雙脫氧末端終止測序法原理過程和目標(biāo)基因cDNA序列拼接ppt課件

1、雙脫氧末端終止法測序的原理、過程和目的基因序列的分析教 師：程 琳2021 年 11 月分子生物學(xué)實驗1實 驗 目 的1、經(jīng)過本實驗了解雙脫氧鏈終止法的根本原理，掌握DNA測序的根本方法；2、學(xué)會序列查詢、核酸及蛋白質(zhì)的同源性搜索和比對。2 DNA測序技術(shù)主要有兩種方法，都是在20世紀70年代中期發(fā)明的。A. 雙脫氧鏈終止法the chain termination method，是經(jīng)過合成與單鏈DNA互補的多核苷酸鏈來讀取待測DNA分子的順序。B. 化學(xué)降解法chemical degradation method，是將雙鏈DNA分子用化學(xué)試劑處置，產(chǎn)生切口，用同位素標(biāo)志進展測序。一、DNA測

2、序的方法31. Sanger雙脫氧鏈終止法測序原理 利用DNA聚合酶和雙脫氧鏈終止物測定DNA核苷酸順序的方法，是由英國劍橋分子生物學(xué)實驗室的生物化學(xué)家F. Sanger等人于1977年發(fā)明的。4根本原理： 聚丙烯酰胺凝膠電泳可以區(qū)分長度只差一個核苷酸的DNA分子； 利用DNA聚合酶不可以區(qū)分dNTP和ddNTP的特性，使ddNTP參入到寡核苷酸鏈的3-末端。由于ddNTP 3不是-OH，不能與下一個核苷酸聚合延伸，從而終止DNA鏈的增長。562、詳細操作： 測序時分成四個反響, 每個反響除上述成分外分別參與2,3-雙脫氧的A, C, G, T核苷三磷酸稱為ddATP, ddCTP,ddGTP

3、, ddTTP, 然后進展聚合反響。在第一個反響中, ddATP會隨機地替代dATP參與反響，一旦ddATP參與了新合成的DNA鏈，由于其第3位的-OH變成了-H, 所以不能繼續(xù)延伸,于是第一個反響中所產(chǎn)生的DNA鏈都是到A就終止了。7 同理第二個反響產(chǎn)生的都是以C結(jié)尾的; 第三個反響的都以G結(jié)尾, 第四個反響的都以T結(jié)尾, 電泳后就可以讀出序列了.8 假設(shè)有一個DNA, 互補序列是GATCCGAT, 我們試著做一下: 在第一個反響中由于含有dNTP + ddATP, 所以遇到G, T, C三個堿基時沒什么問題, 但遇到A時, 摻入的能夠是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一個假設(shè)參

4、與反響的是ddATP那么終止, 產(chǎn)生一個僅有2個核苷酸的序列: GA, 否那么繼續(xù)延伸, 可以產(chǎn)生序列GATCCG, 又到了下一個A了. 同樣有兩種情況, 假設(shè)是ddATP摻入, 那么產(chǎn)生的序列是GATCCGA, 延伸終止, 否那么可以繼續(xù)延伸, 產(chǎn)生GATCCGAT. 將得到如下結(jié)果：1產(chǎn)生的都是以A結(jié)尾的片段: GA,GATCCGA。234產(chǎn)生的都是以C結(jié)尾的片段: GATC, GATCC產(chǎn)生的都是以G結(jié)尾的片段: G, GATCCG 產(chǎn)生的都是以T結(jié)尾的片段: GAT, GATCCGAT9 制得的四組混合物全部平行地點加在變性聚丙烯酸受凝膠電泳板上進展電泳，每組制品中的各個組分將按其鏈長

5、的不同得到分別，從而制得相應(yīng)的放射性自顯影圖譜。從所得圖譜即可直接讀得DNA的堿基序列。 即可得到測序結(jié)果：為GATCCGAT10制備單鏈模板 將單鏈模板與一小段引物退火 參與DNA多聚酶4種脫氧核苷酸分別參與少量4種雙脫氧核苷酸 將4種反響產(chǎn)物分別在4條泳道電泳 根據(jù)4個堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列 3、技術(shù)道路：114、 高通量自動化測序 DNA 序列分析自動化包括兩個方面的內(nèi)容，一方面是指“分析反響的自動化，另一方面是指“讀片過程的自動化。 自動化的DNA 序列分析，也是根據(jù)Sanger 雙脫氧鏈終止DNA測序法的根本原理開展起來的。12自動化測序原理 自動化測序類似于PCR反響

6、，但只用一條引物，反響混合物中含有不同熒光標(biāo)志的ddNTP與4種dNTP。由于每種ddNTP帶有各自特定的熒光顏色,而簡化為由1個泳道同時判讀4種堿基。產(chǎn)物條帶經(jīng)過檢測儀時給出特定信號，由計算機判讀并記錄。 優(yōu)點 ：可用雙鏈DNA做模板；模板用量少，不用克??；可實現(xiàn)高通量自動化。13高速自動DNA測序儀的構(gòu)造及任務(wù)原理 由激光發(fā)射器產(chǎn)生的激光束，經(jīng)過精細的光學(xué)系統(tǒng)后被導(dǎo)向凝膠外表的檢測區(qū)。在此，激光束垂直射向凝膠，同經(jīng)過檢測孔的DNA片段發(fā)生作用，并提供能量激發(fā)熒光發(fā)色基團發(fā)射出具特異性波長的熒光。這些熒光經(jīng)過聚焦鏡集中后傳給濾光鏡/棱鏡組件，以便四種堿基產(chǎn)生的不同標(biāo)志波長區(qū)別開來。經(jīng)成像透像

7、最后由高靈敏度的相機分段搜集信號，傳送給計算所分析處置。14 熒光化合物標(biāo)志鏈終止法以熒光顏色為標(biāo)志信號，每種ddNTP各有1種代表顏色；整個反響在一個試管中進展；當(dāng)新合成的終止單鏈經(jīng)過熒光監(jiān)測儀時，可由光信號讀出末端核苷酸并由電腦記錄。1516Sanger雙脫氧鏈終止DNA測序法的測序才干： 手工測序：最大約300 bp； 自動測序：最大約1200 bp。17二、序列比對分析1. 類似性與同源性類似性(similarity)： 是指一種很直接的數(shù)量關(guān)系，比如部分一樣或類似的百分比或其它一些適宜的度量。比如說，A序列和B序列的類似性是80，或者4/5。這是個量化的關(guān)系。當(dāng)然可進展本身部分比較。

8、18同源性(homology)： 指從一些數(shù)據(jù)中推斷出的兩個基因或蛋白質(zhì)序列具而共同祖先的結(jié)論，屬于質(zhì)的判別。就是說A和B的關(guān)系上，只需是同源序列，或者非同源序列兩種關(guān)系。而說A和B的同源性為80都是不科學(xué)的。19 序列的類似性和序列的同源性有一定的關(guān)系，普通來說序列間的類似性越高的話，它們是同源序列的能夠性就更高，所以經(jīng)?？梢越?jīng)過序列的類似性來推測序列能否同源。 正由于存在這樣的關(guān)系，很多時候?qū)π蛄械念愃菩院屯葱跃蜎]有做很明顯的區(qū)分，呵斥經(jīng)常等價混用兩個名詞。所以有出現(xiàn)A序列和B序列的同源性為80一說。20 序列類似性比較： 就是將待研討序列與DNA或蛋白質(zhì)序列庫進展比較，用于確定該序列的

9、生物屬性，也就是找出與此序列類似的知序列是什么。完成這一任務(wù)只需求運用兩兩序列比較算法。常用的程序包有BLAST、FASTA等；21 序列同源性分析： 是將待研討序列參與到一組與之同源，但來自不同物種的序列中進展多序列同時比較，以確定該序列與其它序列間的同源性大小。這是實際分析方法中最關(guān)鍵的一步。完成這一任務(wù)必需運用多序列比較算法。常用的程序包有CLUSTAL等；222. Blast簡介及運用1Blast簡介 BLAST 是由美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI開發(fā)的一個基于序列類似性的數(shù)據(jù)庫搜索程序。 BLAST是“部分類似性根本查詢工 具Basic Local Alignment Search

10、 Tool的縮寫。23 Blast 是一個序列類似性搜索的程序包，其中包含了很多個獨立的程序，這些程序是根據(jù)查詢的對象和數(shù)據(jù)庫的不同來定義的。比如說查詢的序列為核酸，查詢數(shù)據(jù)庫亦為核酸序列數(shù)據(jù)庫，那么就應(yīng)該選擇blastn程序。 下表列出了主要的blast程序：24主要的blast程序程序名查詢序列數(shù)據(jù)庫搜索方法Blastn核酸核酸核酸序列搜索逐一核酸數(shù)據(jù)庫中的序列Blastp蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)序列搜索逐一蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的序列Blastx核酸蛋白質(zhì)核酸序列6框翻譯成蛋白質(zhì)序列后和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的序列逐一搜索。Tblastn蛋白質(zhì)核酸蛋白質(zhì)序列和核酸數(shù)據(jù)庫中的核酸序列6框翻譯后的蛋白質(zhì)序列逐一比

11、對。TBlastx核酸核酸核酸序列6框翻譯成蛋白質(zhì)序列，再和核酸數(shù)據(jù)庫中的核酸序列6框翻譯成的蛋白質(zhì)序列逐一進行比對。252 Blast資源1、NCBI主站點：/BLAST/網(wǎng)絡(luò)版/blast/ 單機版2、其他站點：/blast/nema.cap.ed.ac.uk/ncbi_blast.html /blast/果蠅 26 Blast結(jié)果會列出跟查詢序列類似性比較高，符合限定要求的序列結(jié)果，根據(jù)這些結(jié)果可以獲取以下一些信息： 1.查詢序列能夠具有某種功能； 2.查詢序列能夠是來源于某個物種； 3.查詢序列能夠是某種功能基因的同源基因； 這些信息都可以運用到后續(xù)分析中。 273Blast運用登陸n

12、cbi的blast主頁核酸序列蛋白序列翻譯序列底下有其他一些針對特殊數(shù)據(jù)庫的和查看以往的比對結(jié)果等28Blast義務(wù)提交表單11.序列信息部分填入查詢query的序列序列范圍默許全部選擇搜索數(shù)據(jù)庫假設(shè)接受其他參數(shù)默許設(shè)置，點擊開場搜索29Blast義務(wù)提交表單2設(shè)置搜索的范圍，entrez關(guān)鍵詞，或者選擇特定物種2.設(shè)置各種參數(shù)部分一些過濾選項，包括簡單反復(fù)序列，人類基因組中的反復(fù)序列E值上限窗口大小假設(shè)他對blast的命令行選項熟習(xí)的話，可以在這里參與更多的參數(shù)30Blast義務(wù)提交表單33.設(shè)置結(jié)果輸出顯示格式選擇需求顯示的選項以及顯示的文件格式顯示數(shù)目Alignment的顯示方式挑選結(jié)果

13、E值范圍其他一些顯示格式參數(shù)點擊開場搜索31提交義務(wù)前往查詢號requestid可以修正顯示結(jié)果格式修正完顯示格式后點擊進入結(jié)果界面32結(jié)果頁面1圖形表示結(jié)果33結(jié)果頁面2目的序列描畫部分帶有g(shù)enbank的鏈接，點擊可以進入相應(yīng)的genbank序列匹配情況，分值，e值34結(jié)果頁面3詳細的比對上的序列的陳列情況354一個例子假設(shè)以下為一未知蛋白序列query_seq MSDNGPQSNQRSAPRITFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEELRFPRGQGVPINTNSGPDDQIGYYRRATRRVRGGDGKMKELSPRWYFYYLG

14、TGPEASLPYGANKEGIVWVATEGALNTPKDHIGTRNPNNNAATVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRGNSRNSTPGSSRGNSPARMASGGGETALALLLLDRLNQLESKVSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQDLIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYHGAIKLDDKDPQFKDNVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKKQPTVTLLPAADMDDFSRQLQNSMSGASADST QA 我們經(jīng)過blast搜索來獲取一些這個序列的信息。36詳細步驟：1.登陸blast主頁 /BLAST/2.根據(jù)數(shù)據(jù)類型，選擇適宜的程序3.填寫表單信息4.提交義務(wù)5.查看和分析結(jié)果371.登陸ncbi的blast主頁2.選擇程序，由于查詢序列是蛋白序列可以選擇blastp，點擊進入也可以選擇tblastn作為演示，我們這里選blastp383.填入序列copypasteFasta格式，或者純序列4.選擇搜索區(qū)域，這里我們要搜