如何理解PacBio的準(zhǔn)確度

1、在這個(gè)例子中，來(lái)自于1的條的序列信息（相當(dāng)于的被用于介紹第三代測(cè)序中的單分子實(shí)時(shí)（）測(cè)序可以實(shí)現(xiàn)超過(guò)（5的咼度精確測(cè)序，且不受序列中和含量的影響，平均讀長(zhǎng)可達(dá)（最長(zhǎng)），這是如何實(shí)現(xiàn)的呢？這是因?yàn)榧夹g(shù)在與測(cè)序精確度相關(guān)的三個(gè)方面均有獨(dú)到之處：（一致性準(zhǔn)確性）（測(cè)序偏好性）（測(cè)序的表現(xiàn)）本文將從專業(yè)客觀的角度從這三方面詳細(xì)闡述測(cè)序技術(shù)的表現(xiàn)，圖文并茂，數(shù)據(jù)詳實(shí)，請(qǐng)各位看官留步，細(xì)細(xì)品味。（一致性準(zhǔn)確性）一個(gè)典型的測(cè)序過(guò)程通常包括三個(gè)基本步驟：（）生成測(cè)序，（）將生成的到已知的參考序列上，（）為了得到最終的序列而生成。如果樣本是未知起源的，那么第（）步就會(huì)被基因組組裝所代替，以便生成一個(gè)新的參考基因

2、組。最后一步是將原始測(cè)序至!J結(jié)果。為了使大家更好的理解測(cè)序技術(shù)是怎樣達(dá)到準(zhǔn)確度的，圖我們先來(lái)一下在系統(tǒng)中，測(cè)序結(jié)果是怎樣得到的。在這個(gè)例子中，一條的被到參考基因組上，紅色箭頭表示與參考基因組不一致的堿基。但是我們不能單憑這一條的結(jié)果就給出生物學(xué)結(jié)論，因?yàn)槲覀儾恢肋@種不一致究竟來(lái)自于真正的生物學(xué)變異還是僅僅是由于測(cè)序錯(cuò)誤導(dǎo)致的。同樣，單憑一條也無(wú)法出，因?yàn)樵谶@種變異里，我們至少需要來(lái)自父方和母方染色體的各一條。因此，要想獲得真實(shí)準(zhǔn)確的生物學(xué)發(fā)現(xiàn)，必須通過(guò)將多條進(jìn)行，然后與參考基因組的相同區(qū)域進(jìn)行，換句話說(shuō)，需要進(jìn)行為了判斷準(zhǔn)確度是否能達(dá)到或以上，需要把序列與已知的精準(zhǔn)判斷與參考位置究竟是，還

3、是，亦或是那么，同樣的策略其實(shí)也被用于測(cè)序技術(shù)中（見(jiàn)圖）。i.Generatesequenceread:匸Maptoreference：m.Generateconsensus(1Oxcoverage):WlrtwFi-gureObtainingsequencingreulhusngsecond-generationacqu&nargtechnol対i日乩SATJLLijCJi-AATSNP:SrP-TW*TTT9CIKAAT0#:L-芳cRtH77?綽9R4TAERaferBHcaUFigure2.ObiainingsequencingresultsusingSMRTSequencjrt.i,

4、Generatesequenceread:MGmnerateconsensus(10 xcoverage):測(cè)序可以產(chǎn)生更長(zhǎng)的（平均讀長(zhǎng)可達(dá),最長(zhǎng)）k但是為了與圖1一致，便于理解，我們?cè)趫D2還是只看的長(zhǎng)度。雖然在技術(shù)中，更容易出錯(cuò)（平均錯(cuò)誤率）%，這些錯(cuò)誤主要由于（水平紅線）和（垂直紅線）引起?？紤]到的這些特征,公司開發(fā)了名為工具，專門為進(jìn)行了優(yōu)化。盡管單次讀?。┑腻e(cuò)誤率稍高，但是使用還是可以準(zhǔn)確的將到參考序列的相應(yīng)位置。因此，正如圖中二代測(cè)序的例子一樣，無(wú)論哪種采用技術(shù)，沒(méi)有人會(huì)關(guān)注一個(gè)堿基只被測(cè)一次的結(jié)果，最終結(jié)果都是經(jīng)過(guò)分析之后得到的，比如，當(dāng)做到時(shí)候，每個(gè)位置的序列信息就是由10次讀取

5、之后產(chǎn)生的平均結(jié)果而定（如圖中垂直的框）。所以，對(duì)于三代測(cè)序來(lái)說(shuō)，針對(duì)每一個(gè)堿基，次讀取中有次都是正確的，足夠讓我們判斷出該位置的正確信息。根據(jù)的這一特點(diǎn)，公司也開發(fā)了一個(gè)名為的工具，可以生成高質(zhì)量的序列然而，如果測(cè)序方法本身存在系統(tǒng)錯(cuò)誤，無(wú)論之后的序列是不是正確,測(cè)序結(jié)果都將會(huì)受到影響。也就是說(shuō)，如果某個(gè)堿基被系統(tǒng)地讀錯(cuò)，那么在之后它也仍然是錯(cuò)的，且這一錯(cuò)誤是無(wú)法通過(guò)增加克服的。而測(cè)序技術(shù)的準(zhǔn)確率之所以能夠，最關(guān)鍵的一點(diǎn)就是由于的錯(cuò)誤是隨機(jī)錯(cuò)誤，這意味著隨著的增加，這種隨機(jī)錯(cuò)誤可以很快被消減掉。這點(diǎn)已經(jīng)有多篇進(jìn)行了理論及實(shí)踐驗(yàn)證。圖說(shuō)明了測(cè)序的準(zhǔn)確度與之間的關(guān)系，星號(hào)代表與達(dá)到一致。-A0P

6、誇g毋W與U與UEOQwithVie怕栢咖國(guó)一的參考序列相比較(例如已有金標(biāo)準(zhǔn)參考序列的物種)?？梢圆捎媚承┮驯粶y(cè)序廣泛測(cè)過(guò)的細(xì)菌基因組作為標(biāo)準(zhǔn)，如和。該圖表明了雖然的單次讀取的準(zhǔn)確性比其他方法略低，但是一旦增加，準(zhǔn)確率就可以快速提升，很多情況下可以實(shí)現(xiàn)完美的參考基因組。我們可以從看到，測(cè)序的準(zhǔn)確性甚至可以達(dá)到，也就是百萬(wàn)個(gè)堿基里面只發(fā)生個(gè)堿基錯(cuò)誤。生物通的準(zhǔn)確率可以超越其他測(cè)序方法，就是因?yàn)樗请S機(jī)錯(cuò)誤。這也是很多研究都采用來(lái)驗(yàn)證基于其他平臺(tái)發(fā)現(xiàn)的的根本原因中高亮顯示的就是之后的準(zhǔn)確性。在該例中，對(duì)于任何測(cè)序平臺(tái)來(lái)說(shuō)，有意義的也都是結(jié)果，而非單次讀取的結(jié)果。WWWLAPf0hHOC五譚pMl

7、MKrActiu；1”J*-f-IE-07pFBfKI441484Mt松1*fCM中IThlgl先的】吋t豐iiSf.UrvA現(xiàn)業(yè)W1-*i*J34V41；：X-W曲TMr已.U輛猝昶H-10|亠護(hù)軽Ng0凰MMMIIWuj4rjmetr*-4ftMiMqj1i：tMMpTrU:d訥*.証汀*ll&Mfl51*1-ffT-WifJimRh4221W*4HILIlT-曠j*.ITgHkR加致3*J*tJ*-j.|I.(1*七*JF112*1j*4俚“D血T倉(cāng)11JH-|Mt*Pit*Jm%11rrMii1LH-tfT*iifKnpariItl-2J!rKhIPrfflu*3|flNkK対瑰i.H

8、E*flffI1AccmvcycxmprwanforMqurongCKmiMogtw(hsstcoiurir,PvcBo1wwnbiyicixncyinb&ti.ndtobkjmni11na454*MarawelMiy).FramKovni(201Genome1*：R101圖是關(guān)于驗(yàn)證的代表性的例子，直接用測(cè)序數(shù)據(jù)驗(yàn)證測(cè)序平臺(tái)產(chǎn)生的，清楚表明了測(cè)序準(zhǔn)確識(shí)別生物學(xué)變異的能力。(測(cè)序偏好性)以上的討論還僅僅限于那些容易被測(cè)到的序列。事實(shí)上，許多測(cè)序方法由于自身技術(shù)及原理的局限性，對(duì)于某些序列或者極端的堿基組成無(wú)能為力，所以對(duì)于這些區(qū)域，準(zhǔn)確率是。尤其對(duì)于極端或的，高度重復(fù)序列，長(zhǎng)同型核苷酸延伸()

9、等區(qū)域，許多測(cè)序系統(tǒng)完全測(cè)不到或者測(cè)序質(zhì)量不好。同樣，回文序列在這些測(cè)序平臺(tái)中也無(wú)法被測(cè)到，因?yàn)榛匚男蛄性跇颖局苽涞臄U(kuò)增階段就已經(jīng)丟失了6基因組上這些區(qū)域往往缺乏，得到的測(cè)序結(jié)果不完整，導(dǎo)致基因組拼接時(shí)片段化嚴(yán)重，有時(shí)甚至?xí)G失掉以上的基因組，這無(wú)疑妨礙了全面鑒定序列以及對(duì)于完整基因組的構(gòu)建。Figjre4.ValidationofSftPsusingSMRTSequencing.FromPughelai.(2012)Nature4BB:1G6-110*.測(cè)序并不會(huì)表現(xiàn)出這種序列偏好性，在整個(gè)基因組的表現(xiàn)都非常穩(wěn)定，即PataJllurnlna便是那些被認(rèn)為非常難測(cè)的區(qū)域。這一優(yōu)勢(shì)可被用于那些

10、其他測(cè)序平臺(tái)上產(chǎn)生的。一個(gè)極端的例子可以用來(lái)證明測(cè)序的無(wú)偏好性，那就是對(duì)數(shù)千個(gè)堿基組成的含量區(qū)域的測(cè)序：三核苷酸的重復(fù)會(huì)導(dǎo)致綜合征（見(jiàn)圖）。同樣，因?yàn)榧夹g(shù)在樣本制備時(shí)無(wú)需擴(kuò)增，也不會(huì)收到回文序列的影響。y-a-*Bfigute5湖/忙l網(wǎng)theSMRT舸iOGHGC呻蟲柏口co時(shí)自刪FromlocmkiMl.(20U|Gcwn*AfC423121-iJ（測(cè)序的表現(xiàn)）即便測(cè)序得到的可以達(dá)到準(zhǔn)確，但是，如果它不能夠被準(zhǔn)確的到參考基因組上，我們?nèi)匀坏貌坏娇捎玫男畔?，或者說(shuō)得到的是帶有誤導(dǎo)性質(zhì)的信息。這也就是為什么長(zhǎng)度可以直接影響測(cè)序的準(zhǔn)確度。如果的長(zhǎng)度不足以跨越基因組上含有至少一個(gè)特有的側(cè)翼序列的重

11、復(fù)區(qū)域，該的位置就不能被明確定義，因而，任何通過(guò)該得到的信息都是不明確的，也就是說(shuō)無(wú)法準(zhǔn)確看出該到底在發(fā)生在基因組的哪個(gè)區(qū)域。這種不正確的會(huì)導(dǎo)致生物學(xué)變異的虛假分配（）。圖比較了和與人類基因組上一段重復(fù)區(qū)域的結(jié)果。圖中能看到系統(tǒng)錯(cuò)誤對(duì)于的影響，的由于長(zhǎng)度不夠，出現(xiàn)了很多錯(cuò)誤匹配，從而造成假陽(yáng)性。IPscBloRSRANDOMERRORFigufe6.Th白import白nc巳oflongreadlengthsfaraccuratemapprnginsequencing.AdaptedfromCarneiroetaL(2012)BMCGenomics13:375-3B32,Mismappedre

12、adssamegenomeregioncnbothdatictsSYSTEMATICERROR*41It十祈一FW1則可以避免這種錯(cuò)誤匹配，因?yàn)槠渥x長(zhǎng)長(zhǎng)，長(zhǎng)達(dá)上萬(wàn)堿基的可以跨越基因組中重復(fù)區(qū)域并且把這些定位在基因組上正確的位置，從而糾正錯(cuò)誤的分配。生物通結(jié)論正是由于技術(shù)具有以上三大特點(diǎn)：（）產(chǎn)生的是隨機(jī)誤差而非系統(tǒng)誤差；（）沒(méi)有序列的偏好性；（）具有足以跨越重復(fù)區(qū)域且避免錯(cuò)誤匹配的長(zhǎng)讀長(zhǎng)。才能生成真正全面且高度精確的測(cè)序結(jié)果。生物通附錄：微小變異檢測(cè)對(duì)于那些關(guān)注同一樣本中低頻率（）存在的分子的應(yīng)用，確實(shí)是需要盡可能高的準(zhǔn)確率的，以便能進(jìn)行有效區(qū)分。對(duì)于這些應(yīng)用，也開發(fā)了一種測(cè)序模式，可以在分子

13、內(nèi)進(jìn)行，用這種方式產(chǎn)生的單分子測(cè)序的準(zhǔn)確率與相應(yīng)讀長(zhǎng)下一代和二代測(cè)序的準(zhǔn)確率相當(dāng)，甚至是還要高。這是通過(guò)模板制備時(shí)生成的的環(huán)狀結(jié)構(gòu)達(dá)到的8這使得酶在同一個(gè)環(huán)上通過(guò)不斷繞圈，從而可以對(duì)同一個(gè)堿基進(jìn)行多次測(cè)序。生物通測(cè)序是目前唯一可以生成分子內(nèi)的技術(shù)，即便對(duì)于樣本中含量很低的分子，也可以得到高精確度的堿基序列。這一能力已經(jīng)被利用于檢測(cè)急性髓性白血病中的低頻突變。列出了上文提到的多分子和單分子模式分別適用的應(yīng)用方向。MuHI-MoleculeConsensusSngle-MaleculaConsensus林imb聞dt)novaRareva-fantdetection8ACtfefiovaassembly*Viralqfjasi-speciesGapcKJsng/scafloldingRareresislancsminatonsStnjctijrac-varialiandetectionRare,relatedtranscriptiscfonmsAmpliconseq