核酸抽取及雜交

1、核酸抽取及雜交第一部分 DNA提取總論一、提取DNA總的原則：1 保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；2 其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類 分子的污染應(yīng)降低到最低程度；3 核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子；4 其他核酸分子，如RNA，也應(yīng)盡量去除。二、樣本來(lái)源：理論上所有有核真核細(xì)胞、細(xì)菌、病毒都可以提取DNA樣本選擇取決于試驗(yàn)?zāi)康娜腔蚪M提取最常見的樣本血清、血漿、外周血有核細(xì)胞、痰液、體液、棉拭子采集的各種分泌物、組織（包括骨髓）和羊水等都是分子診斷的檢驗(yàn)材料，其中全血、血漿（血清）標(biāo)本占分子診斷的60%以上 DNA提取前樣本采集、預(yù)處理和保存：（一）全血 1.抗

2、凝劑 EDTA-Na2 或枸櫞酸鈉 作為抗凝劑 不宜使用肝素 抗凝劑處理血肝素檸檬酸*EDTA*-80保存2個(gè)月，第10天收率90%4 第四天收率90%第10天提取效果差第十天收率85%室溫提取效果差第四天收率90%第十天提取效果差mRNA逆轉(zhuǎn)錄后RT-PCR結(jié)果（0、3、6個(gè)月）A B C D（二）血漿和血清血漿和血清是檢測(cè)釋放入血的游離核酸最主要的標(biāo)本來(lái)源，用來(lái)檢測(cè)病毒、細(xì)菌，以及腫瘤細(xì)胞等等釋放出來(lái)的游離核酸和蛋白質(zhì)產(chǎn)物，在臨床上被廣泛應(yīng)用于病原微生物和腫瘤標(biāo)志基因的檢測(cè)中 血漿DNA又稱為循環(huán)DNA，是一種無(wú)細(xì)胞狀態(tài)的胞外DNA，主要是游離的單鏈、雙鏈DNA或DNA-蛋白質(zhì)的混合物它在

3、未來(lái)分子診斷的應(yīng)用中具有廣闊前景血漿DNA成分的來(lái)源分為內(nèi)源性和外源性兩個(gè)部分，其中入侵的病毒、細(xì)菌等病原體釋放入血液的核酸是外源性血漿DNA最重要的成分血漿DNA內(nèi)源性循環(huán)DNA外源性循環(huán)DNA自身基因組來(lái)源DNA入侵的病毒、細(xì)菌等病原體死亡細(xì)胞活細(xì)胞釋放（三）體液尿液、胸水、腹水和腦脊液等標(biāo)本離心后取沉淀提取體液中細(xì)胞的核酸對(duì)釋放入體液中的病毒或細(xì)菌的游離核酸，采用超高速離心或體液濃縮后再提取核酸（四）分泌物（以痰液為例）痰液是檢測(cè)呼吸道病原體核酸的主要樣本，深部咳痰，患者采集早晨起床后的第一口痰，采集前應(yīng)先漱口，以避免混入大量的口腔脫落的上皮細(xì)胞和唾液等影響檢測(cè)結(jié)果 結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)，

4、可以用NaOH液化痰液去除粘液和蛋白質(zhì)；非結(jié)核分枝桿菌的核酸，使用生理鹽水后取上清液 痰液檢測(cè)病原體核酸不適宜作定量分析，檢測(cè)時(shí)盡可能提高痰液中細(xì)胞成分的回收率三、DNA的收率樣本類型基因組DNA收率20mg肝臟組織8 g100mg豆苗10 g100l全血2 g2106培養(yǎng)細(xì)胞10 g四、DNA提取的基本步驟1、核酸的釋放： 破裂細(xì)胞 釋放核酸 機(jī)械法與非機(jī)械法 （非機(jī)械法中溶胞法是應(yīng)最廣泛的方法）各種組織細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法 應(yīng)用 機(jī)械法1勻漿法機(jī)體軟組織2搗碎法動(dòng)物韌性組織3研磨法細(xì)菌、酵母 物理法1超聲法細(xì)胞混懸液2反復(fù)凍融法培養(yǎng)細(xì)胞3冷熱交替法細(xì)菌、病毒4低滲裂解紅細(xì)胞 化學(xué)法1有

5、機(jī)溶劑細(xì)菌、酵母2去垢劑組織、培養(yǎng)細(xì)胞3酶解法細(xì)菌、酵母破裂細(xì)胞 、釋放核酸2、核酸的分離與純化： 將含有核酸分子復(fù)雜復(fù)合物中，將核酸與其 他物質(zhì)分離 非核酸的大分子污染物（蛋白質(zhì)、多糖和脂 類分子）、非需要的核酸分子、試劑和溶液3、核酸的濃縮、沉淀與洗滌沉淀可去除部分雜質(zhì)與某些鹽離子加入一定的鹽類（醋酸鈉、氯化鈉等）后使用有機(jī)溶劑（如乙醇、異丙醇等）少數(shù)鹽類可使用70-75%的乙醇洗滌4、DNA鑒定 DNA的鑒定 濃度鑒定 純度鑒定 完整性鑒定濃度鑒定1）紫外分光光度法：測(cè)定DNA在A260nm的光吸收值。 如計(jì)算DNA濃度 A260稀釋倍數(shù)50 g/mlug/ml的核酸溶液。(A值等于1時(shí)

6、，相當(dāng)于50g/ml雙鏈DNA， 40g/ml單鏈DNA或RNA，20g/ml單鏈寡核苷酸） 各種堿基的紫外吸收光譜2）熒光光度法 熒光染料溴化乙錠，可嵌入到堿基平面，而發(fā)出熒光，且熒光強(qiáng)度與核酸含量呈正比。 適用于低濃度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）EB與DNA的結(jié)合500l全血提取的基因組DNA電泳動(dòng)物組織提取基因組DNA純度鑒定紫外分光光度法： 在260nm和280nm處測(cè)定DAN溶液的光吸收，純的DNA，低于此值表明制備物中留有蛋白質(zhì)成份。高于此值表明有RNA的殘留量。 A260與A280之比應(yīng)在1.80；純的RNA A260與A280之比應(yīng)在2.0。 A260/A280比值是純度

7、檢測(cè)的重要指標(biāo)。完整性鑒定凝膠電泳法： 基因組DNA電泳，在電場(chǎng)中泳動(dòng)慢，如果發(fā)生降解，可出現(xiàn)電泳圖譜脫尾現(xiàn)象； 總RNA電泳，觀測(cè)各條帶的含量，提示是否存在RNA降解；如加樣槽中存在條帶，可能是DNA污染。5、核酸的貯存DNA保存 1）短期貯存： 4或-20存放于TE（tris和EDTA）緩沖液中。 TE緩沖液的PH與DNA 貯存有關(guān)，PH為8時(shí)，可減少DNA脫氨反應(yīng)，PHDNA容易變性。2）長(zhǎng)期貯存： TE緩沖液中-70保存數(shù)年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止細(xì)菌和核酸的污染。第二部分 基因組DNA的分離與純化一、DNA樣品準(zhǔn)備 常見的標(biāo)本： 血液、尿液、唾液、組織及培養(yǎng)細(xì)胞等 生物組

8、織： 最好新鮮組織，若不能馬上提取，應(yīng)貯存 70或液氮二、DNA提?。ㄒ唬┓映樘岱ǎ?先用EDTA、 SDS 、蛋白酶K破碎細(xì)胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris飽和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或異丙醇進(jìn)行沉淀。獲DNA大小為100150kb。DNA酚抽提法示意圖主要試劑的作用： EDTA：1 二價(jià)金屬螯合劑，抑制核酸酶； 2 降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性SDS的作用：1 溶解膜蛋白和脂肪，從而是細(xì)胞膜破裂溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸 釋放出來(lái)3 對(duì)RNA、DNA酶有抑制作用4 與蛋白質(zhì)形成R-O-SO3 .R蛋白質(zhì)復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性蛋白酶K：水解蛋白質(zhì)的作用，消化DNA酶和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)蛋

9、白酶K與其他蛋白酶相比，它具有更強(qiáng)的水解能 力，而且在SDS、EDTA存在時(shí)仍保持較高活性，可 同時(shí)使用苯酚的特點(diǎn)：蛋白質(zhì)強(qiáng)變性劑、抑制DNA酶活性苯酚溶于有機(jī)溶劑，微溶于水提取DNA前苯酚用Tris-Hcl飽和，防止吸收過(guò)多DNA，降低DNA的損失率氧化苯酚會(huì)破壞DNA為什么苯酚要重蒸飽和后才能用于DNA的分離？ 苯酚在空氣中經(jīng)常被氧化生成醌，它能夠產(chǎn)生自由基，直接用于DNA分離，會(huì)使磷酸二酯鍵斷裂，造成DNA降解。 氧化苯酚需要經(jīng)過(guò)高溫重蒸以除去氧化物，并用Ttis-Hcl飽和酚，并調(diào)節(jié)至中性。的Tris溶液可以似的抽提出的DNA進(jìn)入水相，減少在蛋白質(zhì)層滯留。在酚或酚-氯仿中加入少許的異戊

10、醇，是可以減少實(shí)驗(yàn)中的氣泡的產(chǎn)生，而且利于分相，保持分相的穩(wěn)定性。DNA的沉淀1）無(wú)水乙醇沉淀 沉淀前往往加入NaCl等鹽離子，作用是中和核酸分子表面的負(fù)電荷，有助于分子之間的聚集。 無(wú)水乙醇可以吸收分子之間的水，使DNA沉淀析出，無(wú)水乙醇使用前冰凍，可以減少DNA沉淀析出過(guò)程釋放熱量對(duì)DNA的損傷。2）異丙醇沉淀 除了使DNA沉淀外，還可以溶解少量的小的RNA分子（二） 甲酰胺解聚法：破碎細(xì)胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，再透析獲得DNA。高濃度甲酰胺可以裂解蛋白質(zhì)與DNA的復(fù)合物，可以使蛋白質(zhì)變性。減少了酚多次抽提的步驟甲酰胺解聚法適用于從標(biāo)本中制備高分子量的DNA樣品

11、?？傻肈NA 200kb左右。（三） 玻璃棒纏繞法：用鹽酸胍裂解細(xì)胞，將裂解物鋪于乙醇上，然后用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DAN沉淀液繞于玻棒。生成DNA約80kbDNA玻棒纏繞法示意圖（四） 表面活性劑快速制備法：用Triton X-100或NP40表面活性劑破碎細(xì)胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。二、DNA的濃縮1、固體聚乙二醇（PEG）濃縮：用透析袋 外敷PEG至合適量2、丁醇抽提濃縮：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不會(huì)。因此重復(fù)幾次可顯著減少DNA體積三、DNA回收 主要是從電泳中分離回收DNA片段回收原則：盡量提高回收率 去除回收DNA樣品中的污染物（

12、二） 從聚丙烯酰胺凝膠回收DNA片段（一） 從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段1.二乙基氨基乙基-纖維素膜插片電泳法4.低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠挖塊回收法 （一） 從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段電泳到DEAE-纖維素膜 ： DEAE是一種陰離子交換纖維素，可以吸附帶有負(fù)電荷的DNA分子 在所需條帶前插入DEAT-纖維素膜，繼續(xù)電泳至條帶DNA都到膜上，取出洗下 500bp-5kb的DNA片段回收率較好，純度高。但不適用于分子量超過(guò)10kb和單鏈DNA 透析袋電洗脫 ： 切下條帶的瓊脂糖凝膠，放透析袋內(nèi)，加緩沖液后繼續(xù)電泳，DNA出膠后進(jìn)行抽提DNA回收。 低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠： 切下膠，加熱到65熔化膠，然后抽提

13、回收DNA。 方法：有機(jī)溶劑提取法、玻璃珠洗脫法和瓊脂水解酶等。 瓊脂水解酶：將含DNA的凝膠進(jìn)行消化，瓊脂糖水解成二糖，釋放DNA，后使用酚抽提方法回收DNA （二） 從聚丙烯酰胺凝膠回收DNA片段 聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA的標(biāo)準(zhǔn)方法是壓碎與浸泡法。雖費(fèi)時(shí)但操作簡(jiǎn)單，是小片段DNA回收的較好方法。至今尚無(wú)一種方法既能有效回收DNA大片段或微量的DNA片段，又能同時(shí)回收幾種DNA片段并有效清除凝膠中酶促反應(yīng)抑制劑。DNA提取試驗(yàn)中常遇到的問(wèn)題基因組DNA收率較低或無(wú)基因組DNA 樣本材料太少 細(xì)胞破裂不夠充分，DNA釋放不完全 離心力偏小 兩相分離不完全 DNA降解的原因 樣本不夠新鮮，采集

14、材料過(guò)陳舊 樣本本身存在大量DNA酶提取DNA的生物活性差的原因？ 提取的基因組DNA鹽濃度過(guò)高 基因組DNA中乙醇未清除凈 基因組DNA中可能存在其他抑制因素提取基因組DNA，有時(shí)加入蔗糖的原因 加入多糖，保護(hù)DNA長(zhǎng)度質(zhì) 粒 DNA 制 備plasmid extraction 質(zhì)粒簡(jiǎn)介質(zhì)粒(plasmid)是細(xì)菌內(nèi)獨(dú)立于染色體并能自我復(fù)制的小環(huán)狀DNA分子 其大小范圍從lkb至200kb以上不等。 已經(jīng)在形形色色的細(xì)菌類群中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒. 這些質(zhì)粒都是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù) 制和遺傳的輔助性遺傳單位。 Chromosome DNA genomePlasmid DNA 質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入

15、細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值，而質(zhì)粒的分離與提取則是最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù) 質(zhì)粒特性1. 分子相對(duì)小 2. 含有高效的自主復(fù)制成分 3. 不相容性(incompatibility)4. 轉(zhuǎn)移性5. 選擇的標(biāo)記(selective markers)6. 限制性內(nèi)切酶單一切口質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 分子量相對(duì)較小 共價(jià)閉合分子 雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)具有更強(qiáng)的抗切割和抗變性能力超螺旋DNA分子 線性DNA分子 半開環(huán)DNA分子Plasmid vectors表達(dá)載體載體含有tac啟動(dòng)子、Lac操縱基因、SD序列、Lac I阻遏蛋白基因等 Exprssion vect

16、or 細(xì)菌收集純化質(zhì)粒DNA細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌裂解質(zhì)粒DNA的提取和純化 質(zhì)粒DNA的提取和純化 一、細(xì)菌的培養(yǎng) (bacterial culture)l 先分離單個(gè)菌落，接種到含少量適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基中擴(kuò)增，隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)，質(zhì)粒DNA也在自主復(fù)制。 對(duì)于松弛型質(zhì)粒，由于它的復(fù)制在一定程度上不受到宿主細(xì)胞的控制，故在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，加入氯霉素（chloromycetin）抑制宿主蛋白質(zhì)的合成和染色體DNA的復(fù)制。質(zhì)粒DNA的復(fù)制不受影響而大量擴(kuò)增l 所以使用氯霉素的主要目的，是在不減低質(zhì)粒產(chǎn)量的前提下，減少細(xì)菌的培養(yǎng)體積和細(xì)菌的數(shù)量 有時(shí)質(zhì)粒在細(xì)菌中的擴(kuò)增狀況很差，常是由于質(zhì)粒攜帶外源基因或質(zhì)粒分

17、子量過(guò)大所致。二、細(xì)菌的收集(bacterial collection)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，排出大量代謝產(chǎn)物，為了提高質(zhì)粒DNA的純度，離心棄上清，細(xì)菌沉淀最好用STE或生理鹽水懸浮，漂洗l-2次，離心管壁上的液體也應(yīng)該仔細(xì)去除干凈。 三、細(xì)菌裂解細(xì)胞的裂解方法很多，如去污劑法，沸水熱裂法、堿變性法，有機(jī)溶劑法和溶菌酶法等。不同方法各有利弊，一般要根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)、宿主菌的特性及后繼的純化方法等多種因素綜合后加以選擇。 質(zhì)粒提取的方法堿裂解法 (Alkaline )煮沸裂解法SDS裂解法其他質(zhì)粒DNA提取方法的選擇 l 常用的煮沸法，堿法,SDS法均可獲得較滿意效果至于有人采用堿法提取小量細(xì)菌培養(yǎng)物的

18、質(zhì)粒， 用煮沸法或SDS法進(jìn)行質(zhì)粒DNA的大量分離，只是各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的習(xí)慣問(wèn)題.l選擇哪種方法制備質(zhì)粒DNA，應(yīng)考慮以下因素： 1菌株類型（type） 2質(zhì)粒的大小(size) 3細(xì)菌染色體DNA變性條件強(qiáng)弱的控制 (denaturation condition)質(zhì)粒DNA的小量制備 2-5ml質(zhì)粒DNA的大量制備 500ml大質(zhì)粒（15kb）的處理方法： 采用溫和處理方法，使用蔗糖、溶菌酶、EDTA，后再使用SDS裂解，使plasmid損傷減少小質(zhì)粒（15kb）的提取。但有一部分質(zhì)粒DNA會(huì)與細(xì)胞碎片纏繞在一起而丟失，故產(chǎn)率不高。（四）其它方法2、牙簽少量制備法1、 小量一步提取法1、 小量一

19、步提取法 直接將酚/氯仿與細(xì)菌培養(yǎng)物混合，然后離心去除大部分蛋白質(zhì)和染色體DNA，最后從上清液中回收質(zhì)粒DNA。本法簡(jiǎn)單快捷、成本低，提取的質(zhì)?？捎糜谙拗菩詢?nèi)切酶圖譜分析。（二）牙簽少量制備法 用牙簽直接挑取生長(zhǎng)在瓊脂平板上的細(xì)菌菌落制備質(zhì)粒DNA。 由于制備的質(zhì)粒DNA有較多污染，不能用于分子克隆中的酶學(xué)反應(yīng)，但可用于質(zhì)粒的鑒定。質(zhì)粒DNA的純化.CsCl-EB法.聚乙二醇沉淀法.柱層析法EBCsCl密度梯度離心法EB插入相鄰的堿基之間，降低了DNA的浮力密度，但超螺旋的DNA結(jié)合EBg/cm3。CsCl可以用丁醇抽提，透析除去。純度可達(dá)100%。 超速離心將介質(zhì)CsCl形成一連續(xù)的密度梯度

20、，在過(guò)量EB存在下，蛋白質(zhì)的密度最小位于最上層；RNA密度最大沉于管底；DNA位于中間，由于不同結(jié)構(gòu)的DNA與EB結(jié)合度不一致，因此密度下降不一致，故將線性、開環(huán)、閉環(huán)的DNA區(qū)分開。EBCsCl密度梯度離心法示意圖l轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染及DNA外切酶酶切缺失等實(shí)驗(yàn)，對(duì)閉合環(huán)狀雙鏈DNA的要求較高，一般還是用超速離心法純化質(zhì)粒。 對(duì)于DNA片段酶切回收，內(nèi)切酶圖譜分析、細(xì)菌轉(zhuǎn)化、亞克隆及探針?lè)派湫詷?biāo)記等實(shí)驗(yàn)，直接用小量或中量提取的DNA樣品，并不需要超速離心純化，一般可滿足實(shí)驗(yàn)要求。2 聚乙二醇沉淀法 分級(jí)沉淀，首先利用LiCl沉淀大分子RNA，用Rnase酶消化小分子RNA；在利用乙二醇

21、選擇性沉淀大質(zhì)粒DNA，再利用酚-氯仿抽提。 方法簡(jiǎn)單實(shí)用，但是不能區(qū)分環(huán)狀或開鏈質(zhì)粒DNA3 柱層析法以硅基質(zhì)作為填充層析柱的樹脂，在多鹽的條件下，DNA與硅基質(zhì)可逆性的結(jié)合進(jìn)行純化。多鹽造成磷酸二酯骨架脫水，通過(guò)暴露的磷酸鹽殘基與硅基質(zhì)結(jié)合，然后用50%的乙醇洗去RNA和糖類物質(zhì)，再加入TE或水，離心洗脫。RNA的分離與純化RNA isolation and purification每個(gè)細(xì)胞的RNA量約為10-5 g 80%-85% rRNA 10%-15% tRNA 1%-5% mRNA 其他RNA：hnRNA、 snRNA 、snoRNA組織材料起始樣品量Total RNA提取量blo

22、od1ml1520glecukocytes1107個(gè)約100 gLiver tissue1g約5000 gCulture cells1107個(gè)約100gRenal tissue1g約3000gSkeleton tissue1g約1500gCerebral tissue1g約1500g一、關(guān)于RNase酶RNA易被RNase水解，RNase除胞內(nèi)還廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周圍的環(huán)境中RNase具有水解核糖殘基和磷酸二酯鍵RNase分子結(jié)構(gòu)中的二硫鍵使其生物學(xué)活性非常穩(wěn)定，去除變性劑后，RNase的活性又可恢復(fù)。Rnase不需要二價(jià)陽(yáng)離子激活去除RNase的污染及強(qiáng)有力地抑制其活性是RNA

23、制備成功與否的關(guān)鍵。必須在總RNA提取分離的最初階段，盡可能地滅活胞內(nèi)RNase的活性。RNA酶（intrinsic RNase）RNA酶(extrinsic RNase)主要來(lái)源： 被污染的緩沖液 細(xì)菌或微生物污染，高壓不能去除RNA酶， 必須丟棄 自動(dòng)移液裝置RNA酶污染的措施設(shè)置專門RNA移液裝置小份保存緩沖液設(shè)置專門的RNA電泳裝置準(zhǔn)備溶液或緩沖液時(shí)，使用無(wú)RNA酶的器皿、 DEPC處理水等分離RNA過(guò)程中使用RNA酶抑制劑1. 變性劑(denaturant)選擇性地使用RNase的變性劑（如酚、氯仿及強(qiáng)烈的胍類變性劑）使用蛋白酶K(proteinase K) 使用陰離子去污劑如SDS

24、、十二烷基肌氨酸鈉或脫氧膽酸鈉二、RNA酶抑制劑和變性劑胍類變性劑(carbamidine)：胍鹽是破壞蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的離液劑。蛋白質(zhì)變性劑中作用最強(qiáng)的是異硫氰酸胍和鹽酸胍，使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換成隨機(jī)卷曲狀態(tài)。鹽酸胍抑制RNA酶作用強(qiáng)，變性作用較異硫氰酸胍弱。異硫氰酸胍自身可形成氫鍵，在還原劑存在下斷裂氫鍵。聯(lián)合使用RNase的特異抑制劑（如RNasin與DEPC等）能極大地防止內(nèi)源性RNase對(duì)RNA的降解。2.RNA酶抑制劑(RNase inhibitor)（1）DEPC（焦碳酸二乙酯）高度活化的烷基化試劑，破壞RNA酶活性。用來(lái)滅活緩沖液或器皿中的RNA酶。 OC-CH2-CH3OC-CH2-C

25、H3O=DEPC水制備：0.1%DEPC在37C處理1h，并高壓滅菌15min。玻璃制品和塑料制品應(yīng)浸泡在0.1%的DEPC水溶液中， 37C處理1h或室溫下過(guò)夜。DEPC非選擇性的修飾蛋白質(zhì)和RNA，且與一些緩沖液不相容，故在分離和純化RNA的過(guò)程中不使用DEPC。（2）RNA酶的蛋白抑制劑許多RNA酶可以與該類蛋白質(zhì)結(jié)合形成非共價(jià)復(fù)合物從而是RNA酶失活。RNA酶蛋白抑制劑與靶蛋白的親和力大。商品化的RNA酶蛋白抑制劑的名稱各異（如RNAsin等）。加入-疏基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）等還原劑可以還原RNase中的二硫鍵，有利于RNase的變性、水解與滅活。RNA提取實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備【使用器具

26、】 盡量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，則使用0.1%DEPC水溶液在37處理12h，后120高壓30min，去除殘留DEPC【試劑配制】 無(wú)菌水須用0.1%DEPC處理后高溫高壓滅菌 RNA實(shí)驗(yàn)試劑應(yīng)RNA提取專用，避免其他試劑交叉污染【其他】 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用一次性手套，并經(jīng)常更換；在RNA專用區(qū)操作，操作過(guò)程中避免交談 三、酸性異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法首先以含異硫氰酸胍、-疏基乙醇和十二烷基肌氨酸鈉的變性溶液裂解細(xì)胞。然后在的條件下，酚/氯仿抽提細(xì)胞裂解溶液。最后通過(guò)異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌而獲得總RNA。本法具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、高效及提取的RNA質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)，能在3小時(shí)內(nèi)迅速處理多個(gè)標(biāo)本?？俁NA產(chǎn)量取決于標(biāo)本的起始量，每mg組織大約能制備47g總RNA，每106個(gè)細(xì)胞大約為410g。 四、商品化的單相裂解試劑法分RNA本法是異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法的改進(jìn)方案。以異硫