-常用中藥的生物鑒定-PCR-PPT課件

1、常用中藥的生物鑒定 之聚合酶鏈式反應常用中藥的生物鑒定方法免疫鑒定法電泳鑒定法生物效價鑒定法單純指標鑒定法細胞生物學鑒定法DNA遺傳標記鑒定法mRNA差異顯示鑒定法 聚合酶鏈式反應 (Polymerase Chain Reaction)，簡稱PCR，是一種分子生物學技術，用于放大特定的DNA片段?？煽醋魃矬w外的特殊DNA復制。 少量DNA 樣品快速擴增amplify技術。 (invented by Kary Mullis , won a Nobel Prize in Chemistry in 1993 )原 理 PCR 要 件模板Template 引物 Primers:Small piece

2、s of DNA.Made up of 15 to 30 bases.Binds the DNA at a specific region.forward and reverse 正向和逆向酶Enzyme: Taq DNA polymerase PCR核酸Nucleotides: Substrate, four deoxyribonucleotides (A,C,G,T) dNTPMDist H2O117 ul10X buffer15 uldNTP12 ulPrimer 13 ulPrimer 23 ulTaq polymerase 0.75 ul200ul tubePipette 上下混合取

3、出15 ul 剩下的加入3 ul Template DNA用pipette 上下混合分裝入tube 15ul/支標上1.51234554C 56 58 60 62Run PCRTcTc55 C 不加模板的對照組M 加入 1 ul 模板DNA不加引物但有模板的對照Pc15 ulMTC3 ul template (T)Pipette mixTC15ul/tubepcPC123451 ultemplateTTCPC1234554 55 56 57 58 60 62oC RNUProgramDenature 95C5 minDenaturation變性：雙鏈DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈D

4、NA，一般加熱至9095, 30 secAnnealing褪火：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈，5570，固稱其為褪火。 most important factor in the PCR ,45secExtension延伸：在Taq酶的作用下，以dNTP為原料，從引物的5端3端延伸，合成與模板互補的DNA鏈, 溫度為7075C, 1.5 minFinal extension 72 C, 5 min2x106優(yōu)點: need very small amount of sample缺點: amplified product may be contaminated with oth

5、er samples not related to the one Factors affect to PCRMg +2 concentration, Mg +2 specificity 0.15mmol/L Mg+2 預實驗Primer(引物) specificityDegenerate primer -to find the target gene in the closely related speciesspecificity , nonspecific products Annealing TemperatureToo high no PCR productToo low much

6、nonspecific product gradient Temp PCR machine find the suitable Temp Taq polymerase quality Template(模板) DNA quality PCR產物鑒定Agarose gel electrophoresis to check product1.5% Agarose in TAE buffer (17 ml)boilPour into the tray(assembled gel apparatus)After PCR amplificationAgarose gel electrophoresis

7、to check product1.5% agarose in 17 ml TAE ( 4mm thick)5 ul product add 1 ul 6X loading dye mix1Kb marker 2.5 ul100 V run 25-30 minEB stain 10 min(EB致癌物, 戴手套) ,photograph1.51.00.50.2Kb 10 gamma primer Mismatch 3 base10 gamma primer complete matchPCR的應用 1.detection genetically modification organism (G

8、MO )檢測轉基因生物，找出特異的基因或片段find specific gene or fragment (promoter) 2.uncultured microorganism 3.pathogen identification 4.detection insertion sequence (cloning)提取模板反應體系配置PCR擴增電 泳引物設計 烏梢蛇為中國藥典(2019版)一部收載的一種常用中藥，來源于游蛇科動物烏梢蛇Zaocys dhumnades(Cantor)的干燥體。有祛風、通絡、止痙之功效。用于風濕頑痹、麻木拘攣、半身不遂、抽搐痙攣、瘰癘惡瘡。 商品流通中多以紅點錦蛇、

9、黑眉錦蛇、玉斑錦蛇、王錦蛇、灰鼠蛇等來混作正品藥材進行銷售，這些品種多數與烏梢蛇同科不同屬，因其來源相近，造成鑒定困難。此外，藥材在加工處理時剖去內臟后，要進行干燥熏黑處理，皮上的花紋特征、顏色幾近消失，難以辨認，而且其大小、形態(tài)特征與烏梢蛇相近，這是造成其性狀鑒別困難的另一重要原因。 鑒于烏梢蛇作為中藥的臨床功效確切，但商品來源復雜、藥材性狀鑒別困難的現狀，為滿足目前市場常見混偽品的鑒別要求，尋找經濟實用、準確便捷、穩(wěn)定性高的方法，應用高特異性PCR方法對烏梢蛇藥材及其混淆品的原動物和炮制品進行鑒別。高特異性PCR方法鑒別烏梢蛇及其混淆品功效：祛風、通絡、止痙。市售混淆品：紅點錦蛇、黑眉錦蛇

10、、玉斑錦蛇、王錦蛇、灰鼠蛇等烏梢蛇高特異性PCR鑒別引物的設計從GenBank下載正品原動物烏梢蛇及混偽品線粒體12S rRNA基因序列 經DNAMAN軟件對位排列分析正、混品間DNA序列差異，設計出一對能特異性擴增烏梢蛇12S rRNA基因片段的特異性鑒別引物HWL-1和HWH-1 （上海生工生物合成公司）模板DNA的提取 基本要求是除去雜質，并部分純化標本中的核酸。多數樣品需要經過SDS和蛋白酶K處理。所得到的粗制DNA，經酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應模板。 特異性PCR鑒別反應體系： Tris-HCl 10mmol/L 氯化鉀 50mmol/L Mg2+ 1.5mmol/L dNTP 0.15mol/L Taq 1U(40ml) 引物 0.15mol/L 模板DNA 50ng步驟預變性 95C4 min 變性 95 C 40 sec褪火 65 C 1min延伸 72 C 30sec延伸 72 C 5 min設置無DNA模板的陰性對照通用引物構成的陽性對照25cys瓊脂糖凝膠電泳