吳乃虎《基因工程原理》總復(fù)習(xí)提綱

1、基因工程原理總復(fù)習(xí)提綱第一單元基因的基本概念和現(xiàn)代概念一、基因與基因工程概述基因工程誕生的理論基礎(chǔ)40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分 子載體是DNA,而不是蛋白質(zhì)。50年代揭示了 DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半 保守復(fù)制機(jī)理，從而解決了基因的自我復(fù)制及傳 遞；50年代末和60年代初相繼提出了“中心法則” 和操縱子學(xué)說(shuō)并成功地破譯了遺傳密碼，從而闡 明了遺傳信息的流向和表達(dá)問(wèn)題?；蚬こ陶Q生的技術(shù)基礎(chǔ)DNA分子的切割與連接技術(shù)(核酸內(nèi)切限制酶和 DNA連接酶的發(fā)現(xiàn))；測(cè)序技術(shù)(DNA核酸序列的結(jié)構(gòu)及分析技術(shù))；克隆載體構(gòu)建技術(shù)(質(zhì)粒載體；噬菌體載體;柯 斯載體;單鏈?zhǔn)删w載體;噬菌粒載體

2、；遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)(大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系)；瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)；Southern雜交技術(shù)；基因的定義基因的數(shù)量二、基因的命名法通則細(xì)菌基因的命名法酵母基因的命名法線蟲(chóng)基因的命名法果蠅基因的命名法植物基因的命名法脊椎動(dòng)物基因的命名法人類基因的命名法三、基因的結(jié)構(gòu)基因的組成部分編碼區(qū)(coding region);非編碼區(qū)(noncoding region);啟動(dòng)區(qū)(promoter region);終止區(qū) 9terminator).原核基因定義原核基因的組成：?jiǎn)?dòng)區(qū)序列區(qū)轉(zhuǎn)錄區(qū)序列區(qū)(5, 一 UTR; cDNA序列 區(qū)-編碼區(qū)；3, 一UTR); 終止序列區(qū)真核基因定義真核基因特征：真核基因編碼區(qū)中往

3、往含有非編碼序列的內(nèi)含子(intron);真核基因是單順?lè)醋?，編碼 單基因產(chǎn)物；成熟mRNA分子的5-，端有 一個(gè)帽的結(jié)構(gòu)，3，-端有一段 poly(A)尾巴。真核基因的組成：?jiǎn)?dòng)子序列區(qū)終止子序列區(qū) 轉(zhuǎn)錄序列區(qū)真核基因初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的組成：5，-UTR序列區(qū)表達(dá)子(exon) 內(nèi)含子(intron)3, -UTR序列區(qū)真核基因成熟mRNA的結(jié)構(gòu)組成：5-端帽的結(jié) 構(gòu);5, -UTR;編碼序列區(qū);3, -UTR;3,-端 poly(A)尾 巴。四、基因的類型根據(jù)拷貝數(shù)分類單拷貝基因多拷貝基因根據(jù)表達(dá)特性分類組成型基因(Constitutive gene)又叫看家基因 (Housekeeping g

4、ene)誘導(dǎo)型基因(Inducible gene)根據(jù)產(chǎn)物類型分類結(jié)構(gòu)基因(Structural gene)調(diào)節(jié)基因(Regulator gene)根據(jù)實(shí)驗(yàn)用途分類選擇基因(Selectable gene)標(biāo)記基因(Marker gene)報(bào)告基因(Reporter gene)根據(jù)排列組合特性分類基因家族(Gene family)基因簇(Gene cluster)弧獨(dú)基因(Orphons)根據(jù)細(xì)胞類型分類原核基因(Prokaryotic gene)真核基因(Eukaryotic gene)根據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分類斷裂基因(Split gene)移動(dòng)基因(Movable gene)假基因(Pseudog

5、ene)根據(jù)序列重復(fù)特性分類重疊基因(O verlapping gene)嵌套基因(Nested gene)重復(fù)基因(Repeated gene)9.根據(jù)同源性分類d.程序基因擴(kuò)增(Programmed gene同源基因(Honologouse gene)共生同源基因(Paralogous gene)amplipication)e.生物進(jìn)化基因擴(kuò)增直向同源基因(Orthologous gene)孤獨(dú)基因家族(Orphon family)10.根據(jù)堿基突變分類野生型基因(Wild type gene)突變型基因(Mutant type gene)五、基因圖與基因作圖1. 基因圖(gene map

6、)包括： a.遺傳圖(genetic map) 厘摩(centimorgan,cM)遺傳圖距或是染色體上基因間的距離 以摩爾根單位表示(morgan unit),摩爾 根單位等于100%的重組率(交換值)。八、基因表達(dá)正義鏈與反義鏈基因表達(dá)定義：基因通過(guò)DNA的轉(zhuǎn)錄和RNA的轉(zhuǎn)譯等過(guò)程，將其 遺傳信息轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)(RNA轉(zhuǎn)錄本)的過(guò)程，叫做 基因表達(dá)?；虮磉_(dá)產(chǎn)物有些基因如tRNA基因和rRNA基因最終表達(dá)產(chǎn) 物是RNA大部分基因的表達(dá)的最終產(chǎn)物是蛋白質(zhì)基因表達(dá)的時(shí)空特異性基因表達(dá)活性的調(diào)控1厘摩(cM)則等于1%的重組率。人類基因組1cM相當(dāng)于1000Kb擬南芥基因組1cM相當(dāng)于290Kb蕃

7、茄基因組1cM相當(dāng)于750Kb小麥基因組1cM相當(dāng)于3500Kb物理圖(physical map)限制圖(restriction map)2.基因作圖(gene maping)六、DNA非編碼序列的功能1.中心法則質(zhì)疑九、基因克隆與基因工程克隆的詞義基因克隆與DNA克隆基因克隆的方法互補(bǔ)作用基因克隆cDNA克隆基因組DNA克隆基因定位克隆基因克隆與基因分離第一單元DNA分子的體外切割與重組RNA的功能假基因的功能反義RNA的功能RNA的干擾作用微 RNA(micro RNA)的功能核糖開(kāi)關(guān)表觀遺傳學(xué)遺傳印記(Genetic imprinting)遺傳印記與遺傳性疾病表觀遺傳信息層(Epigen

8、etic lager of information)生命有機(jī)體遺傳信息的第三層次， 它貯藏在圍繞DNA分子周圍并與DNA分子結(jié) 合的蛋白質(zhì)及化學(xué)物質(zhì)中，表觀遺傳信息層可 能比RNA甚基因更為重要。甲基化作用與遺傳印記甲基化藥物與癌癥治療七、基因擴(kuò)增一、基因克隆涉及的一些重要的酶核酸酶(Nuclease)核酸外切酶核酸內(nèi)切酶蛋白酶(Proteinase)基因工程中涉及的主要的酶2型核酸內(nèi)切限制酶DNA 連接酶(Ligase)DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶(Reverse transcriptase)多核苷酸激酶(Polynucteotide kinase)末端轉(zhuǎn)移酶(Terminal transferas

9、e)核酸外切酶(Exonuclease)堿性磷酸酶(Alealine phosphatase)小牛腸堿性磷酸酶(CIP)細(xì)菌堿性磷酸酶(BAP)Tag DNA 聚合酶(Tag DNA polymerase)基因增加與基因減少基因擴(kuò)增的五種情況：PCR基因擴(kuò)增克隆基因擴(kuò)增環(huán)境壓力基因擴(kuò)增一、核酸內(nèi)切限制酶與DNA分子的體外切割寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象核酸內(nèi)切限制酶及其類型：1型核酸內(nèi)切限制酶2型核酸內(nèi)切限制酶3型核酸內(nèi)切限制酶2型核酸內(nèi)切限制酶的特點(diǎn)識(shí)別序列粘性末端(Cohesive ends)平末端(Blunt ends 或 flush ends)平末端連接方法：T4 DNA連接酶連接法；同聚

10、物加尾法；銜接物(Linker )連接法；DNA接頭(Adapter)連接法。同裂酶與同尾酶同裂酶(Isoschizomers)具有同樣的識(shí)別位點(diǎn)，產(chǎn)生同樣的粘性末端， 但是從不同的細(xì)菌中分離出來(lái)的類核酸內(nèi)切限 制酶。同尾酶(Isocaudamers)一組來(lái)源不同、識(shí)別序列各異，但能夠切割形 成相同的粘性末端的核酸內(nèi)切限制酶。異裂酶(Neoschizomer)這是一組來(lái)源不同，但具有相同的識(shí)別序列和 不同的切點(diǎn)(cleave point)的核酸內(nèi)切限制酶。影響核酸內(nèi)切限制酶活性的因素三、DNA連接酶與DNA分子的體外連接DNA 連接酶(DNA ligase)簡(jiǎn)稱連接酶，是指利用ATP分子中的r

11、-磷酸基團(tuán)為 能量，催化在兩條并排DNA鏈的5,-磷酸基團(tuán)和3, -羥基之間或是雙鏈DNA單鏈斷裂位置形成一個(gè)磷 酸二酯鍵，而使兩個(gè)DNA片段共價(jià)連接起來(lái)的一種 酶。DNA分子連接的條件：3 -端具有一個(gè)游離的羥基(-OH);另一條DNA鏈的5,-末端具有一個(gè)磷酸基團(tuán) (-P);連接反應(yīng)需ATP的參加。影響DNA分子體外連接反應(yīng)的因素：ATP濃度；連接酶濃度；反應(yīng)時(shí)間；反應(yīng)溫度；插入 片段與載體分子間的摩爾比值。第三單元：基因克隆的載體一、質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體定義質(zhì)粒DNA分子的構(gòu)型及其在凝膠電泳申泳中的位置SC構(gòu)型(雙鏈、共價(jià)、閉合的超盤旋DNA)-走在 凝膠最前面；OC構(gòu)型(單鏈斷裂的開(kāi)環(huán)DN

12、A)-走在凝膠最后 面；L構(gòu)型(雙鏈斷裂呈線型DNA)-走在凝膠的中間 位置。質(zhì)粒載體的組成：具有復(fù)制區(qū)或復(fù)制因子(replicator)具有1-2個(gè)抗菌素抗性基因；具有若干種限制酶的單一識(shí)別位點(diǎn)；具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。質(zhì)粒DNA的自我轉(zhuǎn)移質(zhì)粒DNA的遷移作用(mobilization)遷移作用的分子機(jī)理質(zhì)粒的拷貝數(shù)質(zhì)粒的不親和性質(zhì)粒DNA的復(fù)制與拷貝數(shù)的控制質(zhì)粒復(fù)制控制的分子模型：抑制蛋白稀釋模型；自體阻遏蛋白質(zhì)模型嚴(yán)緊型質(zhì)粒與松馳型質(zhì)粒質(zhì)粒載體的類型：插入失活型載體表達(dá)型質(zhì)粒載體；正選擇質(zhì)粒載體 重要的質(zhì)粒載體：pBR322質(zhì)粒載體：pUC質(zhì)粒載 體。二、噬菌體載體噬菌體的一般生

13、物學(xué)問(wèn)題；烈性噬菌體與溫和噬菌體；混濁型噬菌斑和清亮型噬菌班；噬菌體的溶源化與溶源性細(xì)菌；噬菌體的整合作用與原噬菌體；超感染免疫入噬菌體載體cos位點(diǎn)(粘性末端位點(diǎn))入噬菌體載體構(gòu)建原理；插入型入噬菌體載體與替換型入噬菌體載體；具有內(nèi)刪除作用的入噬菌體載體；入ZAP載體的結(jié)構(gòu)：含有一個(gè)發(fā)生內(nèi)刪除作用的pBluescript噬菌粒 的DNA區(qū)段；在pBluescript的兩側(cè)含有f的起始子(I)和終止 子(T)；在pBluescript的內(nèi)部具有LacZ基因；在LacZ基因內(nèi)部具有兩端分別為T3和T7噬 菌體啟動(dòng)子和多克隆位點(diǎn)區(qū)(MCS);內(nèi)刪除作用的原理入重組體DNA分子的體外包裝體外包裝原理

14、包裝限制入噬菌體載體的克隆能力(23Kb理論值)三、柯斯質(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒載體的定義柯斯質(zhì)粒載體的組成部分：質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)；帶有1-2個(gè)抗菌素抗性基因；來(lái)自入噬菌體DNA的cos位點(diǎn)；來(lái)自質(zhì)粒的相當(dāng)數(shù)量的核酸內(nèi)切限制酶單一識(shí) 別位點(diǎn)柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：來(lái)自入噬菌體的特點(diǎn)，體外包裝后可高效轉(zhuǎn)導(dǎo)感 受態(tài)細(xì)胞，導(dǎo)入細(xì)胞后可重新環(huán)化，無(wú)法進(jìn)入溶 菌周期，因此無(wú)法形成子代噬菌體。具有質(zhì)粒載體的特點(diǎn)，帶有質(zhì)粒復(fù)制子，可像質(zhì) 粒一樣復(fù)制，在有氯霉素下擴(kuò)增；具有抗生素抗 性基因，因此可像質(zhì)粒載體一樣篩選重組體。具有高容量的克隆能力(31-45Kb)四、單鏈?zhǔn)删w載體M13單鏈?zhǔn)删w的一般生物學(xué)特性 M13克隆體

15、系列組成：a. M13克隆載體；b. M13的寄主菌株X-gal顯色反應(yīng)原理順?lè)醋觾?nèi)互補(bǔ)作用(a-互補(bǔ)作用)M13載體系列的優(yōu)點(diǎn)：制備單鏈DNA序列重組子可用組織化學(xué)檢測(cè)LacZ基因上有一段多克隆位點(diǎn)序列區(qū)(MCS)可定向克隆五、噬菌體展示載體構(gòu)建噬菌體展示載體的原理絲狀噬菌體展示載體噬菌體表面展示文庫(kù)六、噬菌粒載體噬菌粒載體的定義噬菌粒載體的組成：來(lái)自質(zhì)粒部分：a.來(lái)自ColE 1的復(fù)制起點(diǎn)(ori);b.抗菌素抗性標(biāo)記；來(lái)自噬菌體部分：a. f!單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點(diǎn)(ori);與形態(tài)發(fā)生有關(guān)的DNA序列。噬菌粒載體的優(yōu)點(diǎn)：a.可像質(zhì)粒一樣復(fù)制，產(chǎn)生雙鏈 DNA;復(fù)制方向可改變，形成單鏈DN

16、A，不必亞克隆，可直接用于測(cè) 序；可產(chǎn)生大片段的外源單鏈DNA。pBluescript 噬菌粒體外轉(zhuǎn)錄載體定義；pBluescript 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)c. pBluescript噬菌粒載體的組成：*a.具ColE1質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)(ori)，可產(chǎn)生雙 鏈 DNA;*b.具Ampr抗性基因，提供轉(zhuǎn)化子篩選；*c.具pUC19的多克隆位點(diǎn)(MCS)，克隆外源 基因；*d.在MCS兩端具有T3和T7啟動(dòng)子，指導(dǎo) 外源基因錄*e.具LacZ基因，可組織化學(xué)選擇重組子；*f.具M(jìn)13單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點(diǎn)，可產(chǎn)生單 鏈DNA亞克隆可進(jìn)行測(cè) 序第四單元基因克隆與基因分離、基因克隆基因克隆的概念基因克隆與DNA克隆基

17、因克隆的基本過(guò)程基因文庫(kù)的類型(基因組文庫(kù)與cDNA文庫(kù))基因克隆與分離的實(shí)驗(yàn)策略物理策略生物學(xué)策略克隆樣品的選擇：從蛋白質(zhì)出發(fā)；從mRNA出發(fā)；從DNA大分子出發(fā)?；蛭膸?kù)庫(kù)容測(cè)算cDNA基因克隆概述cDNA文庫(kù)的構(gòu)建：第一步：分離細(xì)胞總RNA，根據(jù)poly(A)尾巴用 oliga(dT)柱分離純化出mRNA;第二步：用適當(dāng)?shù)囊铮ǔＳ胦liga(dT)和反轉(zhuǎn) 錄酶合成第一鏈 cDNA；第三步：雙鏈cDNA的獲得:用RNaseH酶降解 mRNA-cDNA分子中的mRNA鏈,再用第 一鏈為模板合成第二鏈cDNA。第四步：與適當(dāng)載體重組，將重組體分子導(dǎo)入大 腸桿菌寄主細(xì)胞增殖，即構(gòu)成cDNA文

18、 庫(kù)。cDNA克隆的優(yōu)越性：*a.以mRNA出發(fā)，對(duì)一些在增殖過(guò)程中 不經(jīng)過(guò)DNA中間過(guò)程的RNA病毒， 特別適用；*b.從mRNA出發(fā)，其復(fù)雜度要比蛋白質(zhì) 低 10-100 倍；*c.假陽(yáng)性比例低。每一個(gè)克隆都含有一個(gè)mRNA;*d.具有特殊用途：克隆的真核基因在原核 細(xì)胞中表達(dá)；*e.測(cè)定基因核苷酸序列;發(fā)育調(diào)節(jié)基因表 達(dá)特性分析，即時(shí)空特異性。d.全長(zhǎng)cDNA的合成基因組DNA克隆cDNA克隆的局限性基因組DNA克隆的過(guò)程：*a.分離基因組DNA;*b.體外切割片段化(超聲波處理;機(jī)械切割；限 制酶局部消化)與適當(dāng)載體重組；*c.轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞增殖即構(gòu)成基因組文庫(kù)?；蚪M文庫(kù)的優(yōu)越性：

19、*a.基因類型的全面性，一個(gè)完整的基因組文 庫(kù)中，該生物有機(jī)體的基因都有一個(gè)克?。?b.基因結(jié)構(gòu)的完整性，包括啟動(dòng)子、表達(dá)子、 間隔子、終止子等所有結(jié)構(gòu)；*c.基因的恒定性，即不受材料組織部位和發(fā)育 階的影響；*d.基因的功能性，適于研究基因的表達(dá)與調(diào)控?；虻亩ㄎ豢寺?用于分離編碼產(chǎn)物未知基因的方法 之一)定位克隆的程序和條件分子標(biāo)記RFLP在定位克隆中的應(yīng)用RFLP作圖過(guò)程染色體步移大尺度物理圖譜的構(gòu)建目的基因的分離分離克隆基因的若干方法：應(yīng)用核酸探針?lè)蛛x克隆的目的基因應(yīng)用差別雜交法和扣除雜交法分離克隆的基因PCR技術(shù).mRNA差別顯示技術(shù)(產(chǎn)物未知基因分離方法)表達(dá)文庫(kù)技術(shù)酵母雙雜交體系

20、(Y2H，產(chǎn)物末未知基因分離方 法)定位克隆分離產(chǎn)物未知基因DNA標(biāo)簽法分離產(chǎn)物末未知基因應(yīng)用DNA芯片技術(shù)應(yīng)用mRNA差別顯示技術(shù)分離產(chǎn)物末未知基因mRNA差別顯示的原理：基本原理是，以多細(xì)胞(或但組織)的總RNA反 轉(zhuǎn)錄成的cDNA群體為模板，通過(guò)合理設(shè)計(jì)的 5,端與3,端引物的配對(duì)組合，將細(xì)胞(或組織) 中表達(dá)的約15%的基因片段擴(kuò)增，直接顯示在 DNA測(cè)序膠上，從而找出一對(duì)細(xì)胞或組織中表 達(dá)有差異的cDNA片段。*a.高等真核生物的mRNA3，端大多具有 poly(A)尾巴,故可用oligo(dT)作引物，反 轉(zhuǎn)錄成cDNA;*b.根據(jù)mRNA poly(A)前2個(gè)堿基可把所有 的mR

21、NA分成12類群，如按一個(gè)堿基可 歸為3大類群,3,端作錨定引物也就為3 大類群；*c.根據(jù)數(shù)理統(tǒng)計(jì)，5端的隨機(jī)引物需80種， 因此80 x3=240組合對(duì);就有可能分離到 目的基因?；虿町惐磉_(dá)(differential expression)：在生物個(gè)體發(fā) 育的不同階段，或在不同組織或細(xì)胞中 發(fā)生的，不同基因按時(shí)間、空間進(jìn)行有 序表達(dá)的方式，叫做基因差異表達(dá)。k. mRNA差別顯示技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)應(yīng)用DNA標(biāo)簽法分離產(chǎn)物未知的基因原理：DNA標(biāo)簽法(DNA tagging)，是根據(jù)DNA的插 入作用發(fā)展出來(lái)的。其原理：當(dāng)一段己知的特定DNA序列插入到基因組中目 的基因的內(nèi)部、或附近，便會(huì)誘

22、發(fā)該基因發(fā)生突 變，并最終導(dǎo)致表型變化，形成突變體(突變株)以特定的己知序列為DNA雜交的分子探針，從 突變株的基因組DNA文庫(kù)中篩選到突變的基 因。利用標(biāo)簽序列以外的突變基因序列為探針，再?gòu)?野生型基因組DNA文庫(kù)中克隆出野生型的目的 基因。類型：轉(zhuǎn)位子標(biāo)簽法：可分為一元轉(zhuǎn)位子標(biāo)簽法 (One-element tagging systebm)二元轉(zhuǎn)位子標(biāo) 簽法(Two-element tagging system)T-DNA標(biāo)簽法酵母雙雜交體系(Y2H)分離產(chǎn)物未知的基因轉(zhuǎn)錄因子定義轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)：(a) DNA結(jié)構(gòu)域(DNA-BD)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)域：(轉(zhuǎn)錄激活域 (AD);轉(zhuǎn)錄抑制域)核定位信號(hào)

23、區(qū)寡聚化位點(diǎn)酵母半乳糖苷酶基因的轉(zhuǎn)錄因子-GAL4E.coli-Yeast穿梭質(zhì)粒(定義)穿梭質(zhì)粒(Shuttle vetor):是一類人工構(gòu)建的具 有兩種不同的復(fù)制起點(diǎn)和選擇記號(hào)，可在兩種不同的寄主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和存 留的質(zhì)粒載體。這種質(zhì)粒載體可以攜帶外源DNA在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞往返穿梭。j.酵母雙雜交體系構(gòu)建兩種穿梭質(zhì)粒載體DNA-BD質(zhì)粒載體(具有色氨酸編碼基因 Trp)產(chǎn)生第一種雜種蛋白AD質(zhì)粒載體(具有亮氨酸編碼基因Leu) 產(chǎn)生第二種雜種蛋白酵母雙雜交體系的寄主菌株特點(diǎn)：*a.喪失了表達(dá)內(nèi)源GAL4轉(zhuǎn)錄因子的 能力；*b.具有LacZ報(bào)告基因；*c. trpl和ler2轉(zhuǎn)化標(biāo)記，

24、在缺少色氨 酸和亮氨酸的培養(yǎng)基中無(wú)法生長(zhǎng)。酵母單雜交體系(Y1H)原理：酵母單雜交體系是一種體內(nèi)分析系統(tǒng)，用 于分離與順式作用調(diào)控元件結(jié)合的特定蛋白質(zhì)之 編碼基因。許多真核轉(zhuǎn)錄因子都是結(jié)構(gòu)上可以分開(kāi)、功能上 相互獨(dú)立的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。用一種未知蛋白質(zhì)代替BD和AD形成融合蛋白 質(zhì)，如果此未知蛋白質(zhì)能夠與調(diào)控序列結(jié)合，它 就可以攜帶AD靠近起始復(fù)合物，從而起動(dòng)基因 轉(zhuǎn)錄。通過(guò)篩選cDNA-AD表達(dá)文庫(kù)，可以分離 與鑒定新的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)。酵母三雜交體系(Y3H)第五單元新基因的功能鑒定一、新基因功能鑒定的技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)與基因過(guò)表達(dá)技術(shù)：a.轉(zhuǎn)正義基因(目的 基因)轉(zhuǎn)基因(目的基因)的過(guò)表達(dá)。基

25、因剔除技術(shù)(基因打靶)RNA干擾技術(shù)與新基因功能鑒定基因序列同源比對(duì)技術(shù)，驗(yàn)證新基因的功能蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與功能的檢測(cè)基因定點(diǎn)突變途徑探索新基因的功能報(bào)告基因技術(shù)反義RNA技化學(xué)遺傳學(xué)方法；遺傳互補(bǔ)法基因表達(dá)系列分析法噬菌體表面展示技術(shù)與酵母雙雜交技術(shù)二、同源性分析與基因功能鑒定序列同源性與相似性、一致性及保守性概念基因序列同源性比對(duì)技術(shù)原理a. DNA分子的核苷酸序列或是蛋白質(zhì)多肽鏈的氨 基酸序列，具有高度相似性或顯著相似性的基因 或蛋白質(zhì)，往往是同源的。親緣關(guān)系密切的或相關(guān)的基因，具有相似的(或 相近的)核苷酸序列結(jié)構(gòu)，可以通過(guò)機(jī)算機(jī)的檢 索已經(jīng)測(cè)序并己知其生物學(xué)功能的其它物種的 相關(guān)基因

26、(同源基因)并根據(jù)核苷酸序列比對(duì)分 析所得出的相似性程度，推斷待鑒定的新基因之 可能的生物學(xué)功能。同源基因的類型：直向同源因(Orthologousgene)共生同源基因(Paralogous gene)三、基因失活與新基因功能鑒定同源重組與基因失活同源重組(Homologous recombination)：是指兩 條同源DNA序列之間發(fā)生的遺傳信息的重組或 交換的過(guò)程。.主要技術(shù)：*a.醇酵母缺失盒技術(shù)；*b. 基因剔除技術(shù)酵母缺失盒技術(shù)與新基因功能鑒定，其核心是使 用一種特殊的分子結(jié)構(gòu)即酵母缺失盒，通過(guò)同源 重組途徑，使待鑒定中的目的基因失活。酵母缺失盒的分子結(jié)構(gòu)：*a.中央部分是一種抗

27、菌素抗性基因的編碼序 列；*b.在此基因的兩側(cè)各有一個(gè)核酸內(nèi)切限酶的 識(shí)別位點(diǎn)(R1和R2);*c.在缺失盒的5,端，位于限制位點(diǎn)R1和抗菌 素抗性基因之間，還有一個(gè)酵母啟動(dòng)子。2基因剔除(基因打靶)與新基因功能鑒定基因剔除技術(shù)主要應(yīng)用于哺乳動(dòng)物，其原理也是 利用同源重組使基因失活?；虼虬?Gene targeting)定義：使外源基因定 點(diǎn)地整合到核基因組上的一種特殊的基因工程 技術(shù)。也叫做基因定點(diǎn)重組或基因剔除基因打靶的分子基礎(chǔ)：通過(guò)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中發(fā)生的 外源打靶基因與核基因組上的目標(biāo)基因之間的 DNA同源重組事件，使外源打靶基因定點(diǎn)地整 合到核基因組的特定位置上，從而達(dá)到改變細(xì)胞 遺傳特

28、性的目的?；虼虬械念愋停?a)插入型基因打靶；(b)取代型基因打靶基因打靶載體(Gene targetion vector)基因打靶的過(guò)程基因打靶的應(yīng)用：(a)新基因功能鑒定；提高基因表達(dá)效率；遣遺傳疾病的基因治療四、轉(zhuǎn)譯抑制與新基因功能鑒定1. RNA 干擾(RNA interference, RNAi)概念：近年來(lái)研究表明，一些小分子量的外源雙鏈RNA(dsRNA)當(dāng)其導(dǎo)入寄主細(xì)胞之后，便可促進(jìn) 與其同源的內(nèi)源mRNA發(fā)生特異性的降解作 用，從而高效特異地阻斷體內(nèi)相應(yīng)基因的表達(dá)活 性，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生奠基因剔除作用。這種RNA水平的基因抑制，是生物界普遍存在 的RNA水平調(diào)控基因表達(dá)的一種方

29、式，提供了 一種特異性失活功能基因的方法。研究表明，RNAi廣泛存在于真菌、擬南芥、水 螅、斑馬魚等大多數(shù)真核生物中，是生物體內(nèi)抵 御外耒來(lái)感染們的重要保護(hù)機(jī)理。RNAi的應(yīng)用：新基因的功能鑒定;有望在疾病防 御和治療的新藥開(kāi)發(fā)上發(fā)揮重要的作用。有關(guān)的名詞術(shù)語(yǔ)和略語(yǔ)dsRNA:雙鏈 RNA(double stranded RNA)siRNA:小分子量干擾 RNA (small interference RNA)RISC: RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA inducedsilencion complrx)RdRP : 依賴于 RNA 的 RNA 聚合酶 (RNA-dependent RNA po

30、lymerase)PIGS :轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Post-transcripotional gene silencing)TIGS:轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)的基因沉默(Transgene-induced gene silencing)VIGS:病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus-induced gene silencing)Dicer:切丁酶，是一種RNase111樣的核酸內(nèi)切酶 (Rnase111-Like)。能把 dsRNA 切割成 21-25bp的小分子量的干擾RNA,即 siRNA， 但這是需要能量ATP的過(guò)程。RNAi的分子機(jī)理研究依賴于RdRP的RNAI途徑不依賴于RdRP的RNAi途徑關(guān)于Dicer

31、和Slicer酶功能的作用機(jī)理RNAi 的觸發(fā)劑(Triggers of RNA silencing)siRNA的來(lái)源：由人工導(dǎo)入細(xì)胞的dsRNA經(jīng)Dicer酶切割成的 siRNA由浸染的RNA病毒復(fù)制的dsRNA經(jīng)Dicer酶切 割成的siRNA由脂質(zhì)體運(yùn)點(diǎn)的siRNA由小分子RNA前體(MicroRNAprecusor)等產(chǎn)生 的dsRNA經(jīng)Dicer酶切割由psiRNA載體持續(xù)合成的siRNApsiRNA克隆載體RNAi的新基因功能鑒定的優(yōu)越性*a.效率高，無(wú)需篩選突變體因此工作量??；*b.具有靶向性，根據(jù)psiRNA載體插入序列的 方向斷定被失活的目的基因的功能；*C.具有多重失活功能

32、，既可特異地使某一特 定基因沉默，也可同時(shí)使該基因家族的多個(gè) 成員沉默；*d. RNAi技術(shù)不會(huì)導(dǎo)致致死效應(yīng)，便于研究植 物生長(zhǎng)發(fā)育的相關(guān)基因的表達(dá)活性與功能。五、基因表達(dá)系列分析與新基因功能鑒定基因的差異表達(dá)(Differntial expression of gene)看家基因(House-keeping gene)發(fā)育調(diào)節(jié)基因(Developmental regulatedgene)基因的差異表達(dá)基因表達(dá)系列分析法的定義基因表達(dá)系列分析法(Serial analysis of gene expression),簡(jiǎn)稱SAGE，它是一種基于2型核酸內(nèi) 切限制酶和3型核酸內(nèi)切限制酶，對(duì)于cDN

33、A分子 聯(lián)合切割反應(yīng)的基因表達(dá)分析法。此法可快速、有 效、系統(tǒng)、全面地檢測(cè)某種特定組織或細(xì)胞中基因 表達(dá)的狀況，適于對(duì)大量基因的差異表達(dá)狀況進(jìn)行 系統(tǒng)的分析。SAGE技術(shù)是使用惟一的序列標(biāo)簽去鑒定每一種 mRNA分子?？赏瑫r(shí)檢測(cè)許多種基因在同一時(shí)空條 件下是否表達(dá)及其表達(dá)水平，而還可比較不同組織 不同條件下，基因表達(dá)的差異。原理基因表達(dá)系列分析法的基本原理是，cDNA分子中 同一種核酸內(nèi)切限制酶位點(diǎn)旁側(cè)的9個(gè)核苷酸序列， 可以代表一種cDNA分子的序列結(jié)構(gòu)特征。根據(jù)這 種長(zhǎng)度為9bp的核苷酸序列，能夠區(qū)分基因組中的 95%的基因。(49=262144種mRNA分子)所以這一 段序列可以作為特定基因的標(biāo)簽，特稱之為SAGE 標(biāo)簽。應(yīng)用特定的技術(shù)程序，能夠制備某一組