與耐藥機(jī)制有關(guān)藥敏試驗(yàn)的規(guī)范化-課件

1、與耐藥機(jī)制有關(guān)藥敏試驗(yàn)的規(guī)范化 衛(wèi)生部北京醫(yī)院陳東科 前言細(xì)菌耐藥已成為一個(gè)全球性問題，已對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。耐藥細(xì)菌感染導(dǎo)致病人住院時(shí)間延長、費(fèi)用增加、死亡率增高，同時(shí)也給臨床醫(yī)生抗感染治療帶來困難。因此，檢測(cè)細(xì)菌耐藥機(jī)理是當(dāng)今細(xì)菌學(xué)的一個(gè)最重要的課題，也是正確指導(dǎo)臨床醫(yī)生合理使用抗生素的重要依據(jù)。 在細(xì)菌耐藥機(jī)理的檢測(cè)方面，包括分子生物學(xué)等許多實(shí)驗(yàn)方法被廣泛應(yīng)用。但這些方法的技術(shù)要求普遍較高，大多數(shù)被用于基礎(chǔ)研究。真正應(yīng)用到臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的試驗(yàn)方法，要求操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，試驗(yàn)成本不能太高。一、革蘭陽性球菌耐藥機(jī)制 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)項(xiàng)目（1）青霉素酶的檢測(cè) （2）MRS (

2、甲氧西林耐藥葡萄球菌 )（3） VISA / VRSA (萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌 )（4）腸球菌對(duì)青霉素和氨芐西林耐藥（5）HLAR (高水平氨基糖苷類耐藥 )（6）VRE (萬古霉素耐藥腸球菌 )（7） PRSP (青霉素耐藥肺炎鏈球菌 ) （8）克林霉素誘導(dǎo)試驗(yàn)（一）青霉素酶的檢測(cè) 檢測(cè)青霉素酶方法有碘量法、酸量法和顯色頭孢菌素法等，臨床應(yīng)用較多的是顯色頭孢菌素法。其原理是將受菌株與頭孢硝噻吩（Nitrocefin）作用一定時(shí)間后，如受試菌株產(chǎn)生青霉素酶，則可水解頭孢硝噻吩的-內(nèi)酰胺環(huán)，產(chǎn)生由黃色向紅色轉(zhuǎn)變的顏色反應(yīng)，即為青霉素酶試驗(yàn)陽性。 葡萄球菌可誘導(dǎo)-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)：如果青霉素對(duì)

3、葡萄球菌的MIC 0.12g/ml 或者抑菌環(huán)直徑29 mm，應(yīng)該對(duì)其進(jìn)行可誘導(dǎo)-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)。將待檢細(xì)菌傳代至BAP或者M(jìn)HA瓊脂平板上，用OX或FOX紙片作為誘導(dǎo)劑（具體方法同紙片藥敏試驗(yàn)），過夜培養(yǎng)，檢測(cè)抑菌圈周邊細(xì)菌的產(chǎn)酶情況。用頭孢硝噻吩紙片法（Cefinase）進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試時(shí)用1滴無菌水將Cefinase 紙片濕潤，將抑菌圈邊緣的受試菌直接涂于經(jīng)濕潤后的Cefinase 紙片，1h內(nèi)觀察其顏色反應(yīng)，紙片變紅色為誘導(dǎo)試驗(yàn)陽性，不變色（黃色）為陰性?？烧T導(dǎo)-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)陽性的菌株，應(yīng)報(bào)告對(duì)不耐酶青霉素耐藥。 (二)甲氧西林耐藥葡萄球菌（MRS）檢測(cè)檢測(cè)mecA 和其表達(dá)的青霉素結(jié)合

4、蛋白2a(PBP2a，也稱為PBP2)是預(yù)報(bào)葡萄球菌對(duì)甲氧西林耐藥最準(zhǔn)確的方法，它也被用于證實(shí)從嚴(yán)重感染病人分離的葡萄球菌紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)結(jié)果。攜帶mecA 基因或產(chǎn)PBP2a（mecA 基因表達(dá)產(chǎn)物）的葡萄球菌分離株，應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑西林/甲氧西林耐藥。不攜帶mecA 或不產(chǎn)PBP2a 菌株應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑西林敏感。由于罕見非mecA 基因介導(dǎo)的苯唑西林耐藥機(jī)制，在紙片擴(kuò)散法確定為苯唑西林耐藥時(shí)，應(yīng)加測(cè)苯唑西林MIC，若MIC4g/ml，即使mecA 基因和PBP 2a 檢測(cè)為陰性，也應(yīng)報(bào)苯唑西林耐藥?？捎眉埰瑪U(kuò)散法檢測(cè)這些菌株對(duì)頭孢西丁的敏感性。 1. 苯唑西林紙片篩選試驗(yàn) 方法：使用含1g苯唑

5、西林紙片（而不是甲氧西林或萘夫西林）來檢測(cè)葡萄球菌對(duì)甲氧西林的耐藥性。用直接菌落懸液法制備的接種物（0.5麥?zhǔn)媳葷釢舛染海┙臃NMH瓊脂平板， 待瓊脂表面的水份干后，貼苯唑西林紙片，于33-35孵育24h，測(cè)量抑菌圈直徑。 結(jié)果判斷：按NCCLS/CLSI解釋標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果，金黃色葡萄球菌和路鄧葡萄球菌抑菌圈直徑10mm為耐藥，13mm為敏感。除路鄧葡萄球菌外的其它凝固酶陰性葡萄球菌抑菌圈直徑17mm為耐藥，18mm為敏感。 注意事項(xiàng)（1）在透射光下仔細(xì)觀察苯唑西林紙片周圍抑菌圈內(nèi)有無細(xì)小菌落或輕微彌漫生長，如有說明耐藥。（2）試驗(yàn)溫度超過35不能檢測(cè)MRS。（3）紙片擴(kuò)散法結(jié)果如有疑問，必須進(jìn)

6、行mecA 基因或PBP2a 測(cè)定、頭孢西丁紙片試驗(yàn)、苯唑西林MIC 試驗(yàn)或苯唑西林鹽瓊脂篩選試驗(yàn)，來確定是否為MRS 菌株，選擇其中一種試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行報(bào)告。 2. 苯唑西林-鹽瓊脂篩選試驗(yàn) 方法： 試驗(yàn)用的MH瓊脂中含苯唑西林6g/ml，并添加有氯化鈉（4% W/V-0.68 mol/L）。直接菌落懸液獲得0.5 麥?zhǔn)蠞岫?。進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，使用1l 接種環(huán)蘸取菌液，在平板上涂成直徑10 到15mm 斑點(diǎn)。替代方法，用棉拭子蘸菌液涂成類似大小斑點(diǎn)或劃滿四分之一區(qū)。將瓊脂平板置于35，孵育24小時(shí)后檢查有無細(xì)菌生長，任何生長都表示對(duì)苯唑西林耐藥（如圖）。 注意事項(xiàng)： 為從凝固酶陰性葡萄球菌中檢測(cè)出甲氧

7、西林耐藥菌株，需要將瓊脂平板孵育48小時(shí)。 3. 頭孢西丁紙片法 方法： 應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的紙片擴(kuò)散法試驗(yàn)條件接種MH瓊脂平板，使用含30g頭孢西丁紙片， 35孵育24h（如耐藥則在孵育18h后可報(bào)告結(jié)果）。使用反射光閱讀頭孢西丁紙片試驗(yàn)結(jié)果。 結(jié)果判讀： 頭孢西丁對(duì)金黃色葡萄球菌和路鄧葡萄球菌抑菌圈直徑21mm時(shí)，應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑西林耐藥，22mm應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑西林敏感。除路鄧葡萄球菌外凝固酶陰性葡萄球菌抑菌圈直徑24mm時(shí)，應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑西林耐藥，25mm應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑西林敏感。注意事項(xiàng)：檢測(cè)凝固酶陰性葡萄球菌對(duì)苯唑西林的耐藥性，頭孢西丁紙片試驗(yàn)是首選方法（因?yàn)轭^孢西丁較苯唑西林的敏感性高，如圖）。 4.

8、mecA 基因及PBP2a 測(cè)定 方法：可采用乳膠凝集或分子生物學(xué)等方法進(jìn)行檢測(cè)（有成品試劑供應(yīng)）。 結(jié)果判斷：mecA 基因或PBP2a（mecA 基因表達(dá)產(chǎn)物）檢測(cè)陽性的葡萄球菌分離株，應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑西林/甲氧西林耐藥。不攜帶mecA或不產(chǎn)PBP2a 菌株應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑西林/甲氧西林敏感。 5. 苯唑西林MIC 試驗(yàn) 方法：可采用瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法或Etest等方法進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果判讀：若苯唑西林MIC4g/ml，即使mecA 基因和PBP 2a 檢測(cè)為陰性，也應(yīng)報(bào)苯唑西林耐藥（罕見非mecA基因介導(dǎo)的苯唑西林耐藥機(jī)制 ）。可同時(shí)用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)這些菌株對(duì)頭孢西丁的敏感性。 6. MRS的

9、臨床報(bào)告：對(duì)于甲氧西林耐藥的葡萄球菌（MRS），應(yīng)報(bào)告對(duì)所有-內(nèi)酰胺類藥物耐藥，而不考慮這些藥物的體外試驗(yàn)結(jié)果是否敏感。因?yàn)榇蠖鄶?shù)文獻(xiàn)報(bào)告了MRS 感染對(duì)-內(nèi)酰胺類治療反應(yīng)差或者因?yàn)檫€沒有令人信服的臨床數(shù)據(jù)證實(shí)這些藥的臨床效果。（三）萬古霉素耐藥葡萄球菌的篩選 1. 紙片篩選法 方法：應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的紙片擴(kuò)散法試驗(yàn)條件接種MH瓊脂平板，使用含30g萬古霉素紙片， 352孵育24h。 結(jié)果判斷：所有抑菌圈 14mm的葡萄球菌均應(yīng)用稀釋法測(cè)其MIC值。 注意事項(xiàng)：紙片擴(kuò)散法不能區(qū)分萬古霉素敏感（MIC 范圍0.52g/ml）和萬古霉素敏感性減低的菌株（MICs 48g/ml）。萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌

10、（VRSA）(MIC16g/ml)，在萬古霉素紙片周圍僅見輕微生長。用含6g/ml 萬古霉素BHI 瓊脂篩選平板，可提高檢測(cè)萬古霉素中介（VI）和萬古霉素耐藥（VR）金黃色葡萄球菌的敏感性。 2.瓊脂篩選法 方法：用含 6g/mL萬古霉素BHI瓊脂（腦心浸液瓊脂）進(jìn)行篩選試驗(yàn)，直接菌落懸液獲得0.5 麥?zhǔn)蠞岫?。使用微量吸管取菌?0l，點(diǎn)種瓊脂平板表面。替代方法，用棉拭子蘸菌液，擠去多余菌液，在平板上涂成直徑10 到15mm斑點(diǎn)或在部分區(qū)域劃線接種， 35，孵育24h，觀察結(jié)果。 結(jié)果判斷：點(diǎn)種位置出現(xiàn)1個(gè)以上菌落，推測(cè)菌株對(duì)萬古霉素敏感性減低。 注意事項(xiàng)：用含6g/ml 萬古霉素BHI瓊脂篩

11、選平板，可提高檢測(cè)萬古霉素中介和萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌的敏感性。 3. MIC確認(rèn)試驗(yàn) 方法：可采用瓊脂或肉湯稀釋法或Etest等方法進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果判斷： MIC 2g/ml 為敏感， MICs 48g/ml 為敏感性降低（VIS），MIC16g/ml為耐藥（VRS）。 注意事項(xiàng)：任何耐萬古霉素葡萄球菌(VISA /VRSA)應(yīng)送參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步確證。 （四）腸球菌對(duì)青霉素/氨芐西林耐藥性檢測(cè) 腸球菌對(duì)青霉素和氨芐西林耐藥是因?yàn)楫a(chǎn)生了低親和力的青霉素結(jié)合蛋白（PBPs），個(gè)別菌株是產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶。 紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)可準(zhǔn)確測(cè)定PBPs改變的菌株，但對(duì)產(chǎn)-內(nèi)酰胺酶的菌株結(jié)果不可靠。此類菌株

12、應(yīng)測(cè)-內(nèi)酰胺酶。 （五）高水平氨基糖苷類耐藥腸球菌檢測(cè) 方法：用高濃度慶大霉素（120g）或鏈霉素（300g）紙片可以篩選出此類耐藥性。 結(jié)果判斷：無抑菌圈為耐藥，抑菌圈直徑10mm時(shí)表明為非高水平耐藥。抑菌圈直徑在7-9mm的菌株應(yīng)使用稀釋篩選試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于慶大霉素，稀釋法的MIC500g/ml，即為耐藥。對(duì)于鏈霉素，微量肉湯稀釋法的MIC1000g/ml，瓊脂稀釋法的MIC2000g/ml，即為耐藥。 HLAR的臨床意義： 對(duì)高濃度氨基糖苷類敏感，表示氨基糖苷類與作用于細(xì)胞壁的抗菌藥物（如氨芐西林、青霉素、萬古霉素）聯(lián)合用藥時(shí)對(duì)該腸球菌菌株將具有協(xié)同作用，也是敏感的。 對(duì)氨基糖苷類高水

13、平耐藥（ HLAR ）表明當(dāng)青霉素或糖肽類與一種氨基糖苷類抗生素聯(lián)合用藥時(shí)對(duì)該腸球菌菌株不會(huì)產(chǎn)生協(xié)同效果。 （六）萬古霉素耐藥腸球菌的檢測(cè) 要想使用紙片擴(kuò)散法準(zhǔn)確檢測(cè)出耐萬古霉素腸球菌(VRE)，需要將平板孵育滿24h（而不是16-18h）,借透射光仔細(xì)檢查抑菌圈內(nèi)有無小菌落或彌漫生長。紙片法結(jié)果為中介度時(shí)應(yīng)測(cè)定MIC值。 可采用瓊脂或肉湯稀釋法或Etest等方法進(jìn)行MIC檢測(cè)。 篩選試驗(yàn) ： 6g/mL萬古霉素BHI瓊脂（腦心浸液瓊脂）篩選試驗(yàn)，35，孵育24h,點(diǎn)種位置出現(xiàn)1個(gè)以上菌落，推測(cè)菌株對(duì)萬古霉素敏感性減低。 （七）青霉素耐藥肺炎鏈球菌的檢測(cè) 1. 肺炎鏈球菌的耐藥機(jī)制 青霉素耐藥

14、肺炎鏈球菌（PRSP）的耐藥機(jī)制是肺炎鏈球菌有6種青霉素結(jié)合蛋白（PBP）發(fā)生改變，改變后使PBP（ -內(nèi)酰胺類抗生素的作用靶位）與青霉素的結(jié)合力下降，因而導(dǎo)致耐藥。 2. 紙片擴(kuò)散法檢測(cè) 方法：使用含1g苯唑西林紙片而不是青霉素紙片，來檢測(cè)肺炎鏈球菌對(duì)青霉素的耐藥性。 培養(yǎng)基：Mueller-Hinton瓊脂+5%羊血。 接種物：直接菌落懸液法，相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)。 孵育： 352；5%CO2；20-24小時(shí)。 結(jié)果判斷：當(dāng)苯唑西林抑菌環(huán)20mm時(shí)可報(bào)告肺炎球菌對(duì)青霉素敏感。并同時(shí)可報(bào)告氨芐西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、頭孢克羅、頭孢地尼、頭孢吡肟、頭孢他美、頭孢克肟、頭孢噻肟、頭孢

15、丙烯、頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢泊肟、頭孢唑肟、亞胺培南、氯碳頭孢和美羅培南敏感而不需要再測(cè)定這些藥的敏感性。當(dāng)苯唑西林的抑菌環(huán)19mm 的菌株應(yīng)當(dāng)測(cè)定青霉素和頭孢噻肟或頭孢曲松及美洛培南的MICs，因?yàn)橐志h(huán)19mm，可以發(fā)生在青霉素耐藥、中介或敏感的某些菌株中，不能僅僅根據(jù)苯唑西林的抑菌環(huán)19mm，就報(bào)告對(duì)青霉素耐藥或中介。 3. 稀釋法檢測(cè) 用M-H肉湯同時(shí)加2%-5%融血的馬血做肺炎鏈球菌的稀釋法藥敏試驗(yàn)。 青霉素的MIC 0.06g/ml 為敏感。（八）誘導(dǎo)性克林霉素耐藥檢測(cè) 1.耐藥機(jī)理： 對(duì)大環(huán)內(nèi)酯耐藥的葡萄球菌（ 或-溶血鏈球菌）可能存在有結(jié)構(gòu)性（天然）或誘導(dǎo)性對(duì)克林霉素的耐藥

16、通過erm 基因編碼的23S rRNA 甲基化也稱為MLSB（大環(huán)內(nèi)酯、林可和B 型鏈陽霉素）耐藥，或只對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥（由msrA 基因編碼的外排機(jī)制）。 2.檢測(cè)方法：培養(yǎng)基：Mueller-Hinton瓊脂+5%羊血接種物：直接菌懸液法，相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)。孵育： 352；5%CO2；20-24h。方法：誘導(dǎo)克林霉素耐藥可使用 “D”抑菌環(huán)試驗(yàn)，紙片邊緣相距12mm，可作為正常紙片擴(kuò)散法一部分，經(jīng)35孵育24h。結(jié)果判斷：若靠近紅霉素紙片（15g/片）側(cè)克林霉素(2g/片)的抑菌環(huán)出現(xiàn)“截平”（稱為“D”抑菌環(huán)），則菌株存在克林霉素誘導(dǎo)耐藥，應(yīng)報(bào)告對(duì)“克林霉素耐藥”。在報(bào)告單中可注明“

17、經(jīng)誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗(yàn)推測(cè)此菌株對(duì)克林霉素耐藥，在某些病人中克林霉素可能仍有效”。若無“截平”現(xiàn)象，則應(yīng)報(bào)告菌株對(duì)克林霉素敏感?！癉”試驗(yàn)陽性二、-內(nèi)酰胺酶介導(dǎo)的革蘭陰性細(xì)菌耐藥機(jī)制檢測(cè) 革蘭陰性細(xì)菌對(duì)-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥機(jī)制：（1）產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶水解滅活藥物；（2）細(xì)菌外膜通透性下降；（3）主動(dòng)泵出藥物。 其中產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶是革蘭陰性細(xì)菌對(duì)-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要原因。 臨床上重要的-內(nèi)酰胺酶有以下幾種： （1）超廣譜-內(nèi)酰胺酶（ESBL）； （2） 頭孢菌素酶（AmpC酶）； （3）碳青霉烯酶（包括KPC酶）。(一)超廣譜-內(nèi)酰胺酶（ESBL）的檢測(cè) 1.初篩試驗(yàn) (1)按常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)紙片

18、擴(kuò)散法進(jìn)行操作 對(duì)肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌和大腸埃希菌：頭孢泊肟抑菌圈直徑17mm、頭孢他啶22mm、氨曲南27mm、頭孢曲松25mm或頭孢噻肟27mm。 對(duì)奇異變形桿菌判斷標(biāo)準(zhǔn)：頭孢泊肟抑菌圈直徑22mm、頭孢他啶22mm或頭孢噻肟27mm。 上述抑菌圈直徑（任何一種藥物），提示菌株可能產(chǎn)ESBLs。 (2)按常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法進(jìn)行操作 結(jié)果判斷：頭孢他啶、氨曲南、頭孢曲松或頭孢噻肟等任何一種藥物對(duì)大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌的MIC2.0g/ml，頭孢泊肟MIC8.0g/ml，提示菌株可能產(chǎn)ESBLs。對(duì)奇異變形桿菌判斷標(biāo)準(zhǔn)：頭孢泊肟、頭孢他啶或頭孢噻肟MIC2.0g/ml。

19、2. 雙紙片協(xié)同法 按常規(guī)紙片擴(kuò)散法在MHA上涂布好受試菌，先在瓊脂平板中心貼上阿莫西林/克拉維酸(20g/10g)紙片，然后在其上下左右貼30g/片頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟和氨曲南紙片，各紙片中心距復(fù)合劑紙片中心距離20-30mm，35，孵育18-20h。結(jié)果解釋，如周圍4個(gè)藥物紙片中有任何一個(gè)抑菌圈在靠近復(fù)合劑紙片一側(cè)的邊緣出現(xiàn)擴(kuò)大或加強(qiáng)，說明該菌株產(chǎn)ESBLs。 3. 表型確證試驗(yàn) （1）紙片擴(kuò)散法：使用每片含30g頭孢他啶、頭孢噻肟紙片和頭孢他啶/克拉維酸（30g/10g）、頭孢噻肟/克拉維酸（30g/10g）的復(fù)合劑紙片進(jìn)行試驗(yàn)，當(dāng)任何一種復(fù)合劑紙片抑菌圈直徑大于（或等于）其單獨(dú)

20、藥敏紙片抑菌圈直徑5mm，可確證該菌株產(chǎn)ESBLs。 表型確證試驗(yàn) （2）瓊脂稀釋法：使用頭孢他啶(0.25-128g/ml)、頭孢他啶/克拉維酸(0.25/4-128/4g/ml)、頭孢噻肟(0.25-64g/ml)和頭孢噻肟/克拉維酸(0.25/4-64/4g/ml)進(jìn)行MIC測(cè)試，當(dāng)與克拉維酸聯(lián)合藥物組的MIC小于或等于單獨(dú)藥物組MIC 3個(gè)倍比稀釋度時(shí)（8倍濃度），可確證該菌株產(chǎn)ESBLs。 （二）AmpC酶的檢測(cè) 對(duì)于AmpC酶，CLSI目前還沒有可供推薦的方法進(jìn)行檢測(cè)，也沒有相應(yīng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)。目前用于AmpC酶定性的檢測(cè)方法很多，主要有以下幾種。 1. 單紙片擴(kuò)散法（初篩試驗(yàn)） 若抑

21、菌環(huán)直徑CAZ14mm、CTX14mm、CRO13mm、ATM15mm、CPD14mm、 FOX 14mm。 且克拉維酸協(xié)同或增效試驗(yàn)陰性時(shí)可疑為產(chǎn)AmpC酶菌株。 2. 雙紙片協(xié)同法（初篩試驗(yàn)）將0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇龣z菌液涂抹于MH瓊脂平板上，稍干后，把含200g/片氯唑西林（Cloxacillin, CLO）紙片貼于MH平板中央，于氯唑西林紙片周圍分別貼上頭孢西?。‵OX）紙片（紙片中心距離15-20mm ），置35過夜培養(yǎng)，觀察有無協(xié)同現(xiàn)象，氯唑西林與頭孢西丁有協(xié)同現(xiàn)象者可疑為產(chǎn)AmpC酶菌株。氯唑西林（200ug/片） 3 .雙紙片增效試驗(yàn) 將0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇龣z菌液涂抹于MH瓊脂平板上

22、，稍干后，在瓊脂培養(yǎng)基上貼頭孢西丁/氯唑西林、頭孢他啶/氯唑西林、頭孢噻肟/氯唑西林、頭孢曲松/氯唑西林、氨曲南/氯唑西林、頭孢泊肟/氯唑西林、頭孢哌酮/氯唑西林紙片，置35過夜培養(yǎng)。與單紙片平皿對(duì)照，若加氯唑西林紙片（ 200g/片）較未加氯唑西林紙片抑菌環(huán)直徑5mm（非CLSI標(biāo)準(zhǔn)），且對(duì)上述超廣譜-內(nèi)酰胺類抗生素（ESC）耐藥，即為AmpC酶陽性。 4.三維試驗(yàn)法（1）三維紙片法（初篩試驗(yàn)） 將0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濃度的標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌ATCC 25922菌液涂抹于MH瓊脂平板上，稍干后，貼一片頭孢西丁(FOX)紙片于MH平板中央，用無菌紙片沾取待檢菌貼在距抗生素紙片5mm處，置35過夜培養(yǎng)。出現(xiàn)

23、失狀菌苔者為陽性。 三維紙片法不能區(qū)分誘導(dǎo)或持續(xù)產(chǎn)酶。 （2）三維溝槽法三維（溝槽）實(shí)驗(yàn)是目前公認(rèn)的測(cè)定質(zhì)粒型或去阻遏（持續(xù)高產(chǎn)型）AmpC -內(nèi)酰胺酶的經(jīng)典方法，是唯一能夠鑒別AmpC酶和其它頭霉素耐藥機(jī)理（如外膜通透性降低）的方法。 1）三維溝槽試驗(yàn)方法將0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濃度的標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌ATCC 25922菌液涂抹于MH瓊脂平板上，稍干后，把含30g/片頭孢西丁紙片（Cefoxitin,FOX）貼于MH平板中央，分別在距頭孢西丁紙片5mm處，挖三個(gè)（最多四個(gè)）1104mm的槽，槽內(nèi)分別加入40l AmpC陽性對(duì)照菌、ESBLs陽性對(duì)照菌及待檢菌的粗提酶液，置35過夜培養(yǎng)。 2）三維試驗(yàn)法原

24、理 標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌ATCC 25922對(duì)頭孢西丁是敏感的，平皿上會(huì)出現(xiàn)2328mm的抑菌環(huán)，AmpC酶對(duì)照液加到槽中后，由于AmpC酶擴(kuò)散到周圍瓊脂中破壞了頭孢西丁(FOX)，因此槽周圍會(huì)長出細(xì)菌，抑菌環(huán)缺損，形成一指向FOX的矢狀菌苔，即AmpC酶陽性；而頭孢西丁（頭霉素）不會(huì)被ESBL水解，因此ESBL對(duì)照槽周圍抑菌環(huán)是完整的，即AmpC酶陰性；如果待檢菌溝槽處出現(xiàn)抑菌環(huán)的缺損，即為去阻遏AmpC酶陽性，反之陰性。三維試驗(yàn)法原理加樣槽酶擴(kuò)散區(qū)ATCC 25922抑菌環(huán)矢狀菌苔抗生素紙片 FOX3）去阻遏型（持續(xù)型）AmpC 酶的確認(rèn)菌株對(duì)超廣譜-內(nèi)酰胺類抗生素（ESC）耐藥；氯唑西林協(xié)同法和

25、增效法陽性；三維（溝槽）法陽性。 符合上述條件的菌株可判定為持續(xù)高產(chǎn)AmpC -內(nèi)酰胺酶株。（三）碳青霉烯酶的測(cè)定碳青霉烯酶: 指所有能明顯水解亞胺培南或美羅培南等碳青霉烯類抗生素的一類內(nèi)酰胺酶，分別屬于Ambler分子分類中的A類、B類、D類酶， 包括KPC 內(nèi)酰胺酶和金屬酶。CLSI目前還沒有可供推薦用于臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)金屬酶的方法，但是2009年的CLSI文件中（M100-S19-Appendix G）增加了對(duì)KPC 內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法(即改良的三維紙片法-Modified Hodge test)。 用于KPC酶定性的檢測(cè)方法主要有以下幾種： (1)改良三維試驗(yàn)法； (2)分子生物學(xué)方法。

26、用于金屬酶定性的檢測(cè)方法主要有以下幾種： (1)EDTA雙紙片協(xié)同及增效試驗(yàn)； (2)三維試驗(yàn)法； (3)分子生物學(xué)方法。 紙片篩選法：選用厄他培南、美羅培南。亞胺培南不作為碳青霉烯酶篩選藥物。改良Hodge試驗(yàn)是碳青霉烯酶的表型檢測(cè)方法，用于檢測(cè)KPC的敏感性及特異性均大于90%，但檢測(cè)其他碳青霉烯酶時(shí)，敏感性及特異性變化較大。1.KPC酶檢測(cè)2001年首次報(bào)道從肺炎克雷伯菌中分離到KPC-1，它屬于Bush分類法中的A類2f組，克拉維酸對(duì)其活性有抑制作用。KPC 內(nèi)酰胺酶目前已有4種亞型，包括KPC-1至KPC-4，他們之間只有個(gè)別氨基酸發(fā)生了突變。在多個(gè)菌屬中都有報(bào)道。主要為質(zhì)粒介導(dǎo)，但

27、在陰溝腸桿菌中可由染色體介導(dǎo)。國外報(bào)道， 產(chǎn)KPC 內(nèi)酰胺酶菌株即可表現(xiàn)為對(duì)碳?xì)涿瓜╊惪股啬退?，也可表現(xiàn)為中介或敏感，并存在接種效應(yīng)（即MIC與細(xì)菌的接種菌量成正比 ），這就增加了對(duì)其識(shí)別的難度。質(zhì)量控制Test positive and negative QC organisms each day of testing.K. pneumoniae ATCC BAA-1705 modified Hodge test positiveK. pneumoniae ATCC BAA-1706 modified Hodge test negativ2. 金屬酶(MBL)測(cè)定定義:活性部位帶金屬離子的

28、酶類稱金屬-內(nèi)酰胺酶(Metallo-lactamase, MBL), 這類酶不僅能水解碳青霉烯類而且能夠水解其他廣譜內(nèi)酰胺類抗生素。巰基化合物（2-巰基丙酸）對(duì)金屬-內(nèi)酰胺酶的抑制作用強(qiáng)于EDTA，但其毒性作用較強(qiáng)，因此用EDTA進(jìn)行檢測(cè)更安全些。 （1）雙紙片協(xié)同法 將0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇龣z菌液涂抹于MH瓊脂平板上，稍干后，把含10g/片亞胺培南紙片（Imipenem,IPM）貼于MH平板中央，于亞胺培南紙片周圍分別貼上EDTA-Na2(K2)（100mmol/L,5l）或巰基化合物（5l）紙片（紙片中心距離為24mm），置35過夜培養(yǎng)，有協(xié)同現(xiàn)象者為MBL陽性。EDTA(200ug/p)金屬酶檢測(cè)結(jié)果2-巰基丙酸金屬酶篩選試驗(yàn)（雙紙片法）： A:為陰性對(duì)照株，未出現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)B: 臨床分離株，靠近2-巰基丙酸一側(cè)CAZ抑菌圈明顯擴(kuò)大 A B頭孢他啶 2-巰基丙酸 （2