分子標(biāo)記技術(shù)(同名13)課件

1、第七章 現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)（3）第一節(jié) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)第二節(jié) 物理圖譜的構(gòu)建第三節(jié) 基因組測(cè)序技術(shù)第四節(jié) 分子標(biāo)記技術(shù)第五節(jié) 基因表達(dá)研究技術(shù)第六節(jié) DNA-蛋白質(zhì)相互作用 研究技術(shù)第三節(jié) 分子標(biāo)記技術(shù)一、遺傳圖譜(genetic map)遺傳圖譜(genetic map)又稱(chēng)遺傳連鎖圖譜或連鎖圖譜(linkage map)。經(jīng)典遺傳 學(xué)時(shí)代的遺傳連鎖圖譜主要是以家系分析或不同性狀個(gè)體間雜交為基礎(chǔ)，根據(jù)同源染色體上 等位基因的變化，通過(guò)計(jì)算重組率，確定染色體上基因座位的順序和距離，構(gòu)建基因的連鎖圖譜。經(jīng)典遺傳圖譜 人們把單倍體配子所有染色體上的全部基因稱(chēng)為一個(gè)基 因組?；蚪M內(nèi)每條染色體上的連

2、鎖基因稱(chēng)為一個(gè)連鎖群。繪制遺傳圖譜就是要進(jìn)行每條染 色體上基因座位的順序和距離的確定，即主要通過(guò)家系分析，對(duì)不同性狀之間、性狀與標(biāo) 記之間、標(biāo)記與標(biāo)記之間的連鎖遺傳頻率進(jìn)行計(jì)算，最終繪制遺傳連鎖圖。人類(lèi)遺傳圖譜包括女性一種配子的23條染色體(記作23，X)和男性?xún)煞N配子的23條染色體(23 ，X)、(23，Y)上的所有基因位點(diǎn)?，F(xiàn)代遺傳圖譜 70年代發(fā)展起來(lái)的DNA重組技術(shù)、DNA克隆技術(shù)和DNA探針技術(shù)無(wú)疑為拓展遺傳圖譜的構(gòu)建途徑創(chuàng)造了技術(shù)條件，也使人類(lèi)基因定位的方法從細(xì)胞及染色體水平過(guò)渡到分子水平。DNA水平的多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)作為繪制現(xiàn)代遺傳圖譜的主要界標(biāo)，大大提高圖譜的 精確度、準(zhǔn)確性。遺

3、傳圖譜的繪制也因此進(jìn)入了一個(gè)嶄新的時(shí)代。 現(xiàn)代遺傳圖譜的概念是由Botstein D等(1980)首先提出的，在此基礎(chǔ)上，限制性片段長(zhǎng) 度多態(tài)性RFLP作為遺傳圖譜的第一代嶄新標(biāo)記得以問(wèn)世 。遺傳圖譜的第二代標(biāo)記位點(diǎn)是大量的可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)（VNTR)，包括微、小衛(wèi)星(MS)或短串聯(lián)重復(fù)(STR 或SSLP)。第三代標(biāo)記是位點(diǎn)極其豐富的單核苷 酸多態(tài)性(SNP)。 二、分子標(biāo)記的概念 廣義的分子標(biāo)記(molecular marker)是指可遺傳的并可檢測(cè)的DNA序列或蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同工酶（指由一個(gè)以上基因位點(diǎn)編碼的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位點(diǎn)的不同等位基因

4、編碼的酶的不同分子形式）。狹義的分子標(biāo)記概念只是指DNA標(biāo)記，而這個(gè)界定現(xiàn)在被廣泛采納： 能反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，它直接反映基因組DNA間的差異。三、分子標(biāo)記的種類(lèi) 分子標(biāo)記大多以電泳譜帶的形式表現(xiàn)，大致可分為三大類(lèi)。 第一類(lèi)是以分子雜交為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，包括：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（Restriction fragment length polymorphism, 簡(jiǎn)稱(chēng)RFLP標(biāo)記）； DNA指紋技術(shù)（DNA Fingerprinting）；原位雜交（in situ hybridization）等； 第二類(lèi)是以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase cha

5、in reaction ,簡(jiǎn)稱(chēng)PCR反應(yīng)）為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，包括： 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（Random amplification polymorphism DNA, 簡(jiǎn)稱(chēng)RAPD標(biāo)記）； 簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記（Simple sequence repeat, 簡(jiǎn)稱(chēng)SSR標(biāo)記）或簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性（Simple sequence length polymorphism, 簡(jiǎn)稱(chēng)SSLP標(biāo)記）； 擴(kuò)展片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（Amplified fragment length polymorphism, 簡(jiǎn)稱(chēng)AFLP標(biāo)記）； 序標(biāo)位（Sequence tagged sites, 簡(jiǎn)稱(chēng)STS標(biāo)記）； 序

6、列特征化擴(kuò)增區(qū)域（Sequence charactered amplified region, 簡(jiǎn)稱(chēng)SCAR標(biāo)記）等； 第三類(lèi)是一些新型的分子標(biāo)記，如： 單核苷酸多態(tài)性（Single nuleotide polymorphism, 簡(jiǎn)稱(chēng)SNP標(biāo)記）； 表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed sequences tags, 簡(jiǎn)稱(chēng)EST標(biāo)記）等。四、分子標(biāo)記的特點(diǎn)（1）直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個(gè)組織、各個(gè)發(fā)育階段均可檢測(cè)到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否等問(wèn)題；（2）數(shù)量極多，遍布整個(gè)基因組，可檢測(cè)座位幾乎無(wú)限；（3）多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無(wú)須人為創(chuàng)造；（4）表現(xiàn)為中性，不影

7、響目標(biāo)性狀的表達(dá)；（5）許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性的特點(diǎn)，能區(qū)別純合體和雜合體。五、幾種常用的分子標(biāo)記（一）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（Restriction fragment length polymorphism, RFLP） 該技術(shù)由Grodzicker等于1974年創(chuàng)立。 特定生物類(lèi)型的基因組DNA經(jīng)某一種限制性?xún)?nèi)切酶完全酶解后，會(huì)產(chǎn)生分子量不同的同源等位片段，或稱(chēng)限制性等位片段。RFLP標(biāo)記技術(shù)的基本原理就是通過(guò)電泳的方法分離和檢測(cè)這些片段。凡是可以引起酶解位點(diǎn)變異的突變，如點(diǎn)突變（新產(chǎn)生和去除酶切位點(diǎn)）和一段DNA的重新組織（如插入和缺失造成酶切位點(diǎn)間的長(zhǎng)度發(fā)生變化）等均可導(dǎo)致限制性等位片

8、段的變化，從而產(chǎn)生RFLP。EcoR酶切示意圖5 AG-GAATTC-GAATTC-GAATTC-CG 33 TC-CTTAAG-CTTAAG-CTTAAG-GC 5 AG-G AATTC-G AATTC-G AATTC-CG TC-CTTAA G-CTTAA G-CTTAA G-GC5 AG-GAATTC-GAATCC-GAATTC-CG 33 TC-CTTAAG-CTTAGG-CTTAAG-GC 5 AG-G AATTC-GAATCC-G AATTC-CG TC-CTTAA G-CTTAGG-CTTAA G-CG基本步驟： DNA提取用DNA限制性?xún)?nèi)切酶消化 凝膠電泳分離限制性片段 將這些

9、片段按原來(lái)的順序和位置轉(zhuǎn)移到易操作的濾膜上 用放射性同位素或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的DNA作探針與膜上的DNA雜交（稱(chēng) Southern雜交） 放射性自顯影或酶學(xué)檢測(cè)顯示出不同材料對(duì)該探針的限制性酶切片段多態(tài)性。 RFLP標(biāo)記的主要特點(diǎn)有：（1）遍布于整個(gè)基因組，數(shù)量幾乎是無(wú)限的；（2）無(wú)表型效應(yīng)，不受發(fā)育階段及器官特異性限制；（3）共顯性，可區(qū)分純合子和雜合子；（4）結(jié)果穩(wěn)定、可靠；（5）DNA需要量大，檢測(cè)技術(shù)繁雜，難以用于大規(guī)模的育種實(shí)踐中。ABAB限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)與放射性探針結(jié)合部位限制性?xún)?nèi)切酶酶切后；電泳分離DNA片段；轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜；與放射性探針雜交，分析陽(yáng)性條帶（二）染色體原位雜

10、交染色體原位雜交技術(shù)是DNA探針與染色體上的DNA雜交，并在染色體上直接進(jìn)行檢測(cè)的分子標(biāo)記技術(shù)。目前發(fā)展最快的是熒光素標(biāo)記的原位DNA雜交技術(shù)，即熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization, 簡(jiǎn)稱(chēng)FISH技術(shù)），是利用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與抗原標(biāo)記的探針?lè)肿犹禺愋缘慕Y(jié)合來(lái)檢測(cè)DNA序列在染色體上的位置。熒光標(biāo)記原位雜交原理示意圖原位雜交技術(shù)的基本步驟為制備探針；染色體制片；染色體處理與變性；染色體與探針雜交；顯微檢測(cè)。染色體專(zhuān)一位點(diǎn)探針熒光標(biāo)記探針檢測(cè)精子（三） 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)由Williams等于1990年創(chuàng)立。其基本

11、原理與PCR技術(shù)一致。 RAPD標(biāo)記技術(shù)就是用一個(gè)（有時(shí)用兩個(gè)）隨機(jī)引物（一般8-10個(gè)堿基）非定點(diǎn)地?cái)U(kuò)增基因組DNA，然后用凝膠電泳分開(kāi)擴(kuò)增片段。遺傳材料的基因組DNA如果在特定引物結(jié)合區(qū)域發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變，就有可能導(dǎo)致引物結(jié)合位點(diǎn)的分布發(fā)生相應(yīng)的變化，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量變化。若PCR產(chǎn)物增加或缺少，則產(chǎn)生RAPD標(biāo)記。 親本中國(guó)春小麥、節(jié)節(jié)麥雙倍體和子代的RAPD電泳圖譜 引物為S516: CTCTGCGCGT 泳道1為中國(guó)春小麥，泳道2、二者的子代，泳道3為節(jié)節(jié)麥。 RAPD擴(kuò)增克隆魚(yú)(B)、供體紅鯉(A)、受體金魚(yú)(D)和雜交魚(yú)(C，即AxD)的細(xì)胞

12、核DNA指紋圖譜。結(jié)果顯示，對(duì)于不同的引物，克隆魚(yú)的擴(kuò)增譜帶均和供體紅鯉的一致，迥異于受體金魚(yú)和雜交魚(yú)。RAPD標(biāo)記的主要特點(diǎn)有：（1）不需DNA探針，設(shè)計(jì)引物也無(wú)須知道序列信息；（2）顯性遺傳（極少數(shù)共顯性），不能鑒別雜合子和純合子；（3）技術(shù)簡(jiǎn)便，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術(shù)；（4）DNA樣品需要量少，引物價(jià)格便宜，成本較低；（5）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差，結(jié)果可靠性較低。 （四）簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記，SSR又稱(chēng)微衛(wèi)星DNA(Micro-satellite DNA)標(biāo)記；屬高度重復(fù)序列，重復(fù)單元26bp，如(CA)n、(AT)、(GGC)n等重復(fù)，重復(fù)區(qū)大多幾十幾百bp，分散在基因組中，大多不存在

13、于編碼序列內(nèi)，具有較高的多態(tài)性。呈現(xiàn)孟德?tīng)柺竭z傳。目前微衛(wèi)星DNA已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了萬(wàn)余個(gè)位點(diǎn)。TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGCAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG微衛(wèi)星DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果（示例）：500bp400bp300bp240bp 該結(jié)果顯示在所檢查的人群中，該位點(diǎn)多態(tài)性有4種。SSR標(biāo)記的主要特點(diǎn)（1）數(shù)量豐富，廣泛分布于整個(gè)基因組；（2）具有較多的等位性變異；（3）共顯性標(biāo)記，可鑒別出雜合子和純合子；（4）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，結(jié)果可靠；（5）由于創(chuàng)建新的標(biāo)記時(shí)需知道重復(fù)序列兩端的序列信息，因此其開(kāi)發(fā)有一定困難，費(fèi)用也

14、較高。 （五）單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism SNP)1. 定義單核苷酸多態(tài)性(SNP)主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。 不同個(gè)體間，基因組DNA某部位的 單核苷酸的變異。1996年，Lander報(bào)道了用單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（single nucleotid polymorphism SNP）制備第三代遺傳連鎖圖的遺傳標(biāo)記。2. SNP在人類(lèi)基因組中出現(xiàn)的頻率 SNP在人類(lèi)基因組中廣泛存在，平均每5001000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)1700萬(wàn)個(gè)甚至更多。 There is one SNP in every

15、 1000 bases leads to an estimate that any two individuals differ by up to three million SNPs. 在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上?？偟膩?lái)說(shuō)，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP(coding sNP,cSNP)比較少，因?yàn)樵谕怙@子內(nèi)，其變異率僅及周?chē)蛄械?/5。但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關(guān)注。3. SNP檢測(cè)方法 目前已有多種方法可用于SNP檢測(cè)：根據(jù)DNA列陣的微測(cè)序法；動(dòng)態(tài)等位基因特異的雜交；寡聚核苷酸特

16、異的連接； DNA芯片以及TaqMan系統(tǒng)等。但不管哪一種方法，首先必須進(jìn)行靶序列的擴(kuò)增，然后才能進(jìn)行其它檢測(cè)。4. SNP用作遺傳標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)(1) SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因頻率都可估計(jì)出來(lái)。(2)它在基因組中的分布較微衛(wèi)星標(biāo)記廣泛得多。(3)與串聯(lián)重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)相比，SNP是高度穩(wěn)定的，尤其是處于編碼區(qū)的SNP(cSNP),而前者的高突變率容易引起對(duì)人群的遺傳分析出現(xiàn)困難。(4)部分位于基因內(nèi)部的SNP可能會(huì)直接影響產(chǎn)物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或基因表達(dá)水平，因此，它們本身可能就是疾病遺傳機(jī)制的候選改變位點(diǎn)。(5)易于進(jìn)行自動(dòng)化分析，縮短了研究時(shí)間。5. SNP的意義對(duì)于

17、人類(lèi)來(lái)說(shuō)，SNP的意義在于：、致病SNP、疾病易感性SNP、具有診斷價(jià)值的SNP、疾病的SNP譜、人表型相關(guān)SNP、藥物作用與不良反應(yīng)的SNP、藥物劑量SNP日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)糖尿病基因的個(gè)人SNP差別日本研究人員最近經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，與糖尿病有關(guān)的基因并不是千篇一律，它們之間存在著個(gè)人差別，即“單核苷酸多態(tài)性”（SNP）。 預(yù)計(jì)今后SNP將在下列領(lǐng)域發(fā)揮重要作用：(1)進(jìn)行簡(jiǎn)單和復(fù)雜疾病的遺傳連鎖分析(linkage analysis)及關(guān)聯(lián)分析(association analysis),用于疾病易感基因定位；而且其定位的精度將比微衛(wèi)星標(biāo)記精細(xì)得多，可直接用于指導(dǎo)易感基因克隆。(2)在“藥物基因組學(xué)

18、”(pharmacogenomics)研究中，可通過(guò)檢測(cè)SNP的遺傳多態(tài)性標(biāo)記揭示人群中不同個(gè)體對(duì)不同藥物的敏感性差異的根本原因。(3)也可用于法醫(yī)研究的罪犯身份的鑒別、親子鑒定等，此外在器官移植中供體和受體間的配對(duì)選擇及物種進(jìn)化的研究中都將具有重要意義。分子標(biāo)記技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用 分子遺傳圖譜的構(gòu)建遺傳多樣性與種質(zhì)鑒定重要農(nóng)藝性狀相關(guān)基因的定位分子標(biāo)記輔助選擇 重要農(nóng)藝性狀的圖位克隆 瀏覽以下網(wǎng)站國(guó)內(nèi)： 天大生物信息中心 北大生物信息中心 中國(guó)生物信息/國(guó)外 美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI) 歐洲生物信息學(xué)研究所(EBI) http:/www.ebi.ac.uk/sw/03.htmSNP在“藥物基因組學(xué)”(pharmacogenomics)研究中應(yīng)用不同個(gè)體的藥物反應(yīng)（主要指藥效與毒性）差異與DNA多態(tài)性的關(guān)系。即通過(guò)DNA序列差異的分析，從基因水平上深入認(rèn)識(shí)疾病及藥物作用的個(gè)體差異的機(jī)理，指導(dǎo)和優(yōu)化臨床用藥。并