人I型膠原ColⅠELISA試劑盒組成說(shuō)明書(shū)

1、人I型膠原（Col-I）ELISA試劑盒組成說(shuō)明書(shū)本試劑僅供研究利用目的：本試劑盒用于測(cè)定人血清，血漿及相關(guān)液體樣本中人I型膠原（Col-1）的含量實(shí)驗(yàn)原理：本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中人I型膠原（Col-I）水平。用純化的人I型膠原（Col-I）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入I型膠原（Col-I）,再與HRP標(biāo)記的I型膠原（Col-I）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，通過(guò)完全洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色白深淺和樣品中的I型膠原（Col-I）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光

2、度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人I型膠原（Col-I）含量。試劑盒組成：試劑盒組成48孔配置96孔配置保存說(shuō)明書(shū)1份1份封板膜2片(48)2片(96)密封袋1個(gè)1個(gè)酶標(biāo)包被板1X481X962-8C保存標(biāo)準(zhǔn)品：45閔/LX1瓶X1瓶2-8C保存標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液X1瓶X1瓶2-8C保存酶標(biāo)試劑3mlx1瓶6mlx1瓶2-8C保存樣品稀釋液3mlx1瓶6mlx1瓶2-8C保存顯色劑A液3mlx1瓶6mlx1瓶2-8C保存顯色劑B液3mlx1瓶6mlx1瓶2-8C保存終止液3mlx1瓶6mlx1瓶2-8C保存20倍濃縮洗滌液20mlx1瓶30mlx1瓶2-8C保存樣本處置及要求：.血清：室溫血液自

3、然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。認(rèn)真搜集上清，保留進(jìn)程中如顯現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。.血漿：應(yīng)依照標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。認(rèn)真搜集上清，保留進(jìn)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。.尿液：用無(wú)菌管搜集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。認(rèn)真搜集上清，保留進(jìn)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參如實(shí)行。.細(xì)胞培育上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管搜集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。認(rèn)真搜集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度

4、達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。認(rèn)真搜集上清。保留進(jìn)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。.組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入必然量的PBS，。用液氮迅速冷凍保留備用。標(biāo)本融化后仍然維持2-8的溫度。加入必然量的PBS（），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。認(rèn)真搜集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。.標(biāo)本搜集后及早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。假設(shè)不能馬上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20保留，但應(yīng)幸免反復(fù)凍融.不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)

5、氧化物酶的（HRP）活性。操作步驟標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一、第二孔中別離加標(biāo)準(zhǔn)品100出然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液504,混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100d別離加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔別離加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50小混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50M棄掉，再各取50M別離加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中別離加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50M別離加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中別離加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50出混勻后從第七、第八孔中別離取50M加到第九、第十孔中，再在第九第十孔別離加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50口，混勻后

6、從第九第十孔中各取50M棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50小濃度別離為300L,20聞/L,10聞/L,5L,聞/L）。加樣：別離設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40小然后再加待測(cè)樣品10口（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡可能不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。溫育：用封板膜封板后置37溫育30分鐘。配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。洗滌：警惕揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50口，空白孔除外。 TOC o 1-5

7、h z 溫育：操作同3。洗滌：操作同5。顯色：每孔先加入顯色劑A50U,再加入顯色劑B50M,輕輕震蕩混勻，37c避光顯色15分鐘.終止：每孔加終止液50聞終止反映（現(xiàn)在藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。.測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘之內(nèi)進(jìn)行。注意事項(xiàng)：試劑盒從冷藏環(huán)境中掏出應(yīng)在室溫平穩(wěn)15-30分鐘后方可利用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保留。濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不阻礙結(jié)果。各步加樣均應(yīng)利用加樣器，并常常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以幸免實(shí)驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)刻最好操縱在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦利用排槍加

8、樣。請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量太高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的OD值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋必然倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以總稀釋倍數(shù)（XnX5）o封板膜只限一次性利用，以幸免交叉污染。底物請(qǐng)避光保留。.嚴(yán)格依照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定必需以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)8.所有樣品，洗滌液和各類廢棄物都應(yīng)按傳染物處置。.本試劑不同批號(hào)組分不得混用。.如與英文說(shuō)明書(shū)有異，以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在座標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，依照樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代