年齡和驚厥持續(xù)時間對持續(xù)驚厥發(fā)作后海馬細(xì)胞色素C釋放的影響

1、年齡和驚厥持續(xù)時間對持續(xù)驚厥發(fā)作后海馬細(xì)胞色素C釋放的影響【關(guān)鍵詞】驚厥Influenesfageandduratinfstatusnvulsivusnythrereleaseinhippapus【Abstrat】AI:TexplretheinfluenesfageandduratinfstatusnvulsivusSnintraellularythre(yt)releaseinhippapus.ETHDS:nvulsivesEizuresfr30inr3h(30inSr3hS)ereinduedin80infant(20dafterbirth)and80adultistarrats(IRsA

2、Rsrespetively)ithlithiupilarpineip.Theratseresarifiedat6differenttiepintsfrthe3ht7dafterSterinatin.Dynaihangefytlevelinhippapalellsasinvestigatedbyflytetry.RESULTS:Thelevelfytinhippapalellsinreasedintheearlystageafter30inS,andstartedtderease12hafterSinbthIRsandARs.Thepeaklevelasreahed6hafterS(32.476

3、.28)inIRsand(33.238.66)inARs).Bthftheeresignifiantlyhigherthanthsefntrlgrup(P0.01.Atthe7thdayafter30inS,thelevelfhippapalintraellularytinIRshaddereasedtthelevelfnralntrls,hilethelevelinARsasstillhigherthanthatfnralntrls(P0.05.Atthe1st,the3rd,andthe7thdayafterS,thelevelsfhippapalintraellularytinIRser

4、ebviuslylerthanthseinARs.parediththesaetiepintafter30inS,thelevelsfhippapalintraellularytafter3hSereuhhigherindifferentagegrups(P0.05.Exepttheeffetftheagerelateddifferene,thereasapsitiverrelatinbeteentheduratinfSandhippapalintraellularytntentinpartialrrelatinanalysisr=0.66，P0.05.NLUSIN:Severeseizure

5、uldindueintraellularytreleaseinhippapus.AgeandduratinfSereiprtantfatrsinflueningintraellularytrelease.ThelngertheduratinfSas,thehigherytlevelas.paredithARs,intraellularreleasefytdereasedsnerinIRsafterS,hihindiatedthatthereuldbeaninternalprtetiverespnseagainstbraindaageinpreaturebrain.【Keyrds】nvulsiv

6、us;ythre;age;hippapus;rat,istar【摘要】目的：討論年齡和驚厥持續(xù)時間對驚厥持續(xù)狀態(tài)S后海馬細(xì)胞色素yt釋放的影響.方法：安康成年(ARs)和生后20d幼齡istar鼠(IRs)各80只，經(jīng)腹腔注射氯化鋰匹羅卡品分別誘發(fā)持續(xù)驚厥發(fā)作30in的S(30inS)和3hS，在S后3h至7d的6個不同時點上處死動物，采用流式細(xì)胞儀檢測海馬細(xì)胞yt含量，比擬兩組間的動態(tài)變化.結(jié)果：30inS后3h，兩組大鼠海馬細(xì)胞yt含量均升高，6h到達(dá)頂峰，12h后開場回落.兩組yt含量峰值分別為32.476.28，33.238.66,顯著高于對照組P0.01.30inS后7d時，IRs組

7、yt含量已降至正常，而ARs組仍高于正常對照組P0.05.在S后1,3,7d,IRs組海馬細(xì)胞yt含量均顯著低于ARs組.3hS后3，6h，兩組海馬細(xì)胞yt含量均顯著高于30inS后的一樣觀察時點P0.05.經(jīng)偏相關(guān)參數(shù)分析，在排除年齡的影響后，不同驚厥持續(xù)時間與海馬細(xì)胞yt含量呈顯著正相關(guān)r=0.66，P0.05.結(jié)論：嚴(yán)重驚厥發(fā)作可導(dǎo)致海馬細(xì)胞yt的釋放.年齡和驚厥持續(xù)時間均是影響驚厥后海馬細(xì)胞yt釋放的重要因素.驚厥持續(xù)時間越長，海馬細(xì)胞yt釋放越明顯.與成年鼠不同，幼年鼠海馬細(xì)胞yt釋放啟動后不久即迅速回落，提示幼年腦內(nèi)可能存在一個主動抑制海馬細(xì)胞yt釋放的保護(hù)性反響.【關(guān)鍵詞】驚厥；

8、細(xì)胞色素；年齡；海馬；大鼠，istar0引言國內(nèi)外的動物實驗均證實持續(xù)驚厥發(fā)作將導(dǎo)致以海馬區(qū)神經(jīng)元死亡為主的選擇性腦損傷.我們的前期動物實驗提示未成熟期腦對驚厥具有更高的易感性，但可能對驚厥性腦損傷具有相對耐受性,未成熟期腦內(nèi)可能存在抑制驚厥后海馬神經(jīng)元凋亡的機(jī)制1.進(jìn)一步在調(diào)控細(xì)胞凋亡的上游過程探究此年齡差異性，尋找干預(yù)細(xì)胞死亡的有效環(huán)節(jié)，對防治驚厥性腦損傷具有重要價值.鑒于細(xì)胞色素ythre，yt在細(xì)胞死亡過程中的關(guān)鍵作用2，我們以成年istar大鼠和生后20d的幼鼠為研究對象，分析驚厥持續(xù)狀態(tài)statusnvulsivus，S后年齡和驚厥持續(xù)時間對大鼠海馬細(xì)胞凋亡早期環(huán)節(jié)yt釋放的影響.

9、1材料和方法1.1材料安康成年和生后20d的幼年按不同時期腦發(fā)育的組織學(xué)特征推算，相當(dāng)于人類成年期和嬰兒期istar大鼠各80只重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供.其中各64只參照本組前期實驗3采用氯化鋰匹羅卡品lithiupilarpine，Siga公司誘發(fā)S模型.在大鼠驚厥發(fā)作15in后，腹腔注射阿托品上海禾豐制藥1g/kg.在驚厥發(fā)作30in30inS和3h3hS后，腹腔注射水合氯醛上海禾豐制藥300g/kg止驚，分別于30inS后3，12h，1，3，7d及3hS后3，6h處死動物.成年組和幼年組同時設(shè)正常對照和實驗對照組腹腔注射阿托品和水合氯醛，每組8只.動物斷頭取腦，別離單側(cè)海馬用流式細(xì)胞

10、儀檢測海馬細(xì)胞yt含量FITyt抗體及其同型對照購自eBisiene公司.1.2方法實驗鼠于各時點斷頭取腦，別離單側(cè)海馬，40.01l/LPBS沖洗海馬3次,盡量去除附帶血管及纖維組織.將海馬組織置于200目篩網(wǎng)上，機(jī)械法制備海馬細(xì)胞單細(xì)胞懸液.用眼科剪盡量剪碎組織，同時用40.01l/LPBS沖洗，400目篩網(wǎng)過濾2次，濾液2500r/in離心5in；沉淀用PBS重懸,調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為109L.2500r/in，離心5in，棄上清后參加40g/L多聚甲醛1L，4固定30in.再離心，沉淀中參加2g/L皂素1L重懸細(xì)胞，4透膜15in.2500r/in，離心5in，棄上清后將細(xì)胞平均分為兩管，分

11、別參加FITyt抗體及其同型對照，抗體濃度維持于0.5g/109細(xì)胞.4避光孵育30in后，2500r/in離心5in，PBS洗2次，上機(jī)計數(shù)30000個細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測定488n處熒光強(qiáng)度.統(tǒng)計學(xué)處理:均值用xs表示.采用SAS軟件，同一年齡組多個時間點間比擬采用方差分析，不同年齡組一樣時點間比擬采用t檢驗，兩變量間關(guān)系采用偏相關(guān)分析，以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.2結(jié)果2.130inS后不同年齡期大鼠海馬細(xì)胞yt的含量正常狀態(tài)下，大鼠海馬細(xì)胞內(nèi)存在少量yt.在30inS發(fā)作后，不同年齡期大鼠海馬細(xì)胞yt含量均增多，并呈一動態(tài)變化過程.S后3h，兩組大鼠海馬細(xì)胞yt含量即開場顯著增加，均

12、于S后6h到達(dá)頂峰，分別為32.476.28，33.238.66，顯著高于正常對照組P0.01.隨后，幼年組海馬細(xì)胞yt含量即迅速回落，S后7d已降至正常對照組程度，而成年組那么呈緩慢回落趨勢，S后7d仍高于正常對照組.除S后6，12h外，幼年組海馬細(xì)胞yt含量均顯著低于成年組表1，此結(jié)果與前期實驗S后兩組間海馬神經(jīng)元凋亡發(fā)生率的差異存在一致性4.表1FITyt熒光強(qiáng)度表示的30inS后不同齡期大鼠海馬細(xì)胞胞質(zhì)yt含量的動態(tài)變化(略)aP0.05,bP0.01vs正常對照(同年齡)；P0.05,dP0.01vs同一時間點(不同年齡).2.2不同時程驚厥發(fā)作后大鼠海馬細(xì)胞yt的含量在本組yt釋放

13、最早發(fā)生和到達(dá)頂峰的觀察時點上S后3h和6h發(fā)現(xiàn)，驚厥發(fā)作后海馬細(xì)胞胞質(zhì)yt含量與驚厥持續(xù)時間呈正相關(guān)r=0.66，P0.05，不管在成年或幼年組中，驚厥發(fā)作時間越長，海馬細(xì)胞yt含量越高，而且，隨著驚厥持續(xù)時間的延長，驚厥后海馬細(xì)胞yt含量的年齡差異性更為明顯表2.表2FITyt熒光強(qiáng)度表示的不同驚厥持續(xù)時間對大鼠海馬細(xì)胞胞質(zhì)yt含量的影響(略)aP0.05,bP0.01vs正常對照(同年齡)；P0.05,dP0.01vs同一時間點(不同年齡).3討論臨床上小兒時期驚厥發(fā)生率遠(yuǎn)較成人為高，且更易發(fā)生長時程驚厥和驚厥持續(xù)狀態(tài)S，然而，由S引起的病死率和致殘率卻始終低于成人5，提示小兒對驚厥性腦

14、損傷具有相對耐受性.國內(nèi)外的動物實驗也證實驚厥發(fā)作將導(dǎo)致海馬神經(jīng)元死亡，未成熟腦內(nèi)神經(jīng)元死亡明顯低于成熟腦6-7；本課題組動態(tài)觀察不同年齡期istar大鼠S后海馬神經(jīng)元凋亡發(fā)生的規(guī)律，發(fā)現(xiàn)S后未成熟腦內(nèi)海馬神經(jīng)元凋亡發(fā)生后，將迅速出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡的抑制過程，使驚厥后腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡存在年齡差異，未成熟腦內(nèi)海馬神經(jīng)元凋亡低于成熟腦4.為了進(jìn)一步明確驚厥性腦損傷的年齡差異性，我們以yt從線粒體釋放到胞質(zhì)為中心，在調(diào)控細(xì)胞凋亡的上游環(huán)節(jié)進(jìn)展比照研究.大量證據(jù)說明yt從線粒體釋放是引發(fā)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟.在bad，bax等凋亡促進(jìn)基因的作用下，釋放入胞質(zhì)內(nèi)的yt可促使Apaf1，aspase9等裝配成as

15、pase復(fù)合體，進(jìn)一步激活aspase3，啟動aspase級聯(lián)反響，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡8，因此，yt釋放也是細(xì)胞凋亡早期事件的標(biāo)志之一.本實驗通過檢測30inS后成年與幼年istar鼠海馬細(xì)胞內(nèi)yt釋放的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)S后成年和幼年組海馬細(xì)胞yt含量都出現(xiàn)增高，均于S后6h達(dá)頂峰，然而，兩組海馬細(xì)胞yt含量的回落速度卻存在差異.與成年組相比，幼年組海馬細(xì)胞yt的含量呈迅速回落趨勢，7d內(nèi)降至正常程度，在S后1，3和7d，幼年鼠腦內(nèi)海馬細(xì)胞yt的含量均顯著低于成年組，提示S后腦損傷在yt釋放的細(xì)胞死亡早期事件程度上也存在明顯年齡差異.S后未成熟腦內(nèi)海馬細(xì)胞yt釋放的迅速抑制，從而使神經(jīng)細(xì)胞凋亡減少

16、，可能是S后驚厥性腦損傷存在年齡差異的根底.小兒時期容易有長時程驚厥和S發(fā)作，除年齡以外，驚厥持續(xù)時間是否對驚厥性腦損傷也有影響？Kang等9認(rèn)為S患兒的預(yù)后與病因親密相關(guān)，而與發(fā)作持續(xù)時間無顯著相關(guān)性；但aegaki等10卻發(fā)現(xiàn)驚厥發(fā)作持續(xù)時間對預(yù)后有重要影響，S長于2h者，預(yù)后不佳.針對臨床有關(guān)驚厥持續(xù)時間與腦損傷關(guān)系的爭議，人們采用動物實驗證實驚厥持續(xù)2040in，即可出現(xiàn)神經(jīng)元損傷，假設(shè)超過60in，腦內(nèi)神經(jīng)元便開場死亡，Grter等11也認(rèn)為S后海馬神經(jīng)元的缺失主要與驚厥持續(xù)時間相關(guān).本組實驗將S發(fā)作延長至3h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3hS后，無論是幼年鼠還是成年鼠，海馬細(xì)胞yt的釋放均明顯高于3

17、0inS的一樣觀察時點，與我們前期對細(xì)胞凋亡與S時程的相關(guān)性的研究結(jié)果一致4，從而在細(xì)胞凋亡的上游程度也證實驚厥持續(xù)時間與腦損傷存在明顯的正相關(guān)性.本研究提示年齡及驚厥持續(xù)時間均是影響驚厥后腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞yt釋放的重要因素.因此，及時有效地控制驚厥發(fā)作，進(jìn)一步探究未成熟腦內(nèi)yt的釋放迅速抑制的機(jī)制，將成為有效防治驚厥性腦損傷的重要途徑.【參考文獻(xiàn)】1蔣莉,蔡方成,張曉萍.大鼠不同成熟期大腦對持續(xù)驚厥的耐受性J.中華兒科雜志,2002,407：429-432.2TdneaI,NiklvaB,Gergieva,etal.Indutinfapptsisbyeletrtransferfpsitively

18、hargedprtEinsasythreandHistneH1intellsJ.BihiBiphysAta,2022,1721(13):55-64.3胡越，蔣莉.有效控制氯化鋰匹羅卡品誘發(fā)驚厥持續(xù)狀態(tài)發(fā)作的實驗研究J.兒科藥學(xué)雜志,2022，9(4):5-8.4蔣莉,蔡方成,李欣.驚厥持續(xù)狀態(tài)中大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元死亡的年齡特征J.中華兒科雜志,2002,40(9):545-549.5etsarantaP,Kivikk,PeltlaJ,etal.uteafterprlngednvulsiveseizuresin186hildren:Lrbidity,nrtalityJ.DevedhildNeurl,2022,46(1):4-8.6SetkizZ,JanezkK.LngterhangesinsuseptibilitytpilarpineinduedstatusepileptiusfllingnertialinjuriesintheratatdifferentdevelpentalstagesJ.EpilepsyRes,2022,53(3):216-224.7iliR,SgaaY,haBH,etal.Lngtereffetsfstatusepileptiusin