一章基因操作的主要技術(shù)原理課件

1、第一章 基因操作的主要技術(shù)原理第二節(jié) 凝膠電泳 凝膠電泳是一種分析鑒定重組DNA分子、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段，同時(shí)也是分子生物學(xué)研究方法的技術(shù)基礎(chǔ)。 1 凝膠電泳凝膠包含復(fù)雜的孔道網(wǎng)絡(luò)，DNA分子必須通過(guò)這些孔道才能夠到達(dá)陽(yáng)極。小的DNA分子，在凝膠中遷移的更快。按凝膠材料分: 聚丙烯酰胺凝膠 瓊脂糖凝膠電泳(普通和低熔點(diǎn)瓊脂糖)按電泳裝置分: 水平式/瓊脂糖凝膠 豎式/聚丙烯酰胺凝膠兩種方法比較：分離效果和分離范圍; 操作難易 凝膠電泳的種類(lèi) 基本原理帶有負(fù)電荷的DNA或RNA核苷酸鏈，依靠穩(wěn)定的無(wú)反應(yīng)活性的介質(zhì)（瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠）和緩沖液，在電場(chǎng)中以一定的遷移

2、率從負(fù)極移向正極。根據(jù)核酸分子大小不同、構(gòu)型或形狀的差異，以及所帶電荷的不同，可以通過(guò)電泳將其混合物中的不同成分彼此分開(kāi)。 2 核酸電泳凝膠的成分和濃度決定能夠分離的DNA大小瓊脂糖凝膠： 相對(duì)大的孔道，分離大一些的分子；聚丙烯酰胺凝膠： 很小的孔道，分離小的DNA分子， 能夠分離僅僅相差一個(gè)核苷酸的DNA分子。用途瓊脂糖凝膠： 用于DNA和RNA的常規(guī)分析聚丙烯酰胺凝膠： 常用于小分子核酸和蛋白質(zhì)分析凝膠電泳的一般程序 制膠，點(diǎn)樣，電泳，染色，觀察取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型分子量較小的DNA分子，比分子量較大的DNA分子遷移率要快；同等分子量的不同構(gòu)型的核酸分子，構(gòu)型緊密的比松散型的開(kāi)環(huán)

3、DNA分子或線性DNA分子遷移率要快。電泳的遷移率 與凝膠的類(lèi)型和密度相關(guān) 瓊脂糖凝膠的分辨力在0.250Kb之間; 聚丙烯酰胺的分辨力在11000bp之間；凝膠電泳的分辨力Separation Range of AgarosePolyAcrylamide Gels (PAGE)瓊脂糖： 一種從紅色海藻中提取出的線性多糖聚合物。分為 常熔點(diǎn)的瓊脂糖 低熔點(diǎn)（LMP）瓊脂糖2 瓊脂糖凝膠電泳Agarose gel electrophoresisLMP瓊脂糖 熔點(diǎn)：6265 熔解后，在37 可保持液態(tài)數(shù)小時(shí)； 在25 可保持液態(tài)約10min 回收DNA分子 在65 下將LMP瓊脂糖凝膠熔化； 加入

4、過(guò)量的酚抽提DNA； 離心獲得含DNA分子的上清液；瓊脂糖凝膠電泳的參數(shù)： 緩沖液：1 TAE（TBE, TPE） 凝膠的含量：根據(jù)檢測(cè)的DNA大小 加DNA樣品：1g，指示劑 電泳條件：大片斷低電壓長(zhǎng)時(shí)間， 小片段高電壓短時(shí)間 使凝膠中的DNA分子可視化染色是最簡(jiǎn)單的方法。溴乙錠(EtBr) 能夠用來(lái)對(duì)瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠中的DNA進(jìn)行染色。只要在足夠的DNA存在條件下，經(jīng)過(guò)EtBr染色后，在紫外照射下能以不同的條帶顯示出來(lái)。注意： 溴乙錠是非常強(qiáng)的致癌物；紫外光也會(huì)灼傷。因此，用于把DNA染成藍(lán)色或綠色，又不需要紫外照射就能看見(jiàn)DNA的非致癌染料，越來(lái)越多地被用于實(shí)驗(yàn)室研究中。染色和觀察

5、： 溴化乙錠（EB）染色， 在300nm波長(zhǎng)的紫外下觀察（凝膠成像儀） 能看到0.05 g的微量DNA DNA的片斷大小與熒光強(qiáng)度成正比DNA分子大小的估計(jì)如何確定凝膠電泳中片段的大小?最準(zhǔn)確的方法：利用遷移速度和分子重量間的數(shù)學(xué)關(guān)系。相關(guān)公式是： D=a-b (logM)D是遷移的距離，M是相對(duì)分子質(zhì)量，a和b是依賴(lài)于電泳條件的常數(shù)。通常使用：一種簡(jiǎn)單，但相對(duì)不太精確的估計(jì)DNA片段大小的方法。方法：利用已知大小的DNA片段作標(biāo)準(zhǔn)(marker /ladder),目的DNA片段與之比對(duì)、估計(jì)。例如：Hind將DNA切成8個(gè)片段，這些片段的大小都已經(jīng)知道，范圍從125bp到23kb。實(shí)驗(yàn)中的片

6、段大小可以通過(guò)對(duì)比兩條泳道中條帶的位置而加以估計(jì)。盡管不十分精確，這種方法進(jìn)行起來(lái)只有5的錯(cuò)誤率Sample Well 25 ng 1 kb ladder0.8% Agarose124681012kbAgarose Gel ElectrophoresisEtBr Detection Limit: 5-10 ng DNA根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA相對(duì)遷移距離推測(cè)待測(cè)定的DNA片段的大小Agarose gel electrophoresis對(duì)放射性標(biāo)記的DNA進(jìn)行放射性自顯影染色的一個(gè)缺陷是其靈敏性的限制，如果每條帶中DNA的含量少于10ng，則很有可能在染色后仍然看不到條帶。對(duì)于微量的DNA就需要更加靈敏的

7、檢測(cè)手段。放射自顯影是一個(gè)很好的方法。 電泳前將DNA結(jié)合上放射性標(biāo)記，利用X射線敏感攝影對(duì)凝膠進(jìn)行拍攝就能夠肉眼觀察到DNA分子。放射性DNA使膠片曝光，顯示出DNA條帶。聚丙烯酰胺凝膠： 丙稀酰胺/ 亞甲雙丙稀酰胺（29：1） TEMED 過(guò)硫酸銨（10）緩沖液：TBE3 聚丙烯酰胺凝膠電泳鏈分離凝膠-SSCP用于單鏈分離,可以進(jìn)行SNP的檢測(cè)。PAGE原理：SNP: DNA長(zhǎng)度相同，僅一個(gè)堿基不同；加熱后解鏈后電泳，遷移速度不同。可以分離1bp的差異用途：測(cè)序、AFLP、為避免局部區(qū)域產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)，可采用各種變性措施，如煮沸樣品，提高電泳溫度，凝膠中加入變性劑（尿素、甲醛、甲胺等）核酸測(cè)

8、序凝膠傳統(tǒng)凝膠電泳中，電場(chǎng)是沿著凝膠長(zhǎng)度走向定位的，DNA分子是沿著直線向正極遷移。不同大小的DNA分子在凝膠網(wǎng)狀孔道中遷移的時(shí)候，遷移速率不同，從而被分離開(kāi)。只有一定大小范圍內(nèi)的分子能夠通過(guò)這種方法分離，因?yàn)閷?duì)于大分子來(lái)說(shuō)，分子越大，遷移速率的差異越小。實(shí)際操作中，普通的凝膠電泳不能有效地分離大于50kb的DNA分子。4 通過(guò)凝膠電泳分離染色體1984年，D.R.Cantor發(fā)明的，分離超大分子量的DNA分子。在脈沖電泳中，電場(chǎng)方向是周期變化的，頭一個(gè)脈沖電場(chǎng)方向與核酸的移動(dòng)方向成45 角，下一個(gè)脈沖的電場(chǎng)方向與核酸移動(dòng)方向在另一側(cè)成45 角，由于加在瓊脂糖凝膠電泳上的電場(chǎng)方向、電流大小、以

9、及作用時(shí)間都在交替地變換著，這就使得DNA分子必須隨時(shí)調(diào)整其泳動(dòng)的方向，來(lái)適應(yīng)凝膠孔隙的無(wú)規(guī)則變化。脈沖電場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）脈沖場(chǎng)凝膠電泳原理圖 北 南 脈沖場(chǎng)電泳 常規(guī)電泳 兩組電極，排列不均勻; 一組電極，電場(chǎng)方向不變，電極排列均勻， 定時(shí)改變電場(chǎng)方向，DNA分子的凈 DNA移動(dòng)方向與電場(chǎng)方向相同。整個(gè)電泳 移動(dòng)方向與兩電場(chǎng)呈45o，在電泳過(guò) 過(guò)程保持電壓穩(wěn)定。常規(guī)方法制備DNA 程中，電壓有時(shí)可隨時(shí)間的增加而樣品增加， 制備DNA樣品與常規(guī)方法不同脈沖場(chǎng)凝膠電泳PFGE工作假說(shuō)1) DNA松弛時(shí)間：大分子DNA改變形狀和重新定向所需的時(shí)間。這個(gè)時(shí)間與DNA分子量呈正相關(guān)（Tr）2)

10、DNA移動(dòng)時(shí)間：DNA分子向前移動(dòng)的時(shí)間（Tm）3) 電場(chǎng)脈沖時(shí)間：其電場(chǎng)方向所持續(xù)的時(shí)間（Tp）與分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要較多的次數(shù)來(lái)更換其構(gòu)型和方位，使之能夠按新的方向游動(dòng)，所以遷移率就慢，從而達(dá)到了分離大分子量DNA分子的目的。可以分離幾千kb的DNA分子。這個(gè)長(zhǎng)度范圍包含許多真核生物染色體分子，包括酵母、許多重要的絲狀真菌和原生動(dòng)物，如瘧疾新生蟲(chóng)。因此，能夠得到這些生物體染色體的凝膠圖譜。 PFGE can resolve large DNA fragments染色體DNA電泳的用途 1. 測(cè)定染色體數(shù)目：特別適合于低等真核生物 2.測(cè)定基因連鎖關(guān)系：結(jié)合DN

11、A雜交技術(shù)，可適合各種生物 3.染色體DNA重排分析 1）酵母細(xì)胞經(jīng)X-射線照射，染色體發(fā)生斷裂，可得彌散型。 但讓其修復(fù)后，又可形成帶，但有的發(fā)生了重排，導(dǎo)致 帶型變化 2）非洲錐蟲(chóng)：變異表面糖蛋白基因的表達(dá) 4. 疾病的診斷 引起某種皮膚病的原生動(dòng)物L(fēng)eishmania, 具有其特征性的染色體。PFG便可用于診斷。 方法：不同的RNA電泳方法是依據(jù)使RNA分子變性所采取的方法。這些方法不僅要使RNA分子在點(diǎn)樣時(shí)是一級(jí)結(jié)構(gòu)，而且在整個(gè)電泳過(guò)程中也保持一級(jí)結(jié)構(gòu)。1.乙二醛/二甲基亞砜法 原理：乙二醛可以與核酸、核苷酸及堿基發(fā)生反應(yīng)，特別是鳥(niǎo)苷形成一個(gè)穩(wěn)定的附加環(huán)，從而阻止GC堿基的互補(bǔ)作用發(fā)生

12、。步驟：RNA+10mM羥甲基醛和50% DMSO混合 50、1 h變性 點(diǎn)樣 電泳 染色 觀察 5 RNA凝膠電泳2. 羥甲基汞法原理：羥甲基汞可與RNA分子的嘌呤或嘧啶堿基發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)部位是在可形成氫鍵的亞氨基處。步驟：RNA+10mM羥甲基醛，點(diǎn)樣在含4mM羥甲基醛的瓊脂糖凝膠上，電泳，染色觀察 3.甲醛法步驟：RNA+2.2M甲醛+50%甲胺，點(diǎn)樣在含2.2M甲醛瓊脂糖凝膠上，MOPS緩沖液電泳，染色觀察其它變性劑，如尿素、甲胺等也可用于RNA電泳. 4. 三種方法的比較 第一種方法安全，但由于反應(yīng)是不可逆的，由此回收的RNA樣品用于體外翻譯效果不好。第二、三種方法的反應(yīng)可逆，回收R

13、NA樣品可用于體外翻譯反應(yīng)，但操作必須小心，因兩種變性劑有毒。6 蛋白質(zhì)電泳方法：變性與非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，前者常稱(chēng)之為SDS。差別：有無(wú)變性劑用途：非變性凝膠可用于蛋白質(zhì)的分離純化過(guò)程中，可直接用于酶促反應(yīng)（顏色變化）SDS可用于蛋白質(zhì)分子量、亞基組成的測(cè)定。mRNA翻譯產(chǎn)物，基因表達(dá)產(chǎn)物測(cè)定等。 用于DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的回收方法 1)電洗脫法: 利用電泳方法將凝膠中的特定核酸分子洗脫到其它介質(zhì)中； 2) 濾紙法 核酸凝膠染色，長(zhǎng)波紫外光確定位置，在分離帶前方切一口子并插入濾紙條(其背面覆蓋透析袋膜)，電泳至DNA帶全部進(jìn)入濾紙條，洗脫DNA，純化、沉淀 7 電泳片段的分離與回收3) 透析袋法切下含DNA帶瓊脂塊，放入透析袋，封口，放入電泳槽，電泳2-3小時(shí)至全部