2.2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)(共20張PPT)課件

1、2.2 、土壤中分解尿素細(xì)菌分離與計(jì)數(shù)兩個(gè)主要目的：（1）從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌；（2）統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌。CO（NH2）2+H2OCO2+2NH3脲酶美國(guó)黃石國(guó)家公園的一個(gè)熱泉一、篩選菌株（一）自然界中目的菌株篩選實(shí)例： PCR的自動(dòng)化需要耐高溫的 DNA聚合酶，這種酶要能忍受93左右的高溫。 啟示：根據(jù)它對(duì)生存條件的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找提出的問題 如何尋找耐高溫的酶？ 解決問題的思路 尋找耐高溫環(huán)境； 原理 高溫淘汰其他菌，選出耐高溫細(xì)菌， 耐高溫菌種提取耐高溫酶。（二）實(shí)驗(yàn)室中目的菌株篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件（包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、PH等

2、），同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)?；卮穑?、在該配方中，為微生物生長(zhǎng)提供碳源和氮源的是什么物質(zhì)？2、絕大多數(shù)的微生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，請(qǐng)分析該培養(yǎng)基是否對(duì)微生物有選擇作用？如果有，是如何進(jìn)行選擇的？葡萄糖、尿素只有能夠以尿素作為氮源的微生物才能在該培養(yǎng)基上 （三）選擇性培養(yǎng)基:在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。加入青霉素的培養(yǎng)基: 分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基: 分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無(wú)氮培養(yǎng)基: 分離固氮菌不加含碳有機(jī)物的無(wú)碳培養(yǎng)基: 分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基:

3、分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞分解尿素細(xì)菌分離設(shè)計(jì):二、統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目1直接計(jì)數(shù)法：最常用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法。先將待測(cè)樣品制成懸液，然后取一定量的懸液放在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來計(jì)算出單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)。優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單、能觀察微生物的形態(tài)特征。缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌和活菌； 難以計(jì)數(shù)微小的細(xì)菌。 一般用于純培養(yǎng)懸浮液中各種單細(xì)胞菌體的計(jì)數(shù)。2間接計(jì)數(shù)法：最常用稀釋平板計(jì)數(shù)法。原理： 1個(gè)活菌1個(gè)菌落統(tǒng)計(jì)原則 選 30300 個(gè)菌落的平板統(tǒng)計(jì) 每個(gè)稀釋度取3個(gè)平板取其平均值注意：菌落計(jì)數(shù)偏差1、統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)比活菌的實(shí)際數(shù)目 低 。這是因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞在一起時(shí)，平板上觀察

4、到的只是 一個(gè) 菌落。因此，統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用 菌落數(shù) 來表示。2、顯微鏡直接計(jì)數(shù)活菌的實(shí)際數(shù)目 高 。這是因?yàn)橛?jì)數(shù)時(shí)連同死亡菌體一同計(jì)數(shù)。每克樣品中的菌株數(shù)（CV）MC：某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)V：涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積（ml)M：稀釋倍數(shù)三、對(duì)照設(shè)置設(shè)置對(duì)照的主要目的 是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。對(duì)照實(shí)驗(yàn)是指除了 被測(cè)試 的條件外，其他條件都 相同 的實(shí)驗(yàn)。滿足該條件的稱為 對(duì)照組，未滿足該條件的稱為 實(shí)驗(yàn) 組。思考6原因：土樣不同，培養(yǎng)基污染或操作失誤（或者是混入了其他的含氮物質(zhì))請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照實(shí)驗(yàn)組：方案1：其他同學(xué)用A同學(xué)的土樣進(jìn)行

5、實(shí)驗(yàn)。方案2：A同學(xué)以不接種的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。四、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的內(nèi)容包括實(shí)驗(yàn)方案、材料用具、實(shí)施步驟和時(shí)間安排等。實(shí)驗(yàn)流程：菌落計(jì)數(shù)配制土壤溶液系列稀釋涂布平板與培養(yǎng)1、土壤取樣土壤微生物主要分布在距地表38cm的近中性土壤中，約7080為細(xì)菌。2、樣品稀釋并涂布分離不同的微生物采用不同的稀釋度，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保證獲得菌落數(shù)在30300之間、適于計(jì)數(shù)的平板。細(xì)菌稀釋度為104、105、106，放線菌稀釋度為103、104、105，真菌稀釋度為102、103、104。如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的

6、計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。3、微生物的培養(yǎng)與觀察1） 培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。 細(xì)菌一般在3037培養(yǎng)12d， 放線菌一般在2528培養(yǎng)57d， 霉菌一般在2528的溫度下培養(yǎng)34d。2） 在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。3）菌落的特征包括 形狀、大小、隆起程度、顏色 等方面。注意：菌種中有些菌體增殖快，有些菌體增值慢，所以培養(yǎng)時(shí)間要充足，使得每個(gè)菌體都能形成肉眼可觀察到的菌落。 關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的

7、重要手段。 關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。 關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。 4、鑒定：篩選后必鑒定鑒別培養(yǎng)基：不影響微生物的生存 酚紅培養(yǎng)基： 鑒定分解尿素的細(xì)菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨培養(yǎng)基堿性增強(qiáng) 酚紅變紅脲酶陽(yáng)性五、實(shí)驗(yàn)過程注意1）取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。2）應(yīng)在火焰旁稱取土壤 10 g。將稱好的土樣倒入盛有90mL無(wú)菌水的錐形瓶中，塞好棉塞。3）在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行。4）實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時(shí)間、稀釋度、培養(yǎng)物等。5

8、）為了提高效率，在操作時(shí)更加有條不紊，應(yīng)當(dāng)事先規(guī)劃時(shí)間。六、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1對(duì)分離的菌種作進(jìn)一步的鑒定，還需要借助 生物化學(xué) 的方法。2在細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)中，細(xì)菌合成的 脲酶 將尿素分解成了 氨 。氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性 增強(qiáng) ，PH 升高 。因此，我們可以通過檢測(cè)培養(yǎng)基 pH 變化來判斷該化學(xué)反應(yīng)是否發(fā)生。3在以 尿素 為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入 酚紅 指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變 紅 ，說明該細(xì)菌能夠 分解尿素 。思考10測(cè)定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細(xì)菌過濾器過濾后，將濾膜放到 伊紅美藍(lán) 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn) 黑 色，通過記述得出水樣中大腸桿

9、菌的數(shù)量。你認(rèn)為在該實(shí)驗(yàn)中至少應(yīng)取 三 個(gè)水樣。及時(shí)訓(xùn)練1、實(shí)驗(yàn)測(cè)定鏈霉素對(duì)3種細(xì)菌的抗生素效應(yīng)，用3種細(xì)菌在事先準(zhǔn)備好的瓊脂塊平板上畫3條等長(zhǎng)的平行線（3條線均與下圖中的鏈霉素帶接觸），將平板置于37條件下恒溫培養(yǎng)3天，結(jié)果如圖所示。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析以下敘述，不正確的是 （ ）A鏈霉素能阻止結(jié)核菌的生長(zhǎng) B鏈霉素對(duì)結(jié)核菌比對(duì)霍亂菌更有效C鏈霉素對(duì)結(jié)核菌比對(duì)傷寒菌更有效 D鏈霉素可以用于治療傷寒病人 D2、影響微生物生長(zhǎng)的主要環(huán)境因素是A陽(yáng)光、溫度、水分 B溫度、水分、PH C水分、PH、氧 D溫度、PH、氧3、可以鑒定出分解尿素的細(xì)菌的方法是：（ ）A、以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑 B、以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入二苯胺試劑C、以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中