2022年MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性及其應(yīng)用

1、精選精選.精選.MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性及其應(yīng)用一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握MTT法的根本原理和操作，學(xué)會(huì)應(yīng)用MTT法解決簡(jiǎn)單的實(shí)際問題。2.穩(wěn)固動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的知識(shí)，熟練相關(guān)操作。3.學(xué)會(huì)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀的操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理1.MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的HYPERLINK :/baike.baidu /view/2476475.htm t _blank 琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT復(fù)原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚Formazan并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。HYPERLINK :/baike.baidu /view/43063.ht

2、m t _blank 二甲基亞砜DMSO三聯(lián)溶液能 HYPERLINK :/baike.baidu /view/127111.htm t _blank 溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nmHYPERLINK :/baike.baidu /view/45341.htm t _blank 波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤HYPERLINK :/baike.baidu /view/1438772.htm t _blank 藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等

3、。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。2.細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的根本原那么是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，防止由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。精選精選.精選.3.從動(dòng)物機(jī)體中取出的相關(guān)組織通過胰蛋白酶或膠原蛋白酶可以將其分散成單個(gè)細(xì)胞。再放于適宜的培養(yǎng)基中，可以使這些細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖以供實(shí)驗(yàn)所需。該實(shí)驗(yàn)對(duì)無菌要求極高，以

4、培養(yǎng)出滿足實(shí)驗(yàn)條件的細(xì)胞。4.酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定的原理是在特定波長(zhǎng)下檢測(cè)被測(cè)物的吸光值。酶標(biāo)儀實(shí)質(zhì)就是一臺(tái)變相的專用光電比色計(jì)或分光光度計(jì)。三、實(shí)驗(yàn)材料，器材與試劑材料：Hela細(xì)胞器材：恒溫水浴鍋，超凈工作臺(tái)，培養(yǎng)箱37，5%CO2，冰箱4、-20、-70，液氮冰箱，滅菌鍋，燒杯，培養(yǎng)瓶，滴管，酒精燈，鑷子，離心機(jī)，24孔培養(yǎng)板，96孔培養(yǎng)板，搖床，酶標(biāo)儀，倒置顯微鏡，移液槍帶槍頭，15mL離心管,凍存管1-2mL，紅血球計(jì)數(shù)板，記號(hào)筆，0.22m濾膜，鋁箔紙。試劑：二甲基亞砜分析純，甘油，10%胎牛血清，胰蛋白酶0.5%，雙抗青霉素，鏈霉素 1萬單位/mL,磷酸緩沖液配制見附錄1，MTT

5、3-4，5-二甲基噻唑-2-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：精選精選.精選.HYPERLINK :/baike.baidu /view/4025606.htm噻唑藍(lán)。配制見附錄2，DMEM培養(yǎng)液(配制見附錄3)，無菌水，抗腫瘤藥物具體待定實(shí)驗(yàn)步驟A.Hela細(xì)胞復(fù)蘇 1.從液氮容器中取出從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化； 2. 從37水浴中取出凍存管，翻開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上DEME培養(yǎng)液，混勻； 3. 離心，1000rpm，5min； 4. 棄去上清液，參加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至110

6、4個(gè)/mL，局部接種培養(yǎng)瓶，37培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)； 5. 次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，此后定期更換培養(yǎng)液，維持細(xì)胞正?；钚?。B.MTT檢測(cè)復(fù)蘇細(xì)胞的細(xì)胞活性 Hela細(xì)胞計(jì)數(shù)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的四個(gè)角上的方塊。 1. 接種培養(yǎng)瓶同時(shí)，將其余局部接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，7組，每組5孔，每孔100L,37培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)； 2.培養(yǎng)24h后，向每孔內(nèi)參加用磷酸緩沖液配制的0.5%MTT5mg/mL20uL，37培養(yǎng)箱內(nèi)培育； 3.4h后終止培養(yǎng)，將孔內(nèi)培養(yǎng)液小心吸出。每孔參加150L二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。同時(shí)每行第一孔設(shè)置為調(diào)零孔培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。用酶標(biāo)儀O

7、D570nm處測(cè)量各孔吸光值；精選精選.精選.C.細(xì)胞生長(zhǎng)曲線制作 接B.2，B.3步驟，連續(xù)測(cè)量7天，根據(jù)測(cè)量結(jié)果繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。 橫坐標(biāo)生長(zhǎng)時(shí)間，縱坐標(biāo)吸光度值。D.探究某藥物對(duì)于細(xì)胞活性的影響 1.將之前培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞用0.5%胰蛋白酶洗脫，參加DEME培養(yǎng)液制成細(xì)胞密度為1106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液； 2.設(shè)置空白對(duì)照組及5個(gè)不同藥物梯度的實(shí)驗(yàn)組，分別加載96孔培養(yǎng)板內(nèi)5個(gè)梯度劑量按藥物種類待定，每個(gè)劑量分別設(shè)置5個(gè)平行孔，每孔參加細(xì)胞懸液100L在加藥的前一天下午完成鋪板； 3.次日上午按預(yù)先設(shè)置的藥物梯度加藥，后置37培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h； 4.每孔參加20LMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)

8、4h假設(shè)藥物能與MTT反響，可以先離心后棄去上清液，用PBS沖洗2-3遍后再參加MTT溶液 5終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液； 6.每孔參加150L二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光度； 7.同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔HYPERLINK :/baike.baidu /view/72787.htm培養(yǎng)基、MTT、HYPERLINK :/baike.baidu /view/43063.htm二甲基亞砜，對(duì)照孔細(xì)胞、相同HYPERLINK :/baike.baidu /view/63062.htm濃度的HYPERLINK :/baike.baidu /

9、view/31485.htm藥物HYPERLINK :/baike.baidu /view/127111.htm溶解介質(zhì)、HYPERLINK :/baike.baidu /view/3873575.htm培養(yǎng)液、MTT、HYPERLINK :/baike.baidu /view/43063.htm二甲基亞砜。精選精選.精選.E.Hela細(xì)胞凍存 1.配制含10%DMSO或甘油、1020%小牛血清的凍存培養(yǎng)液； 2.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰蛋白酶把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來，懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞那么直接將細(xì)胞移至15ml離心管中； 3.離心1000rpm，5min； 4.去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，參加適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5106/ml1107/ml； 5.將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管11.5 ml； 6.在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間及操作者； 7.凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1-2/ min；當(dāng)溫度達(dá)-25以下時(shí)，可增至-5-10/min；到-100時(shí)，那么可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20冰箱2h ，然后放入-70冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Hela細(xì)胞復(fù)蘇情況良好，生長(zhǎng)曲線繪制較好，成功驗(yàn)證腫瘤細(xì)胞對(duì)Hela細(xì)胞的作用。六、附錄1.磷酸緩沖液配制方法 NaCl 8g, KC