醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

1、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)抗原或抗體的體外檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)是指抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。體外的抗原-抗體反應(yīng)被廣泛應(yīng)用于： 抗原/抗體的定性鑒別 抗原/抗體的定量檢測(cè) 蛋白質(zhì)或細(xì)胞的分離純化22022/7/23抗原-抗體反應(yīng)的特點(diǎn)特異性 空間構(gòu)象互補(bǔ)可逆性 非共價(jià)結(jié)合可見(jiàn)性階段性 特異性結(jié)合階段 和 反應(yīng)可見(jiàn)階段32022/7/234抗原-抗體反應(yīng)效價(jià)多價(jià)結(jié)合單價(jià)結(jié)合二價(jià)結(jié)合抗原-抗體反應(yīng)的親合力低高很高親和力 affinity親合力 avidity5抗原-抗體反應(yīng)的 等價(jià)區(qū)(肉眼可見(jiàn)免疫復(fù)合物沉淀)抗原過(guò)剩區(qū) 存在游離抗原(肉眼不可見(jiàn)沉淀)抗體過(guò)剩區(qū) 存在游離抗體(肉眼不可見(jiàn)沉淀

2、)抗原-抗體反應(yīng)的影響因素 電解質(zhì) 體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)常用生理鹽水 溫度 37 最適 pH值 6 8 最適62022/7/23抗原-抗體反應(yīng)的檢測(cè)方法早期的檢測(cè)方法 肉眼直接可見(jiàn)，靈敏度低 凝集反應(yīng) 沉淀反應(yīng) 補(bǔ)體參加的反應(yīng)現(xiàn)代免疫學(xué)常用的方法 免疫標(biāo)記技術(shù)72022/7/23凝集反應(yīng)顆粒性抗原 (細(xì)菌、細(xì)胞等) 與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合后，形成肉眼可見(jiàn)的凝集團(tuán)塊。 直接凝集反應(yīng) (玻片法、試管法) 間接凝集反應(yīng) 間接凝集抑制試驗(yàn)82022/7/23直接凝集反應(yīng)玻片凝集試驗(yàn)人類 ABO 血型和細(xì)菌的鑒定 定性測(cè)抗原試管凝集試驗(yàn)臨床輔助診斷傷寒、副傷寒 (肥達(dá)反應(yīng))，布氏桿菌病 (瑞特反應(yīng)) 半定量測(cè)抗體9

3、2022/7/23陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果直接凝集反應(yīng)抗原表位10112022/7/23ABO血型12抗A抗體抗B抗體生理鹽水抗A抗體+抗B抗體受試者血型?間接凝集反應(yīng)將已知可溶性抗原 (抗體) 吸附在與免疫無(wú)關(guān)的載體顆粒表面，形成致敏顆粒，再與相應(yīng)抗體 (抗原) 作用出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。常用載體顆粒：人O型血紅細(xì)胞、乳膠顆?？捎糜跈z測(cè)血清中的自身抗體 (類風(fēng)濕因子) 和針對(duì)某些病原微生物的抗體 (抗鏈“O”抗體)抗人球蛋白試驗(yàn)可用于檢測(cè)新生兒溶血、輸血反應(yīng)、自身免疫性/藥物相關(guān)的溶血性貧血132022/7/23直接Coombs試驗(yàn): 檢測(cè) Rh+ 新生兒紅細(xì)胞表面 是否結(jié)合了 抗Rh抗體

4、新生兒Rh+紅細(xì)胞在體內(nèi)已結(jié)合了抗Rh抗體Rh抗原抗人球蛋白抗體 AHG間接Coombs試驗(yàn): 檢測(cè) Rh- 經(jīng)產(chǎn)婦血清中 是否含有 抗Rh抗體 正常人O型血Rh+ 紅細(xì)胞14抗Rh抗體抗人球蛋白試驗(yàn) Coombs testAHG直接Coombs試驗(yàn)間接Coombs試驗(yàn)間接凝集抑制試驗(yàn)將可溶性待測(cè)抗原與相應(yīng)抗體預(yù)先作用，再加入相應(yīng)的抗原致敏顆粒。妊娠診斷試驗(yàn)，檢測(cè)尿液中是否含有HCG尿液標(biāo)本+抗HCG抗體 +HCG致敏顆粒 觀察凝集現(xiàn)象162022/7/2317HCG 致敏顆粒妊娠診斷試驗(yàn)陰性妊娠診斷試驗(yàn)陽(yáng)性尿液標(biāo)本中的HCG可見(jiàn)凝集團(tuán)塊無(wú)凝集現(xiàn)象(凝集抑制)沉淀反應(yīng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)后

5、，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀物?？稍谝后w中進(jìn)行，也可在半固體瓊脂凝膠中進(jìn)行。 單向瓊脂擴(kuò)散 雙向瓊脂擴(kuò)散 免疫比濁法182022/7/23單向瓊脂擴(kuò)散192022/7/23雙向瓊脂擴(kuò)散202022/7/23雙向瓊脂擴(kuò)散212022/7/23溶血空斑試驗(yàn)補(bǔ)體參加的反應(yīng)222022/7/23免疫標(biāo)記技術(shù)抗原-抗體反應(yīng) (免疫反應(yīng)) 與標(biāo)記技術(shù)結(jié)合，定性、定量、定位檢測(cè)抗原或抗體；根據(jù)標(biāo)記物不同，分為以下幾類標(biāo)記技術(shù)： 酶免疫測(cè)定法 免疫熒光法 放射免疫測(cè)定法 免疫膠體金技術(shù) 化學(xué)發(fā)光免疫分析232022/7/23酶免疫測(cè)定法將抗原-抗體反應(yīng)的高度特異性 與 酶催化作用的高效性相結(jié)合，通過(guò)酶催化底物后顯色，

6、可定性、定量分析抗原或抗體。常用于標(biāo)記的酶 辣根過(guò)氧化物酶 (HRP)、 堿性磷酸酶 (ALP)常用的檢測(cè)方法 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)、免疫組織化學(xué) (IHC) 技術(shù)242022/7/23酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)將已知可溶性抗體或抗原吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，并將酶標(biāo)物引入反應(yīng)中，通過(guò)洗滌將未與固相載體結(jié)合的游離成分去除，加底物顯色進(jìn)行測(cè)定。酶免疫測(cè)定法中應(yīng)用最廣的技術(shù)敏感性高，操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，程序規(guī)范化最常用的 ELISA檢測(cè)方法 雙抗夾心法252022/7/2326雙抗夾心法將抗體包被在固相載體表面間接法加入底物，在酶催化作用下顯色加入待測(cè)標(biāo)本，

7、標(biāo)本中相應(yīng)抗原與包被抗體結(jié)合加入酶標(biāo)抗體，與待測(cè)抗原結(jié)合，形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)將抗原包被在固相載體表面加入底物，在酶催化作用下顯色加入待測(cè)標(biāo)本，標(biāo)本中相應(yīng)抗體與包被抗原結(jié)合加入酶標(biāo)二抗，與待測(cè)抗體結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) ELISAELISA28酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)用于檢測(cè)分泌特定細(xì)胞因子的T細(xì)胞，或分泌特異性抗體的B細(xì)胞。每個(gè)斑點(diǎn)表示一個(gè)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子或一個(gè)B細(xì)胞分泌抗體的區(qū)域ELISPOTEach cell leaves a “footprint”.免疫組織化學(xué)(IHC)用標(biāo)記的抗體與組織切片或細(xì)胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合，對(duì)抗原進(jìn)行定位、定性或定量檢測(cè)。 酶免疫組化技術(shù) 熒光免疫組化技術(shù) (免疫熒光)

8、常用熒光素：藻紅蛋白 (PE)異硫氰酸熒光素 (FITC)302022/7/23直接標(biāo)記法間接標(biāo)記法酶 或 熒光素一抗二抗31加入一抗免疫熒光酶免疫組化加入一抗加入熒光素標(biāo)記的二抗加入酶標(biāo)記的二抗在熒光顯微鏡下觀察熒光加入底物，在酶的催化作用下顯色在光學(xué)顯微鏡下即可見(jiàn)激發(fā)光CD4 CD11c CD68 DAPI (100)免疫熒光酶免疫組化免疫印跡法 (Western blotting)凝膠電泳與固相免疫技術(shù)的結(jié)合，將通過(guò)電泳分開(kāi)的蛋白質(zhì)抗原成分“轉(zhuǎn)印”到固相載體 (硝酸纖維素膜) 后，再利用免疫標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。能對(duì)分子大小不同的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，并確定其分子量和抗原特性；常用于病毒學(xué)檢測(cè)和目

9、的基因表達(dá)產(chǎn)物的鑒定。332022/7/23多種蛋白質(zhì)抗原混合物凝膠電泳：將分子量大小不同的蛋白質(zhì)抗原分開(kāi)蛋白質(zhì)抗原從凝膠轉(zhuǎn)移至固相載體膜上 (印跡)結(jié)合了抗體的“印跡”顯像膠片加入第一抗體，洗滌；加入標(biāo)記的第二抗體，洗滌。顯示抗原存在；定性或半定量檢測(cè)抗原。加入待測(cè)血清，洗滌；加入標(biāo)記的第二抗體，洗滌。顯示抗體存在；定性或半定量檢測(cè)血清中的抗體?？乖?抗體反應(yīng)檢測(cè)方法的相對(duì)敏感性362022/7/23檢測(cè)方法靈敏度 (每分升)免疫電泳5-10mg瓊脂擴(kuò)散1mg免疫比濁0.1mg凝集反應(yīng)1g酶免疫測(cè)定法1g定量免疫熒光1pg放射免疫測(cè)定法1pg外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)分離葡聚糖-泛影葡胺 (Ficoll) 密度梯度離心法372022/7/23淋巴細(xì)胞亞群的分離免疫吸附分離法免疫磁珠分離法流式細(xì)胞術(shù)分選法382022/7/23免疫磁珠分離法392022/7/23將抗體包被的磁珠加入到細(xì)胞懸液表達(dá)相應(yīng)抗原的細(xì)胞與磁珠結(jié)合結(jié)合了細(xì)胞的磁珠被吸附在靠近磁鐵的管壁上流式細(xì)胞術(shù)分選法CD4+ CD8+CD4- CD8+CD4- CD8-CD4+ CD8-抗CD4抗