園藝植物生物技術(shù)(理論課教案)-河南科技學(xué)院漢語(yǔ)

1、Biotechnology of Horticultural Plant園藝植物生物技術(shù)理論課教案河南科技學(xué)院園藝林學(xué)學(xué)院2021河南科技學(xué)院教案首頁(yè) 授課時(shí)間 2021年3-7月 教案編寫(xiě)時(shí)間 2021年7月 課程名稱園藝植物生物技術(shù)課程編號(hào)1306102040總學(xué)時(shí) 64講課： 40 學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)： 24 學(xué)時(shí)實(shí)習(xí)： 0學(xué)時(shí)學(xué) 分 數(shù)4課型必修課 選修課 理論課 實(shí)驗(yàn)課 任課教師李桂榮、杜曉華、姜立娜職稱教授博士、副教授博士、副教授博士授課對(duì)象2021班級(jí) 園藝 專業(yè) 1、2班根本教材或主要參考書(shū)園藝植物生物技術(shù)，鞏振輝主編 科學(xué)出版社 2021H.S.喬拉 植物生物技術(shù)導(dǎo)論(影印本) 科學(xué)出

2、版社 2004H.S.喬拉 植物生物技術(shù)導(dǎo)論(許亦農(nóng) 麻密 譯) 化學(xué)工業(yè)出版社 2005園藝植物生物技術(shù)，鄧秀新、胡春根主編。高等教育出版社 2005教學(xué)目的與要求本課程的任務(wù)是使學(xué)生了解現(xiàn)代生物技術(shù)的開(kāi)展概況和趨勢(shì)，掌握?qǐng)@藝植物的組織培養(yǎng)根本技術(shù)、脫毒快繁技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交技術(shù)、基因別離及遺傳轉(zhuǎn)化的根本原理和技術(shù)，以及DNA標(biāo)記技術(shù)，為將來(lái)從事園藝植物生物技術(shù)相關(guān)研究及其產(chǎn)業(yè)應(yīng)用奠定良好的理論和技術(shù)根底。教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)重點(diǎn)：生物技術(shù)的概念/應(yīng)用現(xiàn)狀、組織培養(yǎng)技術(shù)、病毒病脫除與無(wú)病毒繁殖難點(diǎn)：原生質(zhì)體操作技術(shù)、基因別離克隆、轉(zhuǎn)基因技術(shù)教學(xué)進(jìn)程第 次課12-45-78-101112-1

3、314-171819-20授課章節(jié)40學(xué)時(shí) Theory part40 hs1) Introduction2) Tissue culture of horticulture plant3) 園藝植物脫毒與離體快繁技術(shù)4)園藝植物細(xì)胞工程5)園藝植物染色體工程6)植物基因工程的根底知識(shí)與技術(shù)7)園藝植物基因的別離、克隆與遺傳轉(zhuǎn)化8)轉(zhuǎn)基因技術(shù)在園藝植物育種上的應(yīng)用9) 園藝植物的分子標(biāo)記學(xué) 時(shí)266624824備 注本課程采用多媒體課件教學(xué)4次實(shí)驗(yàn)課，分別為園藝植物組織培養(yǎng)技術(shù)10學(xué)時(shí)、園藝植物染色體工程4學(xué)時(shí)、DNA鑒定及分子標(biāo)記技術(shù)10學(xué)時(shí)。河南科技學(xué)院教案課時(shí)備課 第 1 次課 2 學(xué)時(shí)章

4、節(jié)第一章 緒論主要參考資料1鞏振輝主編，園藝植物生物技術(shù)，科學(xué)出版社，20212，植物生物技術(shù)導(dǎo)論(影印本)，科學(xué)出版社，20043，植物生物技術(shù)導(dǎo)論(許亦農(nóng) 麻密 譯)，化學(xué)工業(yè)出版社，20054鄧秀新、胡春根主編，園藝植物生物技術(shù)，高等教育出版社，2005教學(xué)目的和要求1掌握?qǐng)@藝植物生物技術(shù)的概念、內(nèi)容、園藝植物生物技術(shù)的應(yīng)用2熟悉園藝植物生物技術(shù)的開(kāi)展歷程3了解園藝植物生物技術(shù)的開(kāi)展歷程重 點(diǎn)難 點(diǎn)1重點(diǎn)：生物技術(shù)的內(nèi)涵2難點(diǎn)：生物技術(shù)的實(shí)際操作教學(xué)內(nèi)容一、生物技術(shù)的概念1.以現(xiàn)代生物學(xué)理論為根底，以基因工程為核心的一系列技術(shù)的總稱。2.狹義的植物生物技術(shù)：在離體條件下，對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行遺

5、傳改進(jìn)或使其增殖的各種技術(shù)的總稱，包括細(xì)胞水平、分子水平兩個(gè)大的層面。“Biotechnology means any technological application that uses biological systems, living organisms, or derivatives thereof, to make, or modify products or processes for specific use.二、生物技術(shù)類型三、生物技術(shù)的主要內(nèi)容四、園藝植物生物技術(shù)的開(kāi)展簡(jiǎn)史一組織和細(xì)胞培養(yǎng)是園藝植物生物技術(shù)的平臺(tái) 1838-1839年，Schleiden和Schuwann

6、提出植物和動(dòng)物均由細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞進(jìn)行分裂而增多，并組建成生物體的“細(xì)胞學(xué)說(shuō)；同時(shí)指出，假設(shè)提供的條件同在活體內(nèi)一樣，每個(gè)細(xì)胞應(yīng)該能獨(dú)立生存和開(kāi)展。1898年德國(guó)植物生理學(xué)家Haberlandt試圖通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明該學(xué)說(shuō)，于1902年發(fā)表了植物細(xì)胞培養(yǎng)方面的第一篇論文，提出了植物細(xì)胞全能性Totipotency的概念。這一概念是指植物的每一個(gè)細(xì)胞在一定條件下，具有發(fā)育成一棵完整植株的能力。這一概念直到1971年煙草單細(xì)胞培養(yǎng)成功才得到完全證明并成為理論。1943年，White出版了?植物組織培養(yǎng)手冊(cè)?。1958年，Steward從煙草髓細(xì)胞培養(yǎng)出完整植株，向證明細(xì)胞全能性邁進(jìn)了一大步。該結(jié)果促進(jìn)了多

7、細(xì)胞組織和器官的培養(yǎng)研究與應(yīng)用。1960年Morel培養(yǎng)蘭花莖尖獲得再生植株，并證明脫除了病毒。該結(jié)果催生了蘭花工業(yè)的開(kāi)展。直到今天，世界蘭花種苗根本上通過(guò)組織培養(yǎng)生產(chǎn)。同年，Cocking通過(guò)酶解法從植物組織中別離得到去除了細(xì)胞壁的原生質(zhì)體，使組織培養(yǎng)技術(shù)又向前邁進(jìn)了一步。 1962年，Murashige和Skoog發(fā)表了促進(jìn)煙草快速生長(zhǎng)的培養(yǎng)基配方，即今天十分流行的MS培養(yǎng)基。 1964年，Guha和Maheshwari成功地從蔓陀蘿花藥培養(yǎng)得到再生植株，開(kāi)創(chuàng)了花藥培養(yǎng)獲得單倍體的先河。 1971年，Takebe等報(bào)道了煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)成為完整植株，至此，植物細(xì)胞全能性得到完全證明。次年，

8、Carlson獲得煙草兩個(gè)種間的原生質(zhì)體融合再生的體細(xì)胞雜種植株。 植株組織培養(yǎng)的開(kāi)展得益于兩個(gè)方面的進(jìn)展。一是對(duì)植物激素(plant hormone)的認(rèn)識(shí)，以及人工合成激素生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，plant growth regulator，PGR的生產(chǎn)和應(yīng)用，促進(jìn)了植物組織培養(yǎng)技術(shù)的開(kāi)展。1934年Went發(fā)現(xiàn)了植物生長(zhǎng)素；1956年Miller發(fā)現(xiàn)細(xì)胞沖動(dòng)素。正是這些發(fā)現(xiàn)帶動(dòng)了植物組織培養(yǎng)技術(shù)的開(kāi)展。今天，組織培養(yǎng)研究多數(shù)情況下是在摸索激素配比，也說(shuō)明了植物激素研究對(duì)組織培養(yǎng)的重要性。二是植物營(yíng)養(yǎng)學(xué)科的開(kāi)展。人們認(rèn)識(shí)了植物生長(zhǎng)必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，利用該學(xué)科的成就，不斷改進(jìn)培養(yǎng)基配方，使得組織培養(yǎng)技術(shù)得

9、到迅速普及。植物組織培養(yǎng)技術(shù)的開(kāi)展和成熟，有了一個(gè)離體無(wú)菌的技術(shù)平臺(tái)，人們才有可能進(jìn)行今天的轉(zhuǎn)基因研究，才會(huì)有今天依賴離體培養(yǎng)的諸多技術(shù)的產(chǎn)生，如快繁技術(shù)，離體保存、莖尖微芽嫁接脫除病毒技術(shù)等?？梢哉f(shuō)，組織培養(yǎng)技術(shù)是植物生物技術(shù)的根本平臺(tái)，一個(gè)作物組織培養(yǎng)技術(shù)的成熟程度可以影響其基因工程的進(jìn)展。二基因工程技術(shù)是未來(lái)園藝植物生物技術(shù)的核心基因工程技術(shù)的開(kāi)展以20世紀(jì)70年代DNA重組技術(shù)的建立為標(biāo)志。人們把1953年Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，作為分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的里程碑。與組織培養(yǎng)技術(shù)的開(kāi)展歷程類似，基因工程技術(shù)的開(kāi)展得益于生物化學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)等多個(gè)學(xué)科的開(kāi)

10、展。1983年，世界上首批轉(zhuǎn)基因煙草和馬鈴薯問(wèn)世；1986年，首批轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)入田間實(shí)驗(yàn)；1993年，轉(zhuǎn)基因番茄在美國(guó)面市。盡管轉(zhuǎn)基因番茄沒(méi)有在美國(guó)得到大面積推廣應(yīng)用，但轉(zhuǎn)抗除草劑的大豆、轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因的玉米在美國(guó)等國(guó)家大面積推廣，產(chǎn)品已銷往世界許多國(guó)家。五、園藝植物生物技術(shù)的展望1. 脫毒與快繁技術(shù)廣泛用于園藝作物種苗的生產(chǎn)2. 花藥培養(yǎng)以及小孢子培養(yǎng)是獲得單倍體以及純合二倍體材料的最正確途徑3. 胚搶救技術(shù)克服了果樹(shù)早熟品種選育的技術(shù)難題4. 細(xì)胞融合技術(shù)創(chuàng)造出200多例柑橘體細(xì)胞雜種5.分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于育種和資源研究6.基因克隆與遺傳轉(zhuǎn)化方興未艾作業(yè)布置1.生物技術(shù)包括哪些內(nèi)容？課后自我總

11、結(jié)分析緒論應(yīng)講得宏觀一些，主要激發(fā)同學(xué)們對(duì)該課程和專業(yè)的學(xué)習(xí)興趣。河南科技學(xué)院教案課時(shí)備課 第 2-4 次課 6學(xué)時(shí)章節(jié)第二章 園藝植物組織培養(yǎng)的理論根底與根本技術(shù)主要參考資料1鞏振輝、申書(shū)興主編，植物組織培養(yǎng)，化學(xué)工業(yè)出版社，20072雷特迪亞、克里斯蒂森，生物技術(shù)導(dǎo)論，科學(xué)出版社，20023李浚明、朱登云編譯，植物組織培養(yǎng)教程(第3版)，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，20214鄧秀新、胡春根主編，園藝植物生物技術(shù)，高等教育出版社，20055郭仰東主編，植物細(xì)胞組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)教程，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，20216胡桂兵主編，園藝植物生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2021教學(xué)目的和要求1掌握植物組織培養(yǎng)

12、的原理與技術(shù)2了解植物組織培養(yǎng)技術(shù)在園藝生產(chǎn)與品種改進(jìn)中的應(yīng)用現(xiàn)狀與前景重 點(diǎn)難 點(diǎn)1重點(diǎn)：掌握植物組織培養(yǎng)操作技術(shù)2難點(diǎn)：組織培養(yǎng)技術(shù)的無(wú)菌操作教學(xué)內(nèi)容第一節(jié) 概述一、園藝植物組織培養(yǎng)的概念和類型一根本概念組織培養(yǎng)二園藝植物組織培養(yǎng)類型1.培養(yǎng)材料2.培養(yǎng)基3.培養(yǎng)方式二、園藝植物組織培養(yǎng)的理論根底Basis for cell culture1.細(xì)胞是生物有機(jī)體的根本結(jié)構(gòu)單位，特別是植物細(xì)胞又是在生理上發(fā)育上具有潛在全能性的單位。2.細(xì)胞分化和形態(tài)建成1合子胚的發(fā)育，經(jīng)歷生長(zhǎng)和分化過(guò)程，生長(zhǎng)為完整結(jié)構(gòu)的有機(jī)體；2體細(xì)胞生長(zhǎng)類似，開(kāi)始是進(jìn)行生長(zhǎng)。從一個(gè)分化的有專一功能的細(xì)胞，要表現(xiàn)它的全能性，

13、首先要經(jīng)過(guò)去分化脫分化的過(guò)程，改變細(xì)胞原來(lái)的結(jié)構(gòu)、功能，而回復(fù)到無(wú)結(jié)構(gòu)的分生組織狀態(tài)，即愈傷組織狀態(tài)。愈傷組織分生細(xì)胞團(tuán)再分化，進(jìn)行形態(tài)建成，而產(chǎn)生完整植株。體細(xì)胞胚胎發(fā)生胚狀體可從以下幾種培養(yǎng)物中產(chǎn)生：直接從器官上發(fā)生；從愈傷組織上發(fā)生；從游離的單細(xì)胞發(fā)生；從小孢子發(fā)生。3.最常見(jiàn)的再分化是根的形成：3 種方式先形成根的，往往抑制芽的形成；先形成芽的，較易產(chǎn)生根；同時(shí)產(chǎn)生芽和根。三、園藝植物組織培養(yǎng)的意義1.加速無(wú)性或有性世代的繁殖，縮短育種周期或獲得新的基因。2.服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，促進(jìn)幼胚發(fā)育。3.獲得三倍體。4.快速繁殖苗木具有質(zhì)量好、體積小、便于攜帶、運(yùn)輸和交流。5.獲得無(wú)病毒苗

14、木。6.離體保存包括超低溫種質(zhì)資源四、園藝植物組織培養(yǎng)理論與技術(shù)開(kāi)展簡(jiǎn)史1. 探索階段1902年，植物生理學(xué)家德，根據(jù)細(xì)胞理論，提出：高等植物的器官和組織可以不斷分割、直至單個(gè)細(xì)胞的植物細(xì)胞全能性totipotency的理論。即植物的體細(xì)胞在適當(dāng)條件下，具有不斷分裂和繁殖，開(kāi)展成完全植株的潛在能力。2. 奠基階段3. 迅速開(kāi)展階段第二節(jié) 園藝植物組織培養(yǎng)所需的儀器及設(shè)備一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)置一根本實(shí)驗(yàn)室 準(zhǔn)備室 準(zhǔn)備室的功能就是進(jìn)行一切與實(shí)驗(yàn)有關(guān)的準(zhǔn)備工作。要求寬敞明亮，通風(fēng)條件好。 接種室 接種室的功能是進(jìn)行無(wú)菌操作。要求封閉性好，枯燥清潔，能較長(zhǎng)時(shí)間保持無(wú)菌。為了保持清潔，接種室應(yīng)防止空氣對(duì)流。

15、培養(yǎng)室 培養(yǎng)室的功能是對(duì)離體材料進(jìn)行控制培養(yǎng)。其首要要求是要能控制光照和溫度，其次為防止微生物感染，培養(yǎng)室應(yīng)保持枯燥和清潔。二輔助實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室 其功能是對(duì)培養(yǎng)材料進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定和研究。要求清潔、明亮、枯燥，使各種光學(xué)儀器不受潮濕和灰塵污染。攝影室及暗室 其功能是進(jìn)行培養(yǎng)材料的攝影記錄和膠片沖印。在有條件的情況下可建立此實(shí)驗(yàn)室。生化分析室 在以培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物為主要目的的實(shí)驗(yàn)室中，應(yīng)建立相應(yīng)的分析化驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，以便于對(duì)培養(yǎng)物的有效成分隨時(shí)進(jìn)行取樣檢查。 二、培養(yǎng)容器與用具玻璃容器塑料容器金屬用具塑料用具第三節(jié) 組織培養(yǎng)基一、培養(yǎng)基的種類和成分一培養(yǎng)基的種類1培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)最重要的基質(zhì)。2培養(yǎng)基

16、的名稱多數(shù)以發(fā)表人的名字命名，再加上年號(hào)。3國(guó)際上常用的五種培養(yǎng)基：MS：Murashige 和Skoog (1962)ER：Eriksson1965B5：Gamborg等1968SH：Shenk和Hildebrandt1972HE：Heller1953MSMurashige和Skoog 1962M6朱至清1975：用于禾本科植物花藥組織培養(yǎng)Miller1963：一般組織培養(yǎng)HBowgin和Nitsch：一般組織培養(yǎng)T一般組織培養(yǎng)White1963：一般組織培養(yǎng)B5Gamborg et al 1968一般組織培養(yǎng)C17王培等1986：小麥花藥培養(yǎng)W14歐陽(yáng)俊聞等1988：小麥花藥培養(yǎng)KM8PK

17、ao et al 1975：原生質(zhì)體培養(yǎng)Lloyd and MccounLloyd 1980：木本植物培養(yǎng)RMReinent et al 1967：蘭花4各培養(yǎng)基特點(diǎn)MS：用于煙草細(xì)胞，硝酸鹽、鉀和銨的含量比其它培養(yǎng)基高。ER：與MS相似，磷酸鹽的含量比MS高一倍，微量元素含量低得多。B5：為培養(yǎng)大豆的細(xì)胞組織設(shè)計(jì)，銨的含量低。SH：與B5相似，無(wú)機(jī)鹽的含量稍高。HE：無(wú)機(jī)鹽濃度稍低，水稻愈傷組織培養(yǎng)上使用。(二) 培養(yǎng)基成分主要為五大類：一水二無(wú)機(jī)鹽 大量元素 微量元素三有機(jī)化合物1碳水化合物2植物激素3. 維生素：維生素C、B1、B6、煙酸、葉酸、一般0.5 mg/L。4肌醇：一般用量10

18、0 mg/L5氨基酸四天然復(fù)合物1椰乳 coconut milk2香蕉3水解酪蛋白1主要成分為氨基酸，濃度100200 mg/L。2受酶和酸的作用易分解。4馬鈴薯1去皮和芽，煮30分鐘，過(guò)濾，一般150200 mg/L。2對(duì)pH緩沖作用大。5其它1酵母提取液、麥芽提取物、蘋果汁、番茄汁、黃瓜果實(shí)、未熟玉米的胚乳。2遇熱較穩(wěn)定，大多在培養(yǎng)困難時(shí)使用，有時(shí)有效。五培養(yǎng)材料的支持物1瓊脂agar)1凝固劑，一般1%.2為防止有害物質(zhì)毒害，可加110 g/L的活性炭。2其它：玻璃纖維、濾紙橋等。六抗生物質(zhì)防止內(nèi)生菌，可加抗生物質(zhì)。二、培養(yǎng)基的制備一母液配制和保存二配制過(guò)程三pH值的調(diào)節(jié)四培養(yǎng)基分注：趁

19、熱分注五滅菌和洗滌三、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的應(yīng)用一生長(zhǎng)素1吲哚乙酸IAA：有天然，也可合成，活力低。遇高溫高壓、遇酶、受光易分解，對(duì)器官形成副作用小。2萘乙酸NAA：可人工大量生產(chǎn)，高溫高壓下穩(wěn)定，功能比IAA高倍。32,4-D：可促進(jìn)愈傷組織形成。不同器官對(duì)生長(zhǎng)素的反響根：對(duì)生長(zhǎng)素最敏感，低濃度下105103PPM，可促進(jìn)生長(zhǎng)；濃度高時(shí)，抑制生長(zhǎng)。芽：濃度略高時(shí)，促進(jìn)芽的生長(zhǎng)。愈傷組織：高濃度的生長(zhǎng)素可誘導(dǎo)產(chǎn)生，而且對(duì)愈傷組織的再分化也有誘導(dǎo)作用。其它：可促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)、分裂、分化；還可促進(jìn)新成代謝。二赤霉素GA31GA3對(duì)整個(gè)植株的作用比離體器官或組織作用顯著，這與生長(zhǎng)素不同。2GA3有刺激器官生長(zhǎng)

20、的作用，但抑制器官的發(fā)生。3GA3可刺激植物體內(nèi)生長(zhǎng)素的生物合成。三細(xì)胞分裂素1.對(duì)細(xì)胞分裂與分化，以及細(xì)胞的增大有促進(jìn)。2.可解除頂端優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)側(cè)芽生長(zhǎng)。3.可減少葉綠素分解、延緩葉片衰老。4.對(duì)根的生長(zhǎng)起擬制作用。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用溶劑1水中直接溶解困難。IAA、NAA、IBA、2,4-D、GA3可先用少量95%酒精溶解，再加水；KT、BA等那么可用1 N的HCl溶解，再加水。2也可配制母液，低溫貯存使用，用量極微，一般用mg/L表示。使用量1一般生長(zhǎng)為10 mg/l。細(xì)胞分裂素20 mg/l 。2生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的比例決定著發(fā)育的細(xì)胞類型，愈傷組織再分化是長(zhǎng)根或長(zhǎng)芽。生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素

21、 低 促進(jìn)芽形成生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素 高 促進(jìn)根形成第四節(jié) 組織培養(yǎng)技術(shù)一、Steps of MicropropagationStage 0 Selection & preparation of the mother plantsterilization of the plant tissue takes placeStage I - Initiation of cultureexplant placed into growth mediaStage II - Multiplicationexplant transferred to shoot media; shoots can be cons

22、tantly dividedStage III - Rootingexplant transferred to root mediaStage IV - Transfer to soilexplant returned to soil; hardened off二、外植體滅菌1.過(guò)程2.材料與前處理3.滅菌消毒 藥劑種類與消毒處理時(shí)間三、組織培養(yǎng)過(guò)程中的變異現(xiàn)象一現(xiàn)象Somaclonal Variation: variability in plants regenerated from tissue culture that is either induced or uncovered by

23、a tissue culture process. Most somaclonal variation is negative, but if enough plants are examined, positive changes can usually be recovered.The source for most breeding material begins with mutations, whether the mutation occurs in a modern cultivar, a landrace, a plant accession, a wild related s

24、pecies, or in an unrelated organismTotal sources of variation: Mutation, Hybridization, PolyploidySomaclonal variation is a general phenomenon of all plant regeneration systems that involve a callus phaseThere are two general types of Somaclonal Variation:Heritable, genetic changes (alter the DNA)St

25、able, but non-heritable changes (alter gene expression, AKA epigenetic)Since utilizing somaclonal variation is a form of mutation breeding, we need to consider mutation breeding in more detail Inducing MutationsPhysical Mutagens (irradiation)Neutrons, Alpha raysDensely ionizing (“Cannon balls), most

26、ly chromosome aberrationsGamma, Beta, X-raysSparsely ionizing (“Bullets), chromosome aberrations & point mutationsUV radiationNon-ionizing, cause point mutations (if any), low penetratingChemical Mutagens (carcinogens)Many different chemicalsMost are highly toxic, usually result in point mutations二組

27、織培養(yǎng)過(guò)程變異的利弊與利用AdvantagesScreen very high populations (cell based)Can apply selection to single cellsDisadvantagesMany mutations are non-heritableRequires dominant mutation (or double recessive mutation); most mutations are recessiveCan avoid this constraint by not applying selection pressure in cultu

28、re, but you loose the advantage of high through-put screening have to grow out all regenerated plants, produce seed, and evaluate the M2Alternative: perform on haploid cell linesDisease Resistant Success using Somaclonal Variation作業(yè)布置1.概念：組織培養(yǎng)、外植體、愈傷組織、胚狀體、細(xì)胞全能性、離體保存等。2.簡(jiǎn)述組織培養(yǎng)室的根本設(shè)施，畫(huà)圖描述。3.簡(jiǎn)述培養(yǎng)基配制的根

29、本流程、應(yīng)注意哪些方面。4.簡(jiǎn)述組織培養(yǎng)技術(shù)主要有哪些應(yīng)用。課后自我總結(jié)分析該章是本課程的重點(diǎn)，是同學(xué)們畢業(yè)后可以應(yīng)用的最根底技術(shù)；除技術(shù)外，同學(xué)們對(duì)根本建立起一個(gè)組培實(shí)驗(yàn)室也很有興趣。河南科技學(xué)院教案課時(shí)備課 第 5-7 次課 6 學(xué)時(shí)課目、課題章節(jié)第三章 園藝植物脫毒與離體快繁技術(shù)主要參考資料1鞏振輝、申書(shū)興主編，植物組織培養(yǎng)，化學(xué)工業(yè)出版社，20072雷特迪亞、克里斯蒂森，生物技術(shù)導(dǎo)論，科學(xué)出版社，20023李浚明、朱登云編譯，植物組織培養(yǎng)教程(第3版)，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，20214鄧秀新、胡春根主編，園藝植物生物技術(shù)，高等教育出版社，20055郭仰東主編，植物細(xì)胞組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)教程，中

30、國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2021教學(xué)目的和要求1了解園藝生產(chǎn)中存在的病毒病類型與脫除的原理2掌握病毒脫除技術(shù)與檢測(cè)方法3掌握?qǐng)@藝植物離體快繁操作技術(shù)及代表性園藝植物快繁操作技術(shù)4了解人工種子操作技術(shù)及應(yīng)用重 點(diǎn)難 點(diǎn)1病毒病的類型；2病毒病脫除技術(shù)與檢測(cè)方法3代表性園藝植物離體快繁操作技術(shù)教學(xué)內(nèi)容園藝植物的脫毒 detoxification of horticultural plants脫毒的意義The significance of seedling病毒的定義：是一類沒(méi)有細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，但有遺傳復(fù)制等生命特征，主要由核酸和蛋白質(zhì)組成的大分子生物。病毒個(gè)體相當(dāng)微小，大多數(shù)病毒在10030

31、0毫微米之間。 virus definition: is a kind of have no nuclei, cytoplasm and cell wall structure, but has the vital signs, such as genetic replication is mainly composed of a nucleic acid and protein molecules. Relatively tiny virus individual, most of the virus between 100 300 nm 病毒是結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的微小生命體，病毒粒體有各種不同形狀，

32、由一種核酸RNA或DNA和外面的蛋白質(zhì)或脂蛋白質(zhì)衣殼所組成，并且在適宜的條件下至少可以在一種寄主上引起病害。Tiny organisms is simple in structure, virus, the virus granule has a variety of different shapes, by a kind of nucleic acid (RNA or DNA) and proteins (or lipoprotein) outside of capsid, and under the condition of suitable at least can cause dise

33、ase in a host.病毒是傳染性寄生物，它的核酸基因組的重量小于3108道爾頓，需要有寄主細(xì)胞中的核糖體和其它成分才能增殖。the virus was infectious parasites, the weight of the nucleic acid genome is less than 3 x 108 Dalton, needs a ribosome in host cells and other components to proliferation園藝植物病毒病的侵染特性：與真菌和細(xì)菌病害不同，病毒多為系統(tǒng)性侵染systemic infection，即病毒侵染后很快擴(kuò)展至

34、植物的全身，因此，從帶有病毒的植株上取接穗或插條繁育的苗木，也帶有病毒。horticultural plant virus disease infection characteristics: unlike fungal and bacterial diseases, virus of systemic infection (systemic infection), the virus quickly extended to plant after the whole body, therefore, from the plants with a virus or cutting scion

35、nursery stock breeding, also with a virus.潛伏侵染latent infection，這類病毒稱為潛隱病毒latent virus。 Latent infection (latent infection), this type of virus called latent viruses (latent virus get). 脫毒的方法The method of seedling莖尖培養(yǎng)脫毒Stem tip seedling cultivationWhite1943年首先發(fā)現(xiàn)了感染煙草花葉病毒的煙草植株生長(zhǎng)點(diǎn)附近病毒濃度很低；1. The White

36、(1943) first discovered near the tobacco plant growing point of tobacco Mosaic virus infection virus concentration is very low;2Morel等1953從感染花葉病毒的大麗菊別離出了莖尖分和組織，并得到無(wú)病毒植株。2. Morel etc. (1953) from the Mosaic virus infection dahlia chrysanthemum is isolated from the stem tip points and organization, an

37、d to get virus-free plants.3以后，相繼在其它植物培養(yǎng)成功，如：馬鈴薯、菊花、蘭花、百合、草莓、矮牽牛、蔦尾；3. Later, successively develop successfully in other plants, such as: potatoes, chrysanthemum, orchid, lily, strawberries, petunias, iris;二微體嫁接脫毒(2) microbody seedling grafting培養(yǎng)無(wú)病毒植株解決生根難的問(wèn)題莖尖嫁接苗無(wú)童期的，能快開(kāi)花結(jié)果。從1980年開(kāi)始，農(nóng)業(yè)部在河南科技學(xué)院建立了柑橘

38、研究所，在章文才教授的主持下，仿照西班牙無(wú)病毒良種生產(chǎn)程序，率先在我國(guó)進(jìn)行柑橘莖尖微芽嫁接及無(wú)病毒良種繁育技術(shù)研究，該工程1986年獲農(nóng)業(yè)部科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)。此后后，河南科技學(xué)院柑橘研究所為全國(guó)柑橘主產(chǎn)區(qū)培養(yǎng)了大批技術(shù)骨干。1988至1991我所與廣西農(nóng)墾局橫向聯(lián)合，培育了12個(gè)優(yōu)良柑橘品種脫毒苗200余株，為廣西省無(wú)病毒柑橘推廣起到了良好的示范作用。莖尖嫁接脫毒的原理莖尖微芽嫁接脫毒：根據(jù)一般病毒在植物體內(nèi)分布不均勻，頂端生長(zhǎng)點(diǎn)的分生組織不帶毒或檢查不到病毒的原理，通過(guò)莖尖嫁接脫毒得到無(wú)毒苗。目前莖尖嫁接方法可脫去柑桔大多數(shù)病害，這一方法被世界各國(guó)普遍采用，成為獲得柑桔良種無(wú)毒植株的主要手段。

39、操作方法：試管砧木苗的培養(yǎng)；莖尖消毒和嫁接；移栽試驗(yàn)病毒鑒定Cultivate virus-free plants root difficult problems stem tip grafting without children period, can quickly bear fruit., beginning in 1980, established the citrus research institute, the ministry of agriculture in henan institute of science and technology, professor in Z

40、hangWenCai under the auspices of modeled after the Spanish no virus seeds production program, take the lead in China in citrus stem tip micro bud grafting and no virus well-bred breeding technology research, science and technology progress prize of the ministry of agriculture for the project 1986. S

41、ince then, citrus research institute of henan institute of science and technology for national citrus producing has trained a large number of technical backbone. Between 1988 and 1991 I and guangxi bor transverse joint, developed 12 varieties of citrus virus-free 200 strains, in guangxi province, no

42、 virus citrus promotion has played a good demonstration effect.The principle of stem tip seedling graftingStem tip micro seedling bud grafting: according to the general virus in the uneven distribution of plants, growing point at the top of the meristem without toxic or check virus principle, non-to

43、xic is obtained by seedling stem tip grafting seedlings., the stem tip grafting method can remove most of citrus diseases and this method has been widely used around the world, become the main means of citrus thoroughbred non-toxic plantsOperation method: in vitro root stock seedling cultivation; St

44、em tip disinfection and grafting; Transplanting test Virus identification三熱處理脫毒通常，熱處理對(duì)球狀、線狀病毒、類菌質(zhì)體、類細(xì)菌體是有效的。對(duì)類病毒沒(méi)有效果。(3) heat treatment course, usually, the heat treatment for spherical, linear virus, bacterial plasmids and bacterial is effective. The virus has no effect.四其它脫毒方法1愈傷組織培養(yǎng)無(wú)病毒苗：取材方便，一次可得

45、到大量無(wú)病毒苗；2莖尖微體嫁接培養(yǎng)：桃、柑桔、蘋果等，砧木試管培養(yǎng)，然后嫁接無(wú)病芽；3珠心胚培養(yǎng)：柑桔類，通過(guò)珠心細(xì)胞產(chǎn)生無(wú)性胚珠心胚，培養(yǎng)可以得到無(wú)病毒的珠心胚苗。4) other detoxification method1. The callus culture virus-free seedling: conveniently, one can get a lot of virus-free seedling;2. Stem tip microbody grafting cultivation: peach, citrus, apple, etc., the scion in vitr

46、o, and then grafted disease-free bud;3. The nucellus embryo culture: citrus, asexual embryo by nucellus cells (nucellus embryo), culture can get no virus nucellus embryo seedlings.4. Anther culture obtain virus-free seedling三、脫毒苗的鑒定一脫毒效果的檢測(cè)1草本植物：汁液摩擦法，從待檢植株上取一定的組織，包括葉片、花瓣、根、或枝皮，參加25倍V/W的提取緩沖液，在低溫條件下

47、研磨，然后蘸取汁液在撒有金剛砂的供試指示植物葉片上輕輕摩擦，接種完畢立即用蒸餾水沖洗凈葉片上殘留的汁液。然后將指示植物放在2228、半遮蔭的條件下生長(zhǎng)，定期觀察并記錄指示植物的病癥反響。 2木本植物：汁液磨擦接種；.嫁接接種3.血清學(xué)檢測(cè) 抗原antigen：凡注射到動(dòng)物體內(nèi)能刺沖動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫反響的物質(zhì)均可稱為抗原?？乖虥_動(dòng)物機(jī)體發(fā)生免疫反響而產(chǎn)生抗體的特性叫免疫原性；抗原能與所產(chǎn)生的抗體發(fā)生特異性結(jié)合，這種特性叫反響原性；抗原性 上述二者合稱。兼具這兩種特性的抗原物質(zhì)稱為完全抗原；只有反響原性，沒(méi)有免疫原性的抗原物質(zhì)稱為半抗原。植物病毒抗血清制備 (1) 病毒抗原的別離純化與制備 從感

48、染病毒的寄主植物中，通過(guò)物理和化學(xué)的方法，將病毒與寄主植物的各種組分別離，以獲得純潔的病毒制品。 病毒抗原的制備方法，主要步驟包括分步沉淀、差速離心和梯度離心等,去雜質(zhì)濃縮病毒。植物病毒抗體制備1植物病毒抗血清制備 用純化的病毒抗原免疫注射動(dòng)物獲得。常用動(dòng)物為家兔，一般選用半周歲左右、體重23千克、健康、自然抗體陰性的日本大耳兔和半耳垂家兔.以上方法制備的抗血清含有多種抗體，這些抗體是由動(dòng)物的多種淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的，因此也稱為多克隆抗體Polyclonal antibody，Pab(2) 單克隆抗體 單克隆Monoclone即是單一的無(wú)性細(xì)胞系，或稱單細(xì)胞系。單克隆抗體就是由免疫動(dòng)物的單細(xì)胞系所

49、產(chǎn)生的抗體。 常用血清學(xué)檢測(cè)方法 1)免疫電鏡技術(shù)Immunoelectron microscopy，IEM是將抗原與抗體的?；悦庖叻错懪c電鏡觀察相結(jié)合的一種病毒檢測(cè)方法。其操作簡(jiǎn)便、結(jié)果判斷直觀。 抗原吸附免疫修飾染色透射電鏡觀察 (2) 酶聯(lián)免疫吸附分析Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay，ELISA 具有檢測(cè)靈敏度高、快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，不需要提純病毒，可在較短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)大量樣品。 直接法即所用酶標(biāo)抗體為病毒特異抗體，因此針對(duì)不同抗體需分別進(jìn)行標(biāo)記；間接法所用酶標(biāo)抗體為通用的市售抗體，如：羊抗兔酶標(biāo)抗體、羊抗鼠酶標(biāo)抗體等，因此無(wú)需對(duì)每一抗體進(jìn)行標(biāo)記

50、雙抗體夾心法Double antibody sandwich ELISA，DAS-ELISA是一種直接法。首先用病毒特異性抗體IgG包被微板孔，然后參加待檢樣品粗提液，使包被的抗體捕捉樣品中的病毒粒子，再參加酶標(biāo)抗體，最后參加底物，室溫避光放置一定時(shí)間后，判斷結(jié)果A蛋白酶聯(lián)免疫吸附法Protein A sandwich ELISA，PAS-ELISA 為一種間接法。首先用A蛋白包被微板的孔，然后參加病毒的抗體，再參加待檢樣品粗提液，經(jīng)第二層抗體與病毒結(jié)合，參加酶標(biāo)記A蛋白，最后參加底物，室溫避光放置一定時(shí)間后，判斷結(jié)果。 電泳分析 在類病毒的檢測(cè)中應(yīng)用廣泛 ，類病毒為環(huán)狀單鏈RNA分子 ，大小

51、為246375個(gè)核苷酸nt，內(nèi)部堿基高度互補(bǔ)。在自然情況下形成棒狀或三葉草狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在常規(guī)電泳條件下遷移較快；在變性條件下，由于二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞而成環(huán)狀，在電泳介質(zhì)中遷移減緩，而與其它小分子物質(zhì)分開(kāi)，表現(xiàn)類病毒的特有電泳條帶。因此雙向電泳也是鑒別一種病原是否為類病毒的常用技術(shù)。 PCR技術(shù) 病毒和類病毒的基因組成已經(jīng)明確，可以根據(jù)序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR檢測(cè) 核酸雜交技術(shù) 探針?biāo)?、脫毒技術(shù)在園藝植物上的應(yīng)用1莖尖培養(yǎng)脫毒2熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒3病毒檢測(cè)1熱處理工藝脫毒法2熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒3莖尖微芽嫁接1熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒2脫毒苗培育三, virus-free identifica

52、tion(a) detoxification effect of detection1. The test form2. The indicator plant method(1) herbs: SAP friction law, a certain organization, is taken from the inspected plants including leaves, petals, root, or skin, add 2 5 times (V/W) extraction buffer, under the condition of low temperature grindi

53、ng, and then dipped in SAP on the selected indicator plant leaves with emery gently friction, immediately after inoculation with distilled water rinse clean leaf juice. Then put the indicator plant in 22 to 28 , half shade under the condition of growth, the symptoms of regular observation and record

54、 indicator plant reaction.(2) the woody plants: friction SAP inoculation; Grafting vaccinal3. The serological detectionAntigen (antigen) : every injected into the animals animals can stimulate the bodys immune response of the substances are known as antigens.Antigen, stimulate the animals immune res

55、ponse and antibody production features of immunogenicity; antigen can combine with produced antibody specificity, this feature is called reaction was; antigenicity of the above two es., both of the two features antigen material called complete antigen; Only the original sex reaction, no immunogenici

56、ty of antigen material called haptens.Plant virus antiserum preparation(1) the separation and purification of virus antigen and preparationFrom the infected host plants, through physical and chemical methods, separate the virus and host plants of various components, in order to obtain pure virus pro

57、ducts. virus antigen preparation methods, the main steps include fractional precipitation, differential centrifugation and gradient centrifugation, concentrated virus.Plant virus antibody preparation(1) plant virus antiserum preparation of purified virus antigen immunization animal. Commonly used an

58、imals for rabbit, choose and a half years old or so commonly, 2 - 3 kg weight, healthy, natural antibody negative Japanese big ear rabbit rabbit and half an ear lobe. The above method of preparation of antiserum contain a variety of antibodies, these antibodies are produced by animal variety of lymp

59、hocytes, so also known as Polyclonal antibody (Polyclonal antibody, Pab)(2) monoclonal antibody Monoclonal asexual cell line (Monoclone) is a single, or single cell lineage. Monoclonal antibody is produced by immune single-celled animals department of antibodies.Commonly used serological detection m

60、ethod(1) the immune electron microscopy technology (Immunoelectron microscopy, IEM) is the specialization of antigen and antibody immune response combined with electron microscope a virus detection method. Its easy operation, intuitive results.The antigen adsorption - immune modifier - dyeing - tem