實驗五 固體發(fā)酵纖維素酶米氏常數(shù)Km的測定

1、實驗五 固體發(fā)酵纖維素酶米氏常數(shù)Km的測定、目的了解纖維素酶的種類和測定原理，掌握其活力的測定方法。二、原理纖維素酶在一定溫度和pH條件下，將纖維素底物（濾紙）水解，釋放出還原糖。在堿性、 煮沸條件下，3, 5 一二硝基水楊酸（DNS試劑）與還原糖發(fā)生顯色反應(yīng)，其顏色的深淺與還 原糖（以葡萄糖計）含量成正比。通過在540 run測其吸光度，可得到產(chǎn)生還原糖的量，計算 出纖維素酶的濾紙酶活力。以此代表纖維素酶的酶活力。酶活定義以濾紙為底物，在一定反應(yīng)條件（50C，pH4.8，恒溫1h）下，以水解反應(yīng)中每小時催 化底物水解形成1mol葡萄糖的酶量為一個單位（U）。三、試劑和溶液（一）除非另有說明，

2、在分析中僅使用確認為分析純的試劑和蒸餾水或去離子水或相當純度 的水。1 DNS試劑稱取3, 5 一二硝基水楊酸（10 士 0. 1）g，置于約600 mL水中，逐漸加入氫氧化鈉log， 在50C水浴中（磁力）攪拌溶解，再依次加入酒石酸甲鈉200 g、苯酚（重蒸）2g和無水亞硫 酸鈉5g，待全部溶解并澄清后，冷卻至室溫，用水定容至：000mL，過濾。貯存于棕色試劑 瓶中，于暗處放置7d后使用。2檸檬酸緩沖液，0. 05 mol/L pH 4.8（適用于酸性纖維素酶）稱取一水檸檬酸4.83 g，溶于約750 mL水中，在攪拌情況下，加入檸檬酸三鈉7.94g， 用水定容至1000 mL。調(diào)節(jié)溶液的p

3、H到到（4.8 士 0.05）備用。注:也可采用pH4.8乙酸緩沖溶液:稱取三水乙酸鈉8. 16 g，溶于約750 ml，水中，加 入乙酸2.31 ml，用水定容至1 000 ml.調(diào)節(jié)溶液的pH到（4.810.05）備用 3葡萄糖標準貯備溶液（4mg/ml）同實驗四 上述系列濃度應(yīng)根據(jù)需要自行調(diào)整。.5快速定性濾紙（杭州新華一號濾紙）滬15 cm（每批濾紙，使用前用標準酶加以校正）。（二）儀器除普通實驗室儀器外，還應(yīng)有：1分光光度計2酸度計精度10.01 pH 3恒溫水?。?0 士 0.l）0C4分析天平感量0.1 mg 5磁力攪拌器6秒表或定時鐘7沸7k洛（可用800W申爐和高腳燒杯、楠夸

4、量杯或茸楠奔器切成）8具塞刻度試管25 mL四、操作步驟4.1繪制標準曲線按表A. l規(guī)定的量，分別吸取葡萄糖標準使用溶液A.2.5）、緩沖溶液（A.2.2或A.2.3） 和DNS試劑（A.2.1）于各管中（每管號平行作3個樣），混勻。將標準管同時置于沸水浴中，反應(yīng)10 min。取出，迅速冷卻至室溫，用水定容至25 mL.蓋塞，混勻。用10 mm比色杯，在分光光度計波長540 n處測量吸光度。以葡萄糖 量為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，獲得線性回歸方程。線性回歸系數(shù)應(yīng)在 0.9990以上時方可使用（否則須重做）。表1葡萄糖標準曲線管號葡萄糖標準使用溶液緩沖液吸取量mLDNS試劑吸取量

5、 mL濃度4mg/mL吸取量mg/mL10.00.02.03.020.80.21.83.031.60.41.63.042.40.61.43.053.20.81.23.064.01.01.03.04.2. 1酶液的制備稱取固體酶樣1 g,精確至0.1 mg（或吸取液體酶樣1 mL,精確至0. 01 mL）,用水溶 解，磁力攪拌混勻，準確稀釋定容50ml（使試樣液與空白液的吸光度之差恰好落在0.3-0.4 范圍內(nèi)），放置10 min，待測。4.2 .2分別稱取20、30、40、50、60mg和70mg粉碎后的秸稈于25mL具塞試管中，（一支 空白管，三支樣品管），并最好標記，分別準確加ApH=4.

6、8的檸檬酸緩沖液1.5mL，并加入 稀釋好的待測酶液0.50mL于三支樣品管中（空白管不加），使管內(nèi)溶液浸沒秸稈，混勻， 蓋塞。將這四支試管同時置于（500.1）C振蕩水浴中，反應(yīng)60min取出。立即準確向各管 中加入DNS試劑3.0mL。再于空白管中準確加入稀釋好的待測酶液0.5mL，混勻。將這四 支試管沸水浴10min，取出，迅速冷卻至室溫，加水定容至25mL，混勻。在分光光度計為540nm波長下，以空白管（對照液）調(diào)儀器零點，分別測量三支平行管中 樣液的吸光度，取平均值。以吸光度平均值查標準曲線計算出還原糖的含量。最后，以酶活性單位（v）的倒數(shù)1/v為縱坐標，以底物濃度S的倒數(shù)1/S為橫坐標， 在坐標紙上描點并連成直線，求該酶的Km值。表2秸稈酶活反應(yīng)體系管號秸稈mg酶液吸取量 mg/mL緩沖液吸取量mLDNS試