年齡和驚厥持續(xù)時間對持續(xù)驚厥發(fā)作后海馬細胞色素C釋放的影響

1、年齡和驚厥持續(xù)時間對持續(xù)驚厥發(fā)作后海馬細胞色素C釋放的影響【關鍵詞】驚厥Influenesfageandduratinfstatusnvulsivusnythrereleaseinhippapus【Abstrat】AI:TexplretheinfluenesfageandduratinfstatusnvulsivusSnintraellularythre(yt)releaseinhippapus.ETHDS:nvulsivesEizuresfr30inr3h(30inSr3hS)ereinduedin80infant(20dafterbirth)and80adultistarrats(IRsA

2、Rsrespetively)ithlithiupilarpineip.Theratseresarifiedat6differenttiepintsfrthe3ht7dafterSterinatin.Dynaihangefytlevelinhippapalellsasinvestigatedbyflytetry.RESULTS:Thelevelfytinhippapalellsinreasedintheearlystageafter30inS,andstartedtderease12hafterSinbthIRsandARs.Thepeaklevelasreahed6hafterS(32.476

3、.28)inIRsand(33.238.66)inARs).Bthftheeresignifiantlyhigherthanthsefntrlgrup(P0.01.Atthe7thdayafter30inS,thelevelfhippapalintraellularytinIRshaddereasedtthelevelfnralntrls,hilethelevelinARsasstillhigherthanthatfnralntrls(P0.05.Atthe1st,the3rd,andthe7thdayafterS,thelevelsfhippapalintraellularytinIRser

4、ebviuslylerthanthseinARs.parediththesaetiepintafter30inS,thelevelsfhippapalintraellularytafter3hSereuhhigherindifferentagegrups(P0.05.Exepttheeffetftheagerelateddifferene,thereasapsitiverrelatinbeteentheduratinfSandhippapalintraellularytntentinpartialrrelatinanalysisr=0.66，P0.05.NLUSIN:Severeseizure

5、uldindueintraellularytreleaseinhippapus.AgeandduratinfSereiprtantfatrsinflueningintraellularytrelease.ThelngertheduratinfSas,thehigherytlevelas.paredithARs,intraellularreleasefytdereasedsnerinIRsafterS,hihindiatedthatthereuldbeaninternalprtetiverespnseagainstbraindaageinpreaturebrain.【Keyrds】nvulsiv

6、us;ythre;age;hippapus;rat,istar【摘要】目的：討論年齡和驚厥持續(xù)時間對驚厥持續(xù)狀態(tài)S后海馬細胞色素yt釋放的影響.方法：安康成年(ARs)和生后20d幼齡istar鼠(IRs)各80只，經腹腔注射氯化鋰匹羅卡品分別誘發(fā)持續(xù)驚厥發(fā)作30in的S(30inS)和3hS，在S后3h至7d的6個不同時點上處死動物，采用流式細胞儀檢測海馬細胞yt含量，比擬兩組間的動態(tài)變化.結果：30inS后3h，兩組大鼠海馬細胞yt含量均升高，6h到達頂峰，12h后開場回落.兩組yt含量峰值分別為32.476.28，33.238.66,顯著高于對照組P0.01.30inS后7d時，IRs組

7、yt含量已降至正常，而ARs組仍高于正常對照組P0.05.在S后1,3,7d,IRs組海馬細胞yt含量均顯著低于ARs組.3hS后3，6h，兩組海馬細胞yt含量均顯著高于30inS后的一樣觀察時點P0.05.經偏相關參數分析，在排除年齡的影響后，不同驚厥持續(xù)時間與海馬細胞yt含量呈顯著正相關r=0.66，P0.05.結論：嚴重驚厥發(fā)作可導致海馬細胞yt的釋放.年齡和驚厥持續(xù)時間均是影響驚厥后海馬細胞yt釋放的重要因素.驚厥持續(xù)時間越長，海馬細胞yt釋放越明顯.與成年鼠不同，幼年鼠海馬細胞yt釋放啟動后不久即迅速回落，提示幼年腦內可能存在一個主動抑制海馬細胞yt釋放的保護性反響.【關鍵詞】驚厥；

8、細胞色素；年齡；海馬；大鼠，istar0引言國內外的動物實驗均證實持續(xù)驚厥發(fā)作將導致以海馬區(qū)神經元死亡為主的選擇性腦損傷.我們的前期動物實驗提示未成熟期腦對驚厥具有更高的易感性，但可能對驚厥性腦損傷具有相對耐受性,未成熟期腦內可能存在抑制驚厥后海馬神經元凋亡的機制1.進一步在調控細胞凋亡的上游過程探究此年齡差異性，尋找干預細胞死亡的有效環(huán)節(jié)，對防治驚厥性腦損傷具有重要價值.鑒于細胞色素ythre，yt在細胞死亡過程中的關鍵作用2，我們以成年istar大鼠和生后20d的幼鼠為研究對象，分析驚厥持續(xù)狀態(tài)statusnvulsivus，S后年齡和驚厥持續(xù)時間對大鼠海馬細胞凋亡早期環(huán)節(jié)yt釋放的影響.

9、1材料和方法1.1材料安康成年和生后20d的幼年按不同時期腦發(fā)育的組織學特征推算，相當于人類成年期和嬰兒期istar大鼠各80只重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供.其中各64只參照本組前期實驗3采用氯化鋰匹羅卡品lithiupilarpine，Siga公司誘發(fā)S模型.在大鼠驚厥發(fā)作15in后，腹腔注射阿托品上海禾豐制藥1g/kg.在驚厥發(fā)作30in30inS和3h3hS后，腹腔注射水合氯醛上海禾豐制藥300g/kg止驚，分別于30inS后3，12h，1，3，7d及3hS后3，6h處死動物.成年組和幼年組同時設正常對照和實驗對照組腹腔注射阿托品和水合氯醛，每組8只.動物斷頭取腦，別離單側海馬用流式細胞

10、儀檢測海馬細胞yt含量FITyt抗體及其同型對照購自eBisiene公司.1.2方法實驗鼠于各時點斷頭取腦，別離單側海馬，40.01l/LPBS沖洗海馬3次,盡量去除附帶血管及纖維組織.將海馬組織置于200目篩網上，機械法制備海馬細胞單細胞懸液.用眼科剪盡量剪碎組織，同時用40.01l/LPBS沖洗，400目篩網過濾2次，濾液2500r/in離心5in；沉淀用PBS重懸,調節(jié)細胞密度為109L.2500r/in，離心5in，棄上清后參加40g/L多聚甲醛1L，4固定30in.再離心，沉淀中參加2g/L皂素1L重懸細胞，4透膜15in.2500r/in，離心5in，棄上清后將細胞平均分為兩管，分

11、別參加FITyt抗體及其同型對照，抗體濃度維持于0.5g/109細胞.4避光孵育30in后，2500r/in離心5in，PBS洗2次，上機計數30000個細胞，流式細胞儀測定488n處熒光強度.統(tǒng)計學處理:均值用xs表示.采用SAS軟件，同一年齡組多個時間點間比擬采用方差分析，不同年齡組一樣時點間比擬采用t檢驗，兩變量間關系采用偏相關分析，以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義.2結果2.130inS后不同年齡期大鼠海馬細胞yt的含量正常狀態(tài)下，大鼠海馬細胞內存在少量yt.在30inS發(fā)作后，不同年齡期大鼠海馬細胞yt含量均增多，并呈一動態(tài)變化過程.S后3h，兩組大鼠海馬細胞yt含量即開場顯著增加，均

12、于S后6h到達頂峰，分別為32.476.28，33.238.66，顯著高于正常對照組P0.01.隨后，幼年組海馬細胞yt含量即迅速回落，S后7d已降至正常對照組程度，而成年組那么呈緩慢回落趨勢，S后7d仍高于正常對照組.除S后6，12h外，幼年組海馬細胞yt含量均顯著低于成年組表1，此結果與前期實驗S后兩組間海馬神經元凋亡發(fā)生率的差異存在一致性4.表1FITyt熒光強度表示的30inS后不同齡期大鼠海馬細胞胞質yt含量的動態(tài)變化(略)aP0.05,bP0.01vs正常對照(同年齡)；P0.05,dP0.01vs同一時間點(不同年齡).2.2不同時程驚厥發(fā)作后大鼠海馬細胞yt的含量在本組yt釋放

13、最早發(fā)生和到達頂峰的觀察時點上S后3h和6h發(fā)現(xiàn)，驚厥發(fā)作后海馬細胞胞質yt含量與驚厥持續(xù)時間呈正相關r=0.66，P0.05，不管在成年或幼年組中，驚厥發(fā)作時間越長，海馬細胞yt含量越高，而且，隨著驚厥持續(xù)時間的延長，驚厥后海馬細胞yt含量的年齡差異性更為明顯表2.表2FITyt熒光強度表示的不同驚厥持續(xù)時間對大鼠海馬細胞胞質yt含量的影響(略)aP0.05,bP0.01vs正常對照(同年齡)；P0.05,dP0.01vs同一時間點(不同年齡).3討論臨床上小兒時期驚厥發(fā)生率遠較成人為高，且更易發(fā)生長時程驚厥和驚厥持續(xù)狀態(tài)S，然而，由S引起的病死率和致殘率卻始終低于成人5，提示小兒對驚厥性腦

14、損傷具有相對耐受性.國內外的動物實驗也證實驚厥發(fā)作將導致海馬神經元死亡，未成熟腦內神經元死亡明顯低于成熟腦6-7；本課題組動態(tài)觀察不同年齡期istar大鼠S后海馬神經元凋亡發(fā)生的規(guī)律，發(fā)現(xiàn)S后未成熟腦內海馬神經元凋亡發(fā)生后，將迅速出現(xiàn)神經元凋亡的抑制過程，使驚厥后腦內神經元凋亡存在年齡差異，未成熟腦內海馬神經元凋亡低于成熟腦4.為了進一步明確驚厥性腦損傷的年齡差異性，我們以yt從線粒體釋放到胞質為中心，在調控細胞凋亡的上游環(huán)節(jié)進展比照研究.大量證據說明yt從線粒體釋放是引發(fā)細胞凋亡的關鍵步驟.在bad，bax等凋亡促進基因的作用下，釋放入胞質內的yt可促使Apaf1，aspase9等裝配成as

15、pase復合體，進一步激活aspase3，啟動aspase級聯(lián)反響，從而導致細胞凋亡8，因此，yt釋放也是細胞凋亡早期事件的標志之一.本實驗通過檢測30inS后成年與幼年istar鼠海馬細胞內yt釋放的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)S后成年和幼年組海馬細胞yt含量都出現(xiàn)增高，均于S后6h達頂峰，然而，兩組海馬細胞yt含量的回落速度卻存在差異.與成年組相比，幼年組海馬細胞yt的含量呈迅速回落趨勢，7d內降至正常程度，在S后1，3和7d，幼年鼠腦內海馬細胞yt的含量均顯著低于成年組，提示S后腦損傷在yt釋放的細胞死亡早期事件程度上也存在明顯年齡差異.S后未成熟腦內海馬細胞yt釋放的迅速抑制，從而使神經細胞凋亡減少

16、，可能是S后驚厥性腦損傷存在年齡差異的根底.小兒時期容易有長時程驚厥和S發(fā)作，除年齡以外，驚厥持續(xù)時間是否對驚厥性腦損傷也有影響？Kang等9認為S患兒的預后與病因親密相關，而與發(fā)作持續(xù)時間無顯著相關性；但aegaki等10卻發(fā)現(xiàn)驚厥發(fā)作持續(xù)時間對預后有重要影響，S長于2h者，預后不佳.針對臨床有關驚厥持續(xù)時間與腦損傷關系的爭議，人們采用動物實驗證實驚厥持續(xù)2040in，即可出現(xiàn)神經元損傷，假設超過60in，腦內神經元便開場死亡，Grter等11也認為S后海馬神經元的缺失主要與驚厥持續(xù)時間相關.本組實驗將S發(fā)作延長至3h，結果發(fā)現(xiàn)3hS后，無論是幼年鼠還是成年鼠，海馬細胞yt的釋放均明顯高于3

17、0inS的一樣觀察時點，與我們前期對細胞凋亡與S時程的相關性的研究結果一致4，從而在細胞凋亡的上游程度也證實驚厥持續(xù)時間與腦損傷存在明顯的正相關性.本研究提示年齡及驚厥持續(xù)時間均是影響驚厥后腦內神經細胞yt釋放的重要因素.因此，及時有效地控制驚厥發(fā)作，進一步探究未成熟腦內yt的釋放迅速抑制的機制，將成為有效防治驚厥性腦損傷的重要途徑.【參考文獻】1蔣莉,蔡方成,張曉萍.大鼠不同成熟期大腦對持續(xù)驚厥的耐受性J.中華兒科雜志,2002,407：429-432.2TdneaI,NiklvaB,Gergieva,etal.Indutinfapptsisbyeletrtransferfpsitively

18、hargedprtEinsasythreandHistneH1intellsJ.BihiBiphysAta,2022,1721(13):55-64.3胡越，蔣莉.有效控制氯化鋰匹羅卡品誘發(fā)驚厥持續(xù)狀態(tài)發(fā)作的實驗研究J.兒科藥學雜志,2022，9(4):5-8.4蔣莉,蔡方成,李欣.驚厥持續(xù)狀態(tài)中大鼠腦內神經元死亡的年齡特征J.中華兒科雜志,2002,40(9):545-549.5etsarantaP,Kivikk,PeltlaJ,etal.uteafterprlngednvulsiveseizuresin186hildren:Lrbidity,nrtalityJ.DevedhildNeurl,2022,46(1):4-8.6SetkizZ,JanezkK.LngterhangesinsuseptibilitytpilarpineinduedstatusepileptiusfllingnertialinjuriesintheratatdifferentdevelpentalstagesJ.EpilepsyRes,2022,53(3):216-224.7iliR,SgaaY,haBH,etal.Lngtereffetsfstatusepileptiusin