免疫學檢驗chap第七章熒光免疫技術

1、第七章 熒光免疫技術(Chapter 7 Fluoroimmunoassay)課程承擔：濟寧醫(yī)學院免疫學教研室課件制作：醫(yī)學免疫學省級教學團隊主 講 人：馬 群授課班級：2010級醫(yī)學檢驗本科授課時間：2013年9月10日臨床免疫學檢驗 熒光免疫技術：是將抗原抗體反應與熒光技術相結(jié)合而建立的一種免疫標記技術，具有高度特異性、敏感性和直觀性。第七章 熒光免疫技術fluorescence antibody technique, FATfluorescence immunoassay 熒光：熒光物質(zhì)在吸收激發(fā)光的能量后，使原來處于基態(tài)的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當其回復至基態(tài)時，激發(fā)態(tài)的電子以發(fā)射光的形式釋

2、放出能量，這種發(fā)射光稱為熒光。第七章 熒光免疫技術 熒光：熒光物質(zhì)在吸收激發(fā)光的能量后，使原來處于基態(tài)的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當其回復至基態(tài)時，激發(fā)態(tài)的電子以發(fā)射光的形式釋放出能量，這種發(fā)射光稱為熒光。常用熒光物質(zhì)： 異硫氰酸熒光素（FITC） 四乙基羅丹明（RB200） 藻紅蛋白（PE）第七章 熒光免疫技術 熒光抗體：是熒光免疫技術的關鍵試劑，是將熒光素與特異性的高親和力單克隆抗體通過化學共價鍵的方法結(jié)合而成。保存： 小量分裝、避光、4（半年）、-20（23年）、稀釋后4可保存13天。第七章 熒光免疫技術 熒光免疫組織化學技術：即熒光抗體技術、熒光顯微鏡技術，采用熒光素標記抗體與標本片中組織或細

3、胞抗原反應，經(jīng)洗滌分離后，在熒光顯微鏡下觀察呈現(xiàn)特異性熒光的抗原抗體復合物及其存在部位，借此對組織細胞抗原進行定性和定位監(jiān)測或?qū)ψ陨砜贵w進行定性和滴度測定。第一節(jié) 熒光免疫組織化學技術(Section 1 Fluorescence Immunohistochemistry Technique)一、基本原理（一）直接法第一節(jié) 熒光免疫組織化學技術簡便快速特異性強一種熒光抗體只能檢測一種抗原敏感度不如間接法一、基本原理（一）直接法第一節(jié) 熒光免疫組織化學技術一、基本原理（二）間接法第一節(jié) 熒光免疫組織化學技術一、基本原理（三）雙標記法第一節(jié) 熒光免疫組織化學技術設立嚴格的實驗對照正確區(qū)分特異性染色

4、和非特異性染色顯色分布、深淺為判斷依據(jù)二、結(jié)果判斷第一節(jié) 熒光免疫組織化學技術二、結(jié)果判斷第一節(jié) 熒光免疫組織化學技術第二節(jié) 熒光免疫分析(Section 2 Fluorescence Immunoassay) 熒光免疫分析是將抗原抗體反應與熒光物質(zhì)發(fā)光分析相結(jié)合，用熒光檢測儀測定抗原抗體復合物中特異性熒光強度，對液體標本中微量或超微量物質(zhì)進行定量測定。時間分辨熒光免疫測定熒光偏振免疫測定熒光酶免疫測定 時間分辨熒光免疫測定（TRFIA）是以鑭系元素標記抗原或抗體，并與時間測定技術相結(jié)合而建立起來的一種新型非放射性微量分析技術。一、時間分辨熒光免疫測定靈敏度高發(fā)光穩(wěn)定熒光壽命長自然熒光干擾少標

5、準曲線范圍寬第二節(jié) 熒光免疫分析（一）基本原理1時間分辨自發(fā)熒光壽命短:1ns10ns鑭系元素壽命長: 10s1000s短壽命熒光完全衰變后再測定鑭系元素特異熒光 一、時間分辨熒光免疫測定第二節(jié) 熒光免疫分析（一）基本原理2Stokes位移一、時間分辨熒光免疫測定第二節(jié) 熒光免疫分析stokes位移:激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的波長差鑭系元素Stokes位移大(273nm)，容易分開。（一）基本原理3發(fā)射光譜和激發(fā)光譜一、時間分辨熒光免疫測定第二節(jié) 熒光免疫分析發(fā)射光譜帶較窄：613nm10nm，干擾少（生物制品的本底熒光波長350600nm） 激發(fā)光譜帶較寬：300nm350nm，利于增加激發(fā)能，提

6、高靈敏度。一、時間分辨熒光免疫測定第二節(jié) 熒光免疫分析（二）標記物和標記方法 鑭系元素銪(Eu3+)鋱(Tb3+)釤(Sm3+)釹(Nd3+)鏑(Dy3+)熒光物質(zhì)熒光壽命(ns)熒光物質(zhì)熒光壽命(ns)非特異熒光背景110Sm3+ -NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000球蛋白3.0Eu3+-NTA714000細胞色素C3.5Eu3+-PTA925000FITC4.5Tb3+-PTA96000丹黃酰氯14Dy3+-PTA1000羅丹明B3.0一、時間分辨熒光免疫測定第二節(jié) 熒光免疫分析（三）方法類型雙抗體夾心法一、時間分辨熒光免疫測定第二節(jié) 熒光免疫分析（三）方法評價靈敏

7、度高：最小檢出值達10-18mol/L分析范圍寬：45個數(shù)量級標記物穩(wěn)定：有效使用期長測量快速，易自動化無放射性污染第二節(jié) 熒光免疫分析二、熒光偏振免疫測定 熒光偏振免疫測定是利用抗原抗體競爭反應原理，根據(jù)熒光素標記抗原與熒光素抗原抗體復合物之間熒光偏振程度的差異，測定體液中小分子抗原物質(zhì)的含量。 熒光素經(jīng)單一波長的偏振光照射后吸收光能，釋放出相應的偏振熒光，該熒光強度與熒光物質(zhì)受激發(fā)時分子轉(zhuǎn)動的速度成反比。（一）基本原理光線通過偏振濾光片后，形成一個方向的平面光稱為偏振光。偏振熒光(525550nm)偏振光(485nm)熒光物質(zhì)第二節(jié) 熒光免疫分析二、熒光偏振免疫測定AgF分子小，轉(zhuǎn)動速度快

8、，偏振熒光弱 AgF-Ab分子大，轉(zhuǎn)動速度慢，偏振熒光強 若待檢抗原多，則AgF-Ab少，AgF多，偏振熒光弱待檢抗原含量與偏振熒光強度成反比（一）基本原理第二節(jié) 熒光免疫分析二、熒光偏振免疫測定（二）方法評價第二節(jié) 熒光免疫分析二、熒光偏振免疫測定 樣品用量少 熒光素標記試劑穩(wěn)定，使用壽命長 快速，易自動化，重復性好 適于小分子物質(zhì)檢測 靈敏度低于非均相熒光免疫測定法第二節(jié) 熒光免疫分析三、熒光酶免疫測定 熒光酶免疫測定是利用酶標記抗體（或抗原）與待測抗原（或抗體）反應，借助酶催化熒光底物，經(jīng)酶促反應生成穩(wěn)定且高效的熒光物質(zhì)，通過測定熒光強度確定待檢抗原或抗體的含量。第二節(jié) 熒光免疫分析三、

9、熒光酶免疫測定（一）基本原理 標記酶：堿性磷酸酶（ALP） 底物：4-甲基傘形酮磷酸鹽（4-MUP） 產(chǎn)物：4-甲基傘形酮（4-MU） 照射：4-MU經(jīng)360nm激發(fā)光照射，可發(fā)出450nm的熒光，熒光測定儀測定其強度。第二節(jié) 熒光免疫分析三、熒光酶免疫測定（二）方法類型雙抗體夾心法雙抗原夾心法固相抗原競爭法第二節(jié) 熒光免疫分析三、熒光酶免疫測定（三）方法評價 綜合了酶免疫測定的放大效應和熒光測定的高敏感性 固相熒光酶免疫測定法效果好第三節(jié) 熒光免疫技術的應用(Section 3 Application of Fluoroimmunoassay)（一）病原體檢測疾病診斷、流行病學調(diào)查、臨床回顧診斷。（二）自身抗體檢測輔助診斷自身免疫性疾病?？购丝贵w(均質(zhì)型)抗核抗體(斑點型)抗核抗體(核膜型)第三節(jié) 熒光免疫技術的應用（三）免疫病理檢測組織中Ig、C、IC的檢測，和腫瘤相關抗原的鑒定。腫瘤（人肝癌細胞）第三節(jié) 熒光免疫技術的應用（四）細胞表面抗原和受體檢測淋巴細胞及其亞群的鑒定。第三節(jié) 熒光免疫技術的應用（四）細胞表面抗原和