酰轉(zhuǎn)移酶，功能：DNA、RNA生物合成溶酶體：酸性磷酸酶 微粒體：（核蛋白體、 上精液：乳酸脫氫酶線粒體：琥珀酸脫氫酶（電子轉(zhuǎn)移、三竣酸循環(huán)） （細(xì)胞成分的水解）多核蛋白體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）Glc-6-磷酸酶第二節(jié) 酶的國(guó)際分類及命名習(xí)慣命名1961年6以前使用的酶沿用習(xí)慣命名.（絕大多數(shù)酶）依據(jù)底物來(lái)命名如：催化蛋白質(zhì)水解的酶稱蛋白酶。催化淀粉水解的酶稱淀粉酶。.依據(jù)催化反應(yīng)的性質(zhì)命名如：水解酶、轉(zhuǎn)氨酶結(jié)合上述兩個(gè)原則

11、命名，琥珀酸脫氫酶。4.有時(shí)加上酶的來(lái)源如：胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶習(xí)慣命名較簡(jiǎn)單，但缺乏系統(tǒng)性。二、國(guó)際系統(tǒng)命名系統(tǒng)名稱應(yīng)明確標(biāo)明酶的底物及催化反應(yīng)的性質(zhì)。如：草酸氧化酶（習(xí)慣名），系統(tǒng)名稱：草酸：氧氧化酶又如：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（習(xí)慣名），系統(tǒng)名：丙氨酸：a -酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)：丙氨酸+ a -酮戊二酸一 G1U+丙酮酸三、國(guó)際系統(tǒng)分類法及編號(hào)（EC編號(hào)）原則：將所有酶促反應(yīng)按性質(zhì)分為六類，分別用 1、2、3、4、5、6表示。再根據(jù)底物中被作用的基團(tuán)或鍵的特點(diǎn)，將每一大類分為若干個(gè)亞類，編號(hào)用 1、2、3 每個(gè)亞類又可分為若干個(gè)亞一亞類，用編號(hào) 1、2、3表示。每一個(gè)酶的編號(hào)由4個(gè)數(shù)字組成，

12、中間以?！备糸_(kāi)。第一個(gè)數(shù)字表示大類，第二個(gè)數(shù)字表示 亞類，第三個(gè)表示亞-亞類，第四個(gè)數(shù)字表示在亞-亞中的編號(hào)。1、氧化還原酶類催化氧化還原反應(yīng)：A - 2H+B=A+B - 2H乳酸：NAD+氧化還原酶（EC）,習(xí)慣名：乳酸脫氫酶圖2、轉(zhuǎn)移酶類AB+C=A+BCAla：酮戊二酸氨基移換酶（EC2.6.1.2）,習(xí)慣名：谷丙轉(zhuǎn)氨酶圖3、水解酶類催化水解反應(yīng)，包括淀粉酶、核酸酶、蛋白酶、脂酶。亮氨酸氨基肽水解酶(EC3.4.1.1),習(xí)慣名：Ile氨肽酶。4、裂合酶類(裂解酶)催化從底物上移去一個(gè)基團(tuán)而形成雙鍵的反應(yīng)或其逆反應(yīng)二磷酸酮糖裂合酶(EC4.1.2.7),習(xí)慣名：醛縮酶5、異構(gòu)酶(EC5

13、.3.1.9)催化同分異構(gòu)體相互轉(zhuǎn)化，6-磷酸Glc異構(gòu)酶6、合成酶(連接酶)催化一切必須與ATP分解相偶聯(lián)、并由兩種物質(zhì)合成一種物質(zhì)的反應(yīng)。P241表4-8酶的國(guó)際分類大類和亞類舉例：乙醇脫氫酶的分類編號(hào)是 EC1 ,乳酸脫氫酶EC ,蘋果酸脫氫酶7第一個(gè)數(shù)字表示大類：氧化還原第二個(gè)數(shù)字表示反應(yīng)基團(tuán)：醇基第三個(gè)數(shù)字表示電子受體：NAD +或NADP +第四個(gè)數(shù)字表示此酶底物：乙醇，乳酸，蘋果酸。前面三個(gè)編號(hào)表明這個(gè)酶的特性：反應(yīng)性質(zhì)、底物性質(zhì)(鍵的類型)及電子或基團(tuán)的受體，第 四個(gè)編號(hào)用于區(qū)分不同的底物。酶的物種和組織的差異來(lái)自不同物種或同一物種不同組織或不同細(xì)胞器的同一種酶，雖然它們催化同

14、一個(gè)生化反應(yīng)， 但它們的一級(jí)結(jié)構(gòu)可能不相同，有時(shí)反應(yīng)機(jī)制也可能不同，可是無(wú)論是酶的系統(tǒng)命名法還是習(xí)慣命 名法，對(duì)這些均不加以區(qū)別，而定為相同的名稱，這是因?yàn)槊傅母鶕?jù)是酶所催化的反應(yīng)。例如，SOD不管來(lái)源如何，均催化如下反應(yīng)2O2-+2H+H2O2+O2H2O2再由過(guò)氧化氫酶催化、分解它們有同一個(gè)名稱和酶的編號(hào)EC實(shí)際此酶可分三類：CuZn-SOD 真核生物細(xì)胞質(zhì)中Mn-SOD真核生物線粒體中Fe-SOD即使同是CuZn-SOD,來(lái)自牛紅細(xì)胞與豬紅細(xì)胞的，其一級(jí)結(jié)構(gòu)也有很大不同。因此，在討論一個(gè)具體的酶時(shí)，應(yīng)對(duì)它的來(lái)源與名稱一并加以說(shuō)明。第三節(jié)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是研究酶促反應(yīng)的速度

15、以及影響酶促反應(yīng)速度的各種因素，包括低物濃度、酶 濃度、pH、溫度、激活劑與抑制劑、等。一、酶的量度酶的含量不能直接用重量和摩爾數(shù)表示（不純、失活、分子量不知），而采用酶的活力單位表示1、酶活力與酶促反應(yīng)速度酶活力：用在一定條件下，酶催化某一反應(yīng)的反應(yīng)速度表示。反應(yīng)速度快，活力就越高。酶量一酶活力一反應(yīng)速度酶促反應(yīng)速度的表示方法：?jiǎn)挝粫r(shí)間、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量。單位：濃度/單位時(shí)間P243圖4-4酶反應(yīng)速度曲線研究酶促反應(yīng)速度，以酶促反應(yīng)的初速度為準(zhǔn)。因?yàn)榈孜餄舛冉档?、酶部分失活產(chǎn)物抑制和逆 反應(yīng)等因素，會(huì)使反應(yīng)速度隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。2、酶的活力單位（U）國(guó)際酶學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)單

16、位：在特定條件下，1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化lumol底物的酶量，稱一個(gè)國(guó)際單位（IU）。 特定條件：25c pH及底物濃度采用最適條件（有時(shí)底物分子量不確定時(shí)，可用轉(zhuǎn)化底物中 lumol 的有關(guān)基團(tuán)的酶量表示）。實(shí)際工作中，每一種酶的測(cè)活方法不同，對(duì)酶單位分別有一個(gè)明確的定義。如：限制性核酸內(nèi)切酶用粘度法測(cè)活性：定義為30C, 1分鐘，使底物DNA溶液的比粘度下降25%的酶量為1個(gè)酶 單位。轉(zhuǎn)化率法：標(biāo)準(zhǔn)條件，5分鐘使1ug供體DNA殘留37%的轉(zhuǎn)化活性所需的酶量為1個(gè)酶單位。凝膠電泳法測(cè)活：37C, 1小時(shí)，使1ug2NA完全水解的酶量為1個(gè)酶單位。可見(jiàn)，同一種酶采用不同的測(cè)活方法，得到的酶活單位是不

17、同的，即使是同一種測(cè)活法，實(shí)驗(yàn) 條件稍有相同，測(cè)得的酶單位亦有差異。如淀粉酶，兩種定義A： 1 g可溶性starch,在1h內(nèi)液化所需的enzyme量。B： l ml 2%可溶性starch ,在1h內(nèi)液化所需的enzyme量。1g酶制劑溶于1000ml H2O,取與2%的starch 20ml反應(yīng)，10分鐘完全液化，求酶活力60/10X20 x 2%x 1/0.5X 1000=4800u加 enzyme制劑60/10X x 1000=240000u加 enzyme制劑3、酶的比活力Specific activity每毫克酶蛋白所具有的酶活力。酶的比活力是分析酶的純度是重要指標(biāo)。單位：U/mg

18、蛋白質(zhì)。有時(shí)用每克酶制劑或每毫升酶制劑含有多少個(gè)活力單位表示。舉例：一個(gè)酶的分離純化分為4步步驟1234總活力（U）6432總蛋白質(zhì)（mg）201052比活力（U/mg）6/204/103/52/2酶的提純過(guò)程中，總蛋白減少，總活力減少，比活力增高酶的純化倍數(shù)：第一步總活力,、每一步比活力酶的回收率：第一步總活力x 100%4、酶的轉(zhuǎn)換數(shù)和催化周期分子活性定義：每 mol的enzyme 在1秒內(nèi)轉(zhuǎn)化substrate的 mol數(shù)。亞基或催化中心活性定義：每mol的active subunit或active center在一秒內(nèi)轉(zhuǎn)化的substrate的 mol數(shù)，稱為轉(zhuǎn)換數(shù)KcatP244 圖

19、表 44轉(zhuǎn)換數(shù)的倒數(shù)即為催化周期：一個(gè)酶分子每催化一個(gè)底物分子所需的時(shí)間。如：乳糖脫氫酶轉(zhuǎn)換數(shù)為1000吸，則它的彳S化周期為10-3秒。底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響單底物酶促反應(yīng)，包括異構(gòu)酶、水解酶及大部分裂合催化的反應(yīng)1913 Michaelis和Menten提出米一曼方程。）物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響一一米式學(xué)說(shuō)的提出1903 Henri研究蔗糖水解反應(yīng)。酸水解sucrose +F2Oacidsucraseglucose +fructosesucrose酶水解enzyme（ substrate 不變）sucrose底物濃度與酶促反應(yīng)速度的關(guān)系:Vmax1/2 VmaxKmS零級(jí)反應(yīng)當(dāng)?shù)孜?/p>

20、濃度不斷增大時(shí)，反應(yīng)速度不再上升，趨向一個(gè)極限，酶被底物飽和（底物飽和現(xiàn)象） 中間產(chǎn)物假說(shuō)：酶與底物先絡(luò)合成一個(gè)中間產(chǎn)物，然后中間產(chǎn)物進(jìn)一步分解成產(chǎn)物和游離的酶證據(jù)：（1）競(jìng)爭(zhēng)性抑制實(shí)驗(yàn)（2）底物保護(hù)酶不變性（3）結(jié)晶ES復(fù)合物的獲得。米式學(xué)說(shuō)：1913年，Michaelis和Menten繼承和發(fā)展了中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)，在前人工作基礎(chǔ)上提出酶促動(dòng)力學(xué) 的基本原理，并以數(shù)學(xué)公式表明了底物濃度與酶促反應(yīng)速度的定量關(guān)系，稱米式學(xué)說(shuō)：V V max*SKm S（二）米式方程的導(dǎo)出:1、基于快速平衡假說(shuō)一一早年的米式方程最初，Michaelis和Menten是根據(jù)“快速平衡假說(shuō)”推出米式方程?？焖倨胶饧僬f(shuō)：K

21、； ES K4 P E 在反應(yīng)的初始階段，底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶濃度，因此，底物濃度 S可以認(rèn)為不變。 游離的酶與底物形成ES的速度極快，E + SES,而ES形成產(chǎn)物的速度極慢，ES分解成產(chǎn)物P對(duì)于ES濃度的動(dòng)態(tài)平衡沒(méi)有影響，不予考慮。K1、 K2 K3ES可以忽略不記因?yàn)檠芯康氖浅跛俣?，P的量很小，由PES 的生成速度:Ki (E - ES) SES的分解速度：K2ESKi (E - ES) S = K2ESESKiESK2 KiS反應(yīng)速度:K3ESK3ESK2KiVmax SKs SKS現(xiàn)在稱為底物常數(shù)2、Briggs和Haldane的“穩(wěn)態(tài)平衡假說(shuō)”及其對(duì)米式方程的發(fā)展:穩(wěn)態(tài)平衡假說(shuō)：E

22、S K1 ES K3 P EK2K4ES的的生成與分解處于動(dòng)態(tài)平衡（穩(wěn)態(tài)）,有時(shí)必須考慮ES分解成產(chǎn)物P對(duì)于ES動(dòng)態(tài)平衡 的影響（ES分解速度）?；蛘哒f(shuō)，ES的動(dòng)態(tài)平衡（分解速度）不僅與 ES E+S有關(guān)，還與ES P + E有關(guān)。穩(wěn)態(tài)平衡假說(shuō)的貢獻(xiàn)在于第點(diǎn)。用穩(wěn)態(tài)假說(shuō)推導(dǎo)米式方程：ES生成速度：k1 （E - ES ） SES分解速度：k2ES+k3ES以上兩個(gè)速度相等。k1 （E - ES） S = k2ES+k3ESESE S ESK2 K3 Km SSKi反應(yīng)速度:V K3ESK3ES V maxSKm S Km SKmK2 K3KiVmax=k3 EKm稱米氏常數(shù)，當(dāng)Km及Vmax已

23、知時(shí)，即可確定酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系（三）米式方程討論1、快速平衡假說(shuō)與穩(wěn)態(tài)平衡假說(shuō)的實(shí)質(zhì)區(qū)別E S K1 ES K3 P EK4K2當(dāng)Ki、K2K3時(shí)，即ESP是整個(gè)反應(yīng)平衡中極慢的一步，那么KmK2 K3K1K2K1KsV maxSKm SV max SKS S這就是早年提出的米式方程因此說(shuō)，穩(wěn)態(tài)平衡=快速平衡+慢速平衡，K2 K3 K2 K3Ki Ki Ki當(dāng)ES P （即K3/K1）極慢時(shí)，穩(wěn)態(tài)平衡基本等于快速平衡2、Km的物理意義當(dāng)反應(yīng)速度V=1/2 Vmax時(shí)，Km = S,Km的物理意義是：當(dāng)反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度的一半時(shí)底物的濃度。單位：與底物濃度的單位一致，mol L-

24、1或mmol - L-1Km是酶的特征常數(shù)之一。一般只與酶的性質(zhì)有關(guān)，與酶的濃度無(wú)關(guān)。不同的酶Km值不同P248 表4-5 一些酶的Km值。3、Km與天然底物如果一個(gè)酶有幾種底物，則每一種底物各有一個(gè)特定的 Km,其中Km最小的底物稱該酶的最適）表示V變化越靈敏底物底物或天然底物。4、Km、Ks與底物親和力Km稱米式常數(shù)，Km= （K2+K3） / Ki ,從某種意義上講，Km是ES分解速度（K2+K3）與形成 速度（Ki）的比值，它包含ES解離趨勢(shì)（K2/K1）和產(chǎn)物形成趨勢(shì)（K3/Ki）oKs稱為底物常數(shù)，Ks=K2/Ki,它是ES的解離常數(shù)，只反映ES解離趨勢(shì)，因此，1/Ks可以 表示酶

25、與底物的親和力大?。‥S形成趨勢(shì)），不難看出，底物親和力大不一定反應(yīng)速度大（產(chǎn)物形 成趨勢(shì)，K3/K1）只有當(dāng)K2、KiK3時(shí)，Km=Ks,因此，1/Km只能近似地表示底物親和力的大小。問(wèn)題：（D Km越小，底物親和力越大（X）Ks越小，底物親和力越大（V）（3）天然底物就是親和力最大的底物（X）（4）天然底物就是Km值最小的底物（，）5、Km與米式方程的實(shí)際用途已知V求S 已知S求V相對(duì)速度（酶活性中心被占據(jù)分?jǐn)?shù) 丫）:VY V maxSKm SYS Km1 Y當(dāng)V=Vmax時(shí)，表明酶的活性部位已全部被底物占據(jù)，V與S無(wú)關(guān)，只和Et成正比。當(dāng)V=1/2 Vmax 時(shí)，表示活性部位有一半被占據(jù)

26、。設(shè)定達(dá)到最大反應(yīng)速度的倍時(shí)，所需底物濃度為SS=9Km同理有：S=4KmSmSmS=1KmS=1/9KmS /S=81S/S=21（四）Km和Vmax的求解方法1、雙倒數(shù)作圖法要從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所得到的V-S曲線來(lái)直接決定Vmax是很困難的，也不易求出Km值。由米式方程兩邊取倒數(shù)：1 Km工 1V V max S V max將實(shí)驗(yàn)所得的初速度數(shù)據(jù)v和S取倒數(shù)，得各種1/v和1/S值，將1/v對(duì)1/S作圖，得P250 圖 4-6上圖S范圍在0m,最適。若S范圍在3.3 20 Km ,直線斜率太小。若S范圍在0.033- 0.2 Km ,直線斜率太大。如當(dāng)Km=1 x 10-5mol/L時(shí)，實(shí)驗(yàn)所取底

27、物濃度范圍應(yīng)在 0.33X 10-5- x 10-5mol/L一般選底物濃度應(yīng)考慮能否得到1/S的常數(shù)增量。如當(dāng)選S為 1.01、10 時(shí)1/S為、是常數(shù)增量。反之，若選S為常數(shù)增量1.0 10時(shí)，1/S為、1.0,是非常數(shù)增量，點(diǎn)多集中在1/v軸附近。2、VV/S作圖法P250 圖 4-7三、多底物的酶促反應(yīng)前面討論的米氏方程（推導(dǎo)米氏方程時(shí)用的是單底物），適用于單底物酶促反應(yīng)，如異構(gòu)、水 解及大部分裂合反應(yīng)，不適用于多底物反應(yīng)。A、B、C表示底物，按照底物與酶的結(jié)合順序，產(chǎn)物則按它們從酶產(chǎn)復(fù)合物中釋放次序分別用P、Q、R表示。雙底物酶促反應(yīng)已知有三種機(jī)理、有序順序反應(yīng)機(jī)理底物A、B與酶結(jié)合

28、的順序是一定的，產(chǎn)物 P、Q的釋放順序也是一定的。 P251舉例：P251乙醇脫氫酶、隨機(jī)順序反應(yīng)機(jī)理底物A、B與酶結(jié)合的順序是隨機(jī)的，產(chǎn)物 P、Q的釋放順序也是隨機(jī)的。P252如糖原磷酸化酶、乒乓反應(yīng)機(jī)理先結(jié)合第一個(gè)底物A,釋放第一個(gè)產(chǎn)物P,酶的構(gòu)象發(fā)生變化，結(jié)合第二個(gè)底物 B,釋放第 個(gè)產(chǎn)物Q。P252舉例：谷丙轉(zhuǎn)氨酶四、pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響. pH影響酶活力的因素影響酶蛋白構(gòu)象，過(guò)酸或過(guò)堿會(huì)使酶變性。影響酶和底物分子解離狀態(tài)，尤其是酶活性中心的解離狀態(tài)，最終影響ES形成。影響酶和底物分子中另一些基團(tuán)解離，這些基團(tuán)的離子化狀態(tài)影響酶的專一性及活性中心構(gòu) 象。.酶的最適pH和穩(wěn)定性pH最

29、適pH :使酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大時(shí)的介質(zhì) pH o酶在試管反應(yīng)中的最適pH與它所在細(xì)胞中的生理pH不一定完全相同，為什么？幾種酶的最適pH,見(jiàn)P253表46。穩(wěn)定性pH:在一定pH范圍內(nèi)，酶不會(huì)變性失活，此范圍稱酶的穩(wěn)定性 pH。A.最適pH曲線：最適pH=6.8B.穩(wěn)定性pH曲線：pH5-8曲線B:將酶在不同pH下保溫，再調(diào)回，測(cè)定反應(yīng)速度。曲線B說(shuō)明，在pH6.88及56.8范圍內(nèi)反應(yīng)速度的降低，不是由于酶蛋白變性失活造成的， 而是由于酶或底物形成了不正常的解離，而在 pH 8和pH5范圍，則是由兩種因素共同作用的 結(jié)果。雖然大部分酶的pH一酶活曲線是鐘形，但也有半鐘形甚至直線形。P254

30、圖4-9酶的pH酶活曲線五、溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響。.最適溫度及影響因素溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響有兩個(gè)方面：提高溫度，加快反應(yīng)速度。提高溫度，酶變性失活。這兩種因素共同作用，在小于最適溫度時(shí)，前一種因素為主；在大于最適溫度時(shí)，后一種因素 為主。最適溫度就是這兩種因素綜合作用的結(jié)果。溫度系數(shù)Q10：溫度升高10C,反應(yīng)速度與原來(lái)的反應(yīng)速度之比，Q10一般為12。溫血?jiǎng)游锏拿?，最適溫度35 C 40C,植物酶最適溫度40 C 50C,細(xì)菌Taq DNA聚合酶70c.酶的穩(wěn)定性溫度在某一時(shí)間范圍內(nèi)，酶活性不降低的最高溫度稱該酶的穩(wěn)定性溫度。酶的穩(wěn)定性溫度有一定的時(shí)間限制。穩(wěn)定性溫度范圍的確定方法：

31、將酶分別在不同溫度下預(yù)保溫一定時(shí)間，然后回到較低溫度（即 酶的熱變性失活作用可忽略的溫度），測(cè)酶活性。圖酶濃度高、不純、有底物、抑制劑和保護(hù)劑會(huì)使穩(wěn)定性溫度增高。酶的保存：液體酶制劑可以利用上述5種因素中的幾種，低溫（幾個(gè)月）。干粉，可在室溫下放置一段時(shí)間，長(zhǎng)期保存，應(yīng)在低溫冰箱中。六、酶濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響如果底物濃度足夠大，使酶飽和，則反應(yīng)速度與酶濃度成正比。V max SKm SVmaxK3 EK3ESKm SK3SKm SES過(guò)量且不變時(shí)，V8E。七、激活劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響凡是能提高酶活性的物質(zhì)，都稱為激活劑。activator激活劑作用包括兩種情況：一種是由于激活劑的存在，使

32、一些本來(lái)有活性的酶活性進(jìn)一步提高，這一類激活劑主要是離子 或簡(jiǎn)單有機(jī)化合物。另一種是激活酶原，無(wú)活性一有活性，這一類激活劑可能是離子或蛋白質(zhì)。1、無(wú)機(jī)離子的激活作用(1)金屬離子：K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe 2+、Ca2+(2)陰離子：cl-、Br-(3)氫離子許多金屬離子是酶的輔助因子，是酶的組成成分，參與催化反應(yīng)中的電子傳遞。有些金屬離子可與酶分子肽鏈上側(cè)鏈基團(tuán)結(jié)合，穩(wěn)定酶分子的活性構(gòu)象。有的金屬離子通過(guò)生成螯合物，在酶與底物結(jié)合中起橋梁作用。注意：(1)無(wú)機(jī)離子的激活作用具有選擇性，不同的離子激活不同的酶。(2)不同離子之間有拮抗作用，如 Na+與K+、Mg+與Ca+, !

33、Mg+與Zn+?？商娲?。(3)激活劑的濃度要適中，過(guò)高往往有抑制作用，150mM2、簡(jiǎn)單有機(jī)分子的激活作用還原劑(如Cys、還原型谷胱甘肽)能激活某些活性中心含有一 SH的酶。金屬螯合劑(EDTA)能去除酶中重金屬離子，解除抑制作用。八、抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響酶是protein ,凡可使酶蛋白變性而引起酶活力喪失的作用稱為酶的失活作用（不可逆抑制、可逆抑抑制作用：使酶活力下降但并不引起酶蛋白變性的作用稱為抑制作用 制）抑制劑（inhiEtor）：不引起酶蛋白變性，但能使酶分子上某些必需基團(tuán)（活性中心上一些基團(tuán)） 發(fā)生變化，引起酶活性下降，甚至喪失，此類物質(zhì)稱為酶的抑制劑。研究抑制劑對(duì)酶的作

34、用有重大的意義：（1）藥物作用機(jī)理和抑制劑型藥物的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)：抗癌藥（2）對(duì)生物體的代謝途徑進(jìn)行認(rèn)為調(diào)控，代謝控制發(fā)酵（3）研究酶的活性中心的構(gòu)象及其化學(xué)功能基團(tuán)，不僅可以設(shè)計(jì)農(nóng)藥，而且也是酶工程和化 學(xué)修飾酶、酶工業(yè)的基礎(chǔ)（一）不可逆抑制作用（非專性必、專一性）抑制劑與酶活性中心基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，使酶的活性下降，無(wú)法用透析法除去抑制劑。1、非專一性不可逆抑制劑此類抑制劑可以和一類或幾類基團(tuán)反應(yīng)。它們不但能和酶分子中的必需基團(tuán)作用，同時(shí)也能和 相應(yīng)的非必需基團(tuán)作用。（1）、?；瘎┒惐柞７ィ―FP,神經(jīng)毒氣）和許多有機(jī)磷農(nóng)藥都屬于磷?；瘎芘c酶活性中心 Ser 的一OH結(jié)合，抑制某些蛋白酶

35、及酯酶。這類化合物的作用機(jī)理是強(qiáng)烈地抑制與中樞神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān) 的乙酰膽堿脂酶，使乙酰膽堿不能分解為乙酰和膽堿。乙酰膽堿的堆積，引起一系列神經(jīng)中毒癥狀。P258結(jié)構(gòu)式：磷?；瘎┡cDFPP259反應(yīng)式：磷?；瘎┡c膽堿酯酶形成磷?；憠A酯酶解毒劑：PAM （解磷定），可以把酶上的磷酸根除去。（2）、烷化劑許多有機(jī)汞、有機(jī)種都是烷化劑，可以使酶的琉基烷化P259反應(yīng)式：對(duì)氯汞苯甲酸與琉基酶的反應(yīng)有機(jī)汞、有機(jī)種化合物和重金屬還可以與還原型硫辛酸（人體重要的輔酶）反應(yīng)解毒劑：二琉基丙醇（3）、氟化物與含鐵撲咻的酶中的Fe2+結(jié)合，阻抑細(xì)胞呼吸。1 9(4)、重金屬Ag、Cu、Hg、Cd、Pb能使大多數(shù)酶失活

36、，EDTA可解除。(5)、還原劑以二硫鍵為必需基團(tuán)的酶，可以被琉基乙醇、二硫蘇糖醇等琉基試劑還原失活。(6)、含活潑雙鍵試劑(與一SH、-NH 2反應(yīng))N一乙基順丁烯二酰亞胺圖(7)、親電試劑四硝基甲烷，可使Tyr硝基化。圖2、專一性不可逆抑制此類抑制劑僅僅和活性部位的有關(guān)基團(tuán)反應(yīng)。(1)、Ks型專一性不可逆抑制劑Ks型抑制劑不僅具有與底物相似的、可與酶結(jié)合的基團(tuán)，同時(shí)還有一個(gè)能與酶的其它基團(tuán)反應(yīng) 的活潑基團(tuán)。專一性：抑制劑與酶活性部位某基團(tuán)形成的非共價(jià)絡(luò)合物和抑制劑與非活性部位同類基團(tuán)形成 的非共價(jià)絡(luò)合物之間的解離常數(shù)不同。舉例：胰凝乳蛋白酶的Ks型不可逆抑制劑：對(duì)一甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯

37、甲烷(TPCK)與該酶的最佳 底物對(duì)-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲酯的結(jié)構(gòu)相似，都含有對(duì)-甲苯磺酰-L-苯丙氨酰基，酶通過(guò)對(duì)這個(gè)基 團(tuán)的強(qiáng)親和力，把TPCK誤認(rèn)為底物而與之結(jié)合，形成 Ks很小的非共價(jià)絡(luò)合物。酶學(xué)P119最佳底物TPCK-CH2-cl與酶活性部位的一個(gè)His-咪唾基距離很近，很易使之烷基化，而非活性部位的咪唾基， 由于遠(yuǎn)離-CH2-cl,則不被烷基化。(2)、 Kcat型專一性不可逆抑制劑這種抑制劑是根據(jù)酶的催化過(guò)程來(lái)設(shè)計(jì)的，它們與底物類似，既能與酶結(jié)合，也能被催化發(fā)生 反應(yīng)，在其分子中具有潛伏反應(yīng)基團(tuán)(latent reactive group),該基團(tuán)會(huì)被酶催化而活化，并立即

38、與酶活性中心某基團(tuán)進(jìn)行不可逆結(jié)合，使酶受抑制。此種抑制專一性強(qiáng)，又是經(jīng)酶催化后引起，被 稱為自殺性底物。舉例1:B -羥基癸酰硫酯脫水酶的Kcat型不可逆抑制劑：CH3（CH2）5-C=C-CH2-CO-S-R此酶催化的反應(yīng)：P260反應(yīng)式當(dāng)有Kcat抑制劑時(shí)，此抑制劑被催化生成連丙二烯結(jié)構(gòu)，連丙二烯易與His咪唾反應(yīng)，使酶失活。P261反應(yīng)式舉例2:以FMN （黃素單核甘酸）、FAD （黃素腺喋吟二核甘酸）為輔基的單胺氧化酶的 Kcat型不可逆 抑制劑；快類化合物。迫降靈是一種單胺氧化酶的自殺性底物，是治療高血壓的良藥。圖單胺氧化酶能氧化某些血管舒張劑（如組胺）圖由于迫降靈能抑制單胺氧化酶，

39、也就能抑制一些血管舒張劑（如組胺）的氧化，因而有降血壓 的作用。Kcat型專一性不可逆抑制劑的專一性很強(qiáng)，近來(lái)已設(shè)計(jì)出多種酶的Kcat逆制劑，在醫(yī)療方面起到很大作用。（二）可逆抑制作用 Reversible Inhibition此類抑制劑與酶蛋白的結(jié)合是可逆的，可以用透折法除去抑制劑，恢復(fù)酶的活性。1、競(jìng)爭(zhēng)性抑制（Competitive inhibition ）抑制劑與底物競(jìng)爭(zhēng)酶的活性中心。競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑具有與底物類似的結(jié)構(gòu)，可與酶形成可逆的EI復(fù)合物，阻止底物與酶結(jié)合。可以 通過(guò)增加底物濃度而解除此種抑制。P258圖4-11酶與底物及競(jìng)爭(zhēng)性、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑結(jié)合的模型舉例1:丙二酸抑制琥珀酸脫氫

40、酶舉例2:磺胺類藥物及其作用機(jī)理磺胺類藥物可以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，治療細(xì)菌引起的各種疾病?；前奉愃幬锸菍?duì)氨基苯磺酰胺或其衍生物，它是對(duì)氨基苯甲酸的結(jié)構(gòu)類似物，競(jìng)爭(zhēng)性抑制二氫葉酸合成酶P261結(jié)構(gòu)式：對(duì)氨基苯甲酸對(duì)氨基苯磺酰胺葉酸磺胺類藥物的藥理（對(duì)氨基苯磺酰胺）：喋吟核甘酸的合成必需要由四氫葉酸（輔酶）提供一碳單位；四氫葉酸可由二氫葉酸或葉酸轉(zhuǎn)化而成；二氫葉酸是在二氫葉酸合成酶作用下，利用蝶吟、對(duì)氨基苯甲酸及Glu合成。動(dòng)物體內(nèi)的葉酸可從食物中獲取，細(xì)菌體內(nèi)的葉酸只能在二氫葉酸合成酶作用下，利用對(duì)氨基 苯甲酸合成。如果動(dòng)物體內(nèi)含有大量的對(duì)氨基苯磺酰胺，可與對(duì)氨基苯甲酸競(jìng)爭(zhēng)二氫葉酸合成酶的活性中

41、 心，抑制細(xì)菌二氫葉酸合成。2、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制特點(diǎn)：抑制劑與酶活性中的以外的基團(tuán)結(jié)合，具結(jié)構(gòu)可能與底物無(wú)關(guān)。酶可以同時(shí)與底物及抑制劑結(jié)合，但是，中間產(chǎn)物 ESI不能進(jìn)一步分解為產(chǎn)物，因此，酶的活 性降低。顯然，不能通過(guò)增加底物的濃度的辦法來(lái)消除非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑多是與酶活性中心之外的琉基可逆結(jié)合，包括某些含金屬離子的化合物（Cu2+、Hg2+、Ag+）和 EDTA,。3、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制酶只有在與底物結(jié)合后，才能與抑制劑結(jié)合。 E+S-ES+I*P（三）可逆抑制作用的動(dòng)力學(xué)用書(shū)上P263-266的方法可推出三種抑制方程。1、競(jìng)爭(zhēng)性抑制：動(dòng)力學(xué)方程：V max SV HTKm(1 )SK

42、i工小(1 I)11V V max S V max競(jìng)爭(zhēng)性抑制曲線:P263圖4-12競(jìng)爭(zhēng)性抑制曲線競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用小結(jié)：(1) Vmax不變，Km變大。要達(dá)到同一個(gè)給定的 Vmax分?jǐn)?shù)，必須要有比無(wú)抑制劑時(shí)大得多的 底物濃度。(2)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)的抑制程度，決定于I、S、Km和KiI一定，增加S,可減少抑制程度。S一定，增加I,可增加抑制程度(Km，增加)。Ki值較低時(shí)，任何給定I和S,抑制程度都較大，Ki越大，抑制作用越小。I=K i時(shí)，所作雙倒數(shù)圖直線的斜率加倍。E.在一定S、I下，Km值愈低,抑制程度愈小。2、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)力學(xué)方程：V max1 .!SVKKmS相對(duì)速度：Ki a

43、Ki I抑制分?jǐn)?shù)：.KiIi 1Ki IKi I非競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線：P265 圖 4-13非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑可使酶促反應(yīng)的 Vmax降至Vmax/ (1+I/Ki),而對(duì)Km無(wú)影響。它對(duì)酶促反應(yīng)的 抑制程度決定于I和Ki ,與酶的Km和S無(wú)關(guān)。3、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)力學(xué)方程：相對(duì)速度:抑制分?jǐn)?shù):P265 圖4-14反競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線在反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用下，Km及Vmax都變小，且Km KP266表4-7小結(jié)：三種可逆抑制作用的酶促反應(yīng)速度 V與Km值九、有機(jī)介質(zhì)中的酶促反應(yīng)（只是一部分酶）傳統(tǒng)觀點(diǎn)：酶是水溶性生物大分子，只能在水介質(zhì)中進(jìn)行催化反應(yīng)，有機(jī)介質(zhì)會(huì)使酶變性。其實(shí)在細(xì)胞中，許多生物膜上的酶就是在低極性的

44、微環(huán)境中發(fā)揮催化功能的。優(yōu)點(diǎn)：利于疏水性底物的反應(yīng)。可提高酶的熱穩(wěn)定性，提高催化溫度。能催化在水中不能進(jìn)行的反應(yīng)?？筛淖兎磻?yīng)平衡移動(dòng)方向?？煽刂频孜飳Ｒ恍?。防止由水引起的副反應(yīng)。可擴(kuò)大pH值的適應(yīng)性等等。1、有機(jī)介質(zhì)中酶促反應(yīng)的條件（1）、 必需水（結(jié)合水）酶催化活性所必需的構(gòu)象，是由水分子直接或間接地通過(guò)氫鍵等非共價(jià)相互作用來(lái)維持的，因 此只有與酶分子緊密結(jié)合的單層水分子，對(duì)酶的催化活性才是至關(guān)重要的。這緊緊吸附在酶分子表面，維持酶催化活性所必需的最少量的水稱為必需水（或結(jié)合水、束縛 水）0酶的活性由必需水決定，而與溶劑里的水含量無(wú)關(guān)，只要必需水不丟失，其它大部分水即使都 被有機(jī)溶劑取代，酶

45、仍然保持其催化活性。因此，可把有機(jī)介質(zhì)中酶促反應(yīng)理解為宏觀上是在有機(jī)介質(zhì)中，而在微觀上仍是水中的酶促反 應(yīng)。正因如此，才能使用有機(jī)介質(zhì)代替水溶液，進(jìn)行酶促反應(yīng)。一個(gè)干燥的酶水合：吸附水量：酶分子表面電荷基團(tuán)：（水順）酶分子表面極性基團(tuán)：弱極性、非極性基團(tuán)：表面完全水化，被一層水分子包圍。酶的必需水含量因酶而異。脂肪酶：幾個(gè)水分子/每個(gè)酶分子胰凝乳蛋白酶：50個(gè)水分子/每個(gè)酶分子乙醇脫氫酶：幾百個(gè)水分子/每個(gè)酶分子(2)、對(duì)酶的要求具有對(duì)抗有機(jī)介質(zhì)變性的經(jīng)能力。(3)、合適的溶劑及反應(yīng)體系(4)、合適的pH保證有機(jī)介質(zhì)中酶的微環(huán)境具有最適pH值。酶應(yīng)從具有最適pH值的緩沖液中凍干或沉淀出來(lái)。2、

46、有機(jī)介質(zhì)對(duì)酶性質(zhì)的影響(1)、穩(wěn)定性大多數(shù)酶在低水有機(jī)介質(zhì)中比在水介質(zhì)中更穩(wěn)定。a.熱穩(wěn)定性提高例如：豬胰脂肪酶在醇和酯中進(jìn)行催化反應(yīng)，在 100c半衰期長(zhǎng)達(dá)12h,其活性比25c時(shí)還高 幾倍b.儲(chǔ)存穩(wěn)定性提高胰凝乳蛋白酶在20c時(shí)，在水中半衰期只幾天。在辛烷中，可放 6個(gè)月，仍保持全部活性。(2)、活性有兩類影響升高活性降低活性酶的超活性：高于水溶液中酶活性值的活性。(3)、專一性某些有機(jī)溶劑會(huì)使某些酶的專一性發(fā)生變化，如脂肪酶在有機(jī)介質(zhì)中有合成肽鍵的功能。星號(hào) 活力(第二活力)。(4)、反應(yīng)平衡有機(jī)介質(zhì)能改變某些酶催化的反應(yīng)平衡。例如：水解酶類(蛋白水解酶)在水介質(zhì)中，水的濃度為，平衡趨向

47、水解方向，如在含水量極低的有機(jī)介質(zhì)中，平衡向含成方向偏移實(shí)例：（酶）合成）產(chǎn)物溶劑合成收率枯草桿菌蛋白酶核糖核酸酶甘油90%50%無(wú)色桿菌蛋白酶胰島素乙醇30%80%凝血酶人生長(zhǎng)素甘油80%20%（5）、分子印跡和pH記憶酶在凍干前可用配體作印跡。競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可誘導(dǎo)酶活性中心構(gòu)象發(fā)生變化，形成一種高活性構(gòu)象，而此種構(gòu)象在除去抑 制劑后，因酶在有機(jī)介質(zhì)中的高度剛性而得到保持。pH記憶：酶在有機(jī)介質(zhì)中能“記住”它最后存在過(guò)的水溶液的pH值，因該pH值決定了酶分子上有關(guān)基 團(tuán)的解離狀態(tài)，這種狀態(tài)在凍干過(guò)程和分散到有機(jī)介質(zhì)中之后仍得到保持。第四節(jié)酶的作用機(jī)理一、專一性的機(jī)理（一）酶專一性類型一般說(shuō)來(lái)

48、，一種分子能成為某種酶的底物，必須具備兩個(gè)條件：分子上有被酶作用的化學(xué)鍵。分子上有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合基團(tuán)能與酶活性中心結(jié)合。1、結(jié)構(gòu)專一性（1）、鍵專一性（對(duì)底物結(jié)構(gòu)要求最低）酶只對(duì)其作用的的鍵有要求，而對(duì)鍵兩側(cè)基因無(wú)特殊要求。如：酯酶可催化酯鍵水解，RCOOR,對(duì)R和R無(wú)要求，但不同底物水解速度不同。又 如：磷酸酯酶可水解各種磷酸酯分子。（2）、基團(tuán)專一性 Group Specificity酶不僅對(duì)鍵有要求，還對(duì)鍵一端的基團(tuán)有要求，但對(duì)另一端基團(tuán)要求不嚴(yán)格。如：lDGlc昔酶，不僅要求作用的鍵是 l糖昔鍵，且要求此鍵一端必須是 Glc殘基，對(duì) 此鍵另一端基團(tuán)無(wú)要求，如此酶可水解蔗糖和麥芽糖。以上

49、（1）、（2）兩類稱為相對(duì)專一性P268表4 9消化道中蛋白酶的專一性(3)、絕對(duì)專一性酶只能作用于一個(gè)底物，或只催化一個(gè)反應(yīng)。如：大麥芽中的麥芽糖酶只作用于麥芽糖，月尿酶只催化尿素水解。2、立體異構(gòu)專一性（1）、旋光異構(gòu)專一性當(dāng)?shù)孜锞哂行猱悩?gòu)體時(shí)，酶只能作用于其中的一種異構(gòu)體，它是酶促反應(yīng)中相當(dāng)普遍的現(xiàn)象。 如：Glu脫氫酶只作用LGlu,乳酸脫氫酶只作用L一乳酸。（2）、幾何異構(gòu)專一性順式反式異構(gòu)體。如：反丁烯二酸水化酶只催化反丁烯二酸生成蘋果酸，對(duì)順丁烯二酸無(wú)作用。立體化學(xué)專一性還表現(xiàn)在酶能區(qū)分從有機(jī)化學(xué)觀點(diǎn)看屬于對(duì)稱分子中的兩個(gè)等同的基團(tuán)，只催 化其中一個(gè)，而對(duì)另一個(gè)無(wú)作用。例如：a

50、.甘油在甘油激酶的催化下只有一個(gè) CH20H基能被磷酸化。b.糖代謝中的順一烏頭酸酶作用于檸檬酸時(shí)，兩個(gè) CH2C00H對(duì)酶來(lái)說(shuō)是不同的。圖立體專一性在實(shí)踐中的應(yīng)用：（1）藥物的構(gòu)效關(guān)系（2）立體異構(gòu)性藥物和其它化合物的酶法不對(duì)稱合成或拆分。用乙?；钢苽銵氨基酸：有機(jī)合成的D、L乙酸化，然后用乙?；甘筁水解出來(lái)。（二）酶作用專一性的解釋1、三點(diǎn)結(jié)合及鎖鑰模型（剛性模板學(xué)說(shuō)）底物結(jié)合部位由酶分子表面的凹槽或空穴組成，這是酶的活性中心，它的形狀與底物分子形狀 互補(bǔ)。底物分子或其一部分像鑰匙一樣，可專一地插入酶活性中心，通過(guò)多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合，形 成酶一底物復(fù)合物，同時(shí)酶活性中心的催化基團(tuán)正好對(duì)

51、準(zhǔn)底物的有關(guān)敏感鍵，進(jìn)行催化反應(yīng)。三點(diǎn)結(jié)合學(xué)說(shuō)指出，底物分子與酶活性中心的基團(tuán)必須三點(diǎn)都互補(bǔ)匹配，酶才作用于這個(gè)底物P27R 圖 416、417剛性模板學(xué)說(shuō)較好地解釋了立體專一性，但不能解釋酶專一性中所有的現(xiàn)象，如既能催化正反 應(yīng)，又能催化逆反應(yīng)；那么，酶的結(jié)構(gòu)不可能既適合于底物又適合于產(chǎn)物2、誘導(dǎo)楔合模型酶分子與底物分子接近時(shí)，酶蛋白質(zhì)受底物分子誘導(dǎo)，構(gòu)象發(fā)生有利于與底物結(jié)合的變化，酶 與底物在此基礎(chǔ)上互補(bǔ)楔合，進(jìn)行反應(yīng)。P271圖 418二、高效性的機(jī)理1、鄰近效應(yīng)與定向效應(yīng)酶把底物分子（一種或兩種）從溶液中富集出來(lái)，使它們固定在活性中心附近，反應(yīng)基團(tuán)相互 鄰近，同時(shí)使反應(yīng)基團(tuán)的分子軌道以

52、正確方位相互交疊，反應(yīng)易于發(fā)生。兩種效應(yīng)對(duì)反應(yīng)速度的影響使底物濃度在活性中心附近很高甚至比溶液中高10萬(wàn)倍，提高反應(yīng)速度。酶對(duì)底物分子的電子軌道具有導(dǎo)向作用舉例：酚羥基和竣基環(huán)化成內(nèi)酸圖3個(gè)CH3固定了 -OH和-COOH的相對(duì)方位。酶使分子間反應(yīng)轉(zhuǎn)變成分子內(nèi)反應(yīng)反應(yīng)速度提高：107圖鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)對(duì)底物起固定作用酶底復(fù)合物壽命比一般雙分子相互碰撞的平均壽命長(zhǎng)，前者 10-7-10-4秒，后者10-13秒，增大了 產(chǎn)物形成的機(jī)率。2、扭曲變形和構(gòu)象變化的催化效應(yīng)酶中某些基團(tuán)可使底物分子的敏感鍵中某些基團(tuán)的電子云密度變化，產(chǎn)生電子張力。P276 圖 4-20環(huán)狀反應(yīng)物I水解開(kāi)環(huán)，環(huán)扭曲能量大

53、量釋放，加速反應(yīng)。底物與酶蛋白接觸，加速反應(yīng)。酶從低活性形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚孕问降孜锱で?、變形底物?gòu)象變化，變得更像過(guò)度態(tài)結(jié)構(gòu)，大大降低活化能。2 83、共價(jià)催化酶作為親核基團(tuán)或親電基團(tuán)，與底物形成一個(gè)反應(yīng)活性很高的共價(jià)中間物，此中間物易變成過(guò) 渡態(tài)，反應(yīng)活化能大大降低，提高反應(yīng)速度。親核共價(jià)催化絲氨酸羥基、Cys的-SH、His的咪唾基。舉例：咪唾基催化對(duì)硝基苯乙酸酯水解。圖親電共價(jià)催化親電基團(tuán)攻擊底物的富電子基團(tuán)例：Asp轉(zhuǎn)氨酶催化Asp轉(zhuǎn)氨反應(yīng)圖P278表4-13形成共價(jià)ES復(fù)合物的某些酶4、酸堿催化酶分子的一些功能基團(tuán)起質(zhì)子供體或質(zhì)子受體的作用。參與酸堿催化的基團(tuán)：氨基、竣基、筑基、酚羥基

54、、咪唾基。P279表4-14酶分子中可作為廣義酸堿的功能基團(tuán)影響酸堿催化反應(yīng)速度的兩個(gè)因素酸堿強(qiáng)度，咪唾基在pH6附近給出質(zhì)子和結(jié)合質(zhì)子能力相同，是最活潑的催化基團(tuán)。給出質(zhì)子或結(jié)合質(zhì)子的速度，咪晚基最快酸催化酯、酰胺和肽的水解 圖過(guò)程：共腕酸與C=0氧形成氫鍵，使C=0碳帶更多正電荷，更易吸引H2O分子上的氧，降 低C=0碳與H2O氧形成共價(jià)鍵的活化能；接著，共腕酸將 H+轉(zhuǎn)移給C=0氧，自己成為共腕堿， 并從H2O分子吸引一個(gè)H+,回復(fù)原狀。堿催化酯、酰胺水解圖過(guò)程：共腕堿先與H2O中H形成氫鍵，使H2O中氧的電負(fù)性增強(qiáng)，更易對(duì) C=0碳進(jìn)行親核 進(jìn)攻，降低碳氧鍵生成的活化能。5、活性中心的

55、微環(huán)境疏水環(huán)境酶活性中心附近往往是疏水的，介電常數(shù)低，可加強(qiáng)極性基團(tuán)間的反應(yīng)。電荷環(huán)境在酶活性中心附近，往往有一電荷離子，可穩(wěn)定過(guò)渡態(tài)的離子，增加酶促反應(yīng)速度。如溶菌酶 Asp52帶負(fù)電荷，可以穩(wěn)定過(guò)渡態(tài)的正離子。酶催化反應(yīng)的高效性，可能是由于以上五種因素中的幾種因素協(xié)同作用的結(jié)果，而非酶催化反 應(yīng)往往只有一種催化機(jī)制。三、某些酶的活性中心及其作用機(jī)理(一)酶的活性中心1、活性中心的概念對(duì)于不需要輔酶的酶來(lái)說(shuō)，活性中心就是酶分子在三維結(jié)構(gòu)上比較靠近的少數(shù)幾個(gè)氨基酸殘基 或是這些殘基的某些基團(tuán)，它們?cè)谝患?jí)結(jié)構(gòu)上相距可能很遠(yuǎn)，通過(guò)肽鏈的盤繞、折疊而在空間構(gòu)象 上相互靠近。對(duì)于需要輔酶的酶來(lái)說(shuō)，輔酶

56、分子或輔酶分子的某一部分結(jié)構(gòu)往往就是活性中心的組成部分。一般認(rèn)為，活性中心有兩個(gè)功能部位：底物結(jié)合部位，催化部位活性中心外的部位為活性中心的形成提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。2、活性中心的氨基酸殘基有七種a.a在酶活性中心出現(xiàn)的頻率最高，它們是 Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。活性中心的a.a殘基往往分散在相互較遠(yuǎn)的a.a順序中，有的甚至分散在不同的肽鏈上，如a - 胰凝乳蛋白酶活性中心的幾個(gè)a.a殘基，分別位于B、C兩個(gè)肽鏈上，靠分子空間結(jié)構(gòu)的形成，集中 在酶分子特定區(qū)域，成為具有催化功能的活性中心。酶分子a.a殘基分類(1)接觸殘基它們與底物接觸，參與底物的化學(xué)轉(zhuǎn)變，此類 a.a

57、殘基的一個(gè)或幾個(gè)原子與底物分子中一個(gè)或 幾個(gè)原子的距離都在一個(gè)鍵距離之內(nèi)()。它們的側(cè)鏈起與底物結(jié)合作用的稱為結(jié)合基團(tuán)，起催化作用的稱為催化基團(tuán)。(2)輔助殘基它不與底物接觸，而是在使酶與底物結(jié)合及協(xié)助接觸殘基發(fā)揮作用方面起作用。上述兩類殘基構(gòu)成酶活性中心。(3)結(jié)構(gòu)殘基在維持酶分子正常三維構(gòu)象方面起重要作用，它們與酶活性相關(guān)，但不在酶活性中心范圍內(nèi)，屬于酶活性中心以外的必需殘基上述三類殘基統(tǒng)稱酶的必需基團(tuán)，若被其它 a.a取代，往往造成酶失活。（4）非貢獻(xiàn)殘基（非必需基團(tuán)）它們對(duì)酶活性的顯示不起作用，可由其它 a.a代替，且在酶分子中占很大比例 它們可能在免疫，酶活性調(diào)節(jié)，運(yùn)輸轉(zhuǎn)移，防止降解

58、等方面起作用。結(jié)合底物作用（結(jié)合殘基），接觸殘基“活性中心 催化作用（催化基團(tuán)） 必需基M輔助殘基I1活性中心外（結(jié)構(gòu)殘基）酶蛋白、 非必需基團(tuán)3、活性中心區(qū)域的一級(jí)結(jié)構(gòu)由于一些酶的活性中心一級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)與催化機(jī)理極其相似，可把它們歸為一族。蛋白水解酶就有幾個(gè)族：（1）絲氨酸蛋白酶（胰凝乳蛋白酶、胰乳蛋白酶、彈性蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶等）（2）鋅蛋白酶（竣肽酶等）（3）筑基蛋白酶（木瓜蛋白酶等）（4）竣基蛋白酶（胃蛋白酶等）在同一族酶中，活性中心一級(jí)結(jié)構(gòu)的a.a順序極相似。酶a.a順序胰蛋白酶（牛）Asp-Ser-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Val-Val-C

59、ys-Ser-Gly-Lys胰凝乳蛋白酶（牛）Ser-Ser-Cys-Met-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-Val-Cys-Lys- Lys-Asn彈性蛋白酶（豬）Ser-Gly-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-His-Cys-Leu-Val-Asn凝血酶（牛）Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Se-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro這4個(gè)源于哺乳動(dòng)物的酶活性中心，都含有一個(gè)包括Ser在內(nèi)的完全相同的六肽：Gly-Asp-網(wǎng)Gly-Gly-Pro 同源的趨異進(jìn)化來(lái)自胰臟的胰凝乳蛋

60、白酶（Phe Tyr、Trp、）、胰蛋白酶（Lys、Arg ）和彈性蛋白酶（疏水 殘基），活性中心Ser附近的a.a順序相同，且分子一級(jí)結(jié)構(gòu)中有40%a.a順序相同，三維結(jié)構(gòu)也相同， 表明它們起源于共同的祖先，但是它們的底物專一性不同。這種來(lái)源于共同祖先，經(jīng)基因突變而得出不同專一性的結(jié)果稱為同源的趨異進(jìn)化。 異源的趨同進(jìn)化來(lái)自枯草桿菌的Ser蛋白酶的結(jié)構(gòu)與上述三種酶很不同，且活性中心Ser附近的a.a順序也不同 （-Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Ser）。電荷中繼網(wǎng)的位置也不同：Asp102-His57-Ser195 （胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶）Asp32-His64-Ser22i