有機溶劑萃取講義

1、有機溶劑萃取講義萃取是生物分離中常用的單元操作原料前處理生物反應工程生物分離工程產品固液分離分離提取純化精制利用在兩個互不相溶的液相中各種組分（包括目的產物）溶解度的不同，從而達到分離的目的相似相溶的原理，選擇與目的物結構相近的溶劑 何謂萃取分子結構相似:組成,官能團根據萃取目標物的介電常數尋找極性相近的溶劑為萃取溶劑.一個良好的溶劑要滿足以下幾方面要求:有大的萃取容量:即單位體積的萃取溶劑能萃取大量的產物有良好選擇性:理想情況只萃取產物而不萃取雜質與被萃取的液相(通常是水相)互溶度小,且粘度低,;界面張力不或適中,有利于相的分散和兩相分離.溶劑的回收和再容易化學穩(wěn)定性好,不易分解,對設備腐蝕

2、性小經濟性好,價廉易得安全性好,無毒性或毒性低.不同的萃取劑對溶質的萃取效果不同。如疏水性的青霉素G和V酸性很強，其pKa值為2.53.1，相對分子質量分別為334和350，適宜用有機溶劑從發(fā)酵液中萃取，在pH 2.53.0范圍內，用乙酸戊酯和乙酸丁酯作為萃取劑的萃取效率高（如下表）。 青霉素在不同萃取劑中的分配系數溶劑pH 2.5（溶劑/水）pH 7.0（溶劑/水）乙酸戊酯45/11/235乙酸丁酯47/11/186乙酸乙酯39/11/260氯仿39/11/220乙醚12/11/190物理萃取即溶質根據相似相溶的原理在兩相間達到分配平衡，萃取劑與溶質之間不發(fā)生化學反應。例如，利用乙酸丁酯萃取

3、發(fā)酵液中的青霉素即屬于物理萃取?；瘜W萃取則利用脂溶性萃取劑與溶質之間的化學反應生成脂溶性復合分子實現溶質向有機相的分配。萃取劑與溶質之間的化學反應包括離子交換和絡合反應等。物理萃取和化學萃取化學萃取中通常用煤油、己烷、四氯化碳和苯等有機溶劑溶解萃取劑，改善萃取相的物理件質，此時的有機溶劑稱為稀釋劑(diluent)。由于氨基酸和一些極性較大的抗生素的水溶性很強，在有機相中的分配系數很小甚至為零，利用一般的物理萃取效率很低，需采用化學萃取?？捎糜诳股氐幕瘜W萃取劑有長鏈脂肪酸(如月桂酸)、烴基磺酸、三氯乙酸、四丁胺和正十二烷胺等。它們與抗生素形成復合物分子的疏水性比抗生素分子本身高得多，從而在有

4、機相中有很高的溶解度。萃取和反萃取在溶劑萃取分離過程中，當完成萃取操作后，為進一步純化目標產物或便于下一步分離操作的實施，往往需要將目標產物轉移到水相。這種調節(jié)水相條件，將目標產物從有機相轉入水相的萃取操作稱為反萃取(Back extraction)。除溶劑萃取外，其他萃取過程一般也要涉及反萃取操作。對于一個完整的萃取過程，常常在萃取和反萃操作之間增加洗滌操作，如下圖所示，洗滌操作的目的是除去與目標產物同時萃取到有機相的雜質，提高反萃液中目標產物的純度。下圖中虛線表示洗滌段出口溶液中含有少量目標產物，為提高收率，需將此溶液返回到萃取段。經過萃取、洗滌和反萃取操作，大部分目標產物進入到反萃相(第

5、二水相)，而大部分雜質則殘留在萃取后的料液相(稱作萃余相)。萃取、洗滌和反萃操作過程示意圖萃取體系的構成料液:供提取的溶液,通常水溶液溶質:從料液中提取出來的物質萃取劑:用來萃取產物的溶劑萃取液:溶質轉移到萃取劑中形成的溶液萃余液:被萃取出溶質后的料液稱為.雜質溶質料液（原）萃取劑Light phase萃取相Heavy phase、萃余相在一定溫度和壓力下，溶質分配在兩個不相溶的溶劑中達到平衡后，溶質在這兩相的濃度比為一常數K，此常數稱為分配系數是衡量萃取體系是否合理的重要參數：y-平衡時溶質在萃取相中的濃度X-平衡時溶質在萃余相中的濃度分配系數操作過程中，分配系數K越大，提取效率也越大，萃取

6、就越容易進行完全。當K值較小時，可以采取分次加入溶劑、連續(xù)對此提取來提高萃取率。產物的萃取效率與萃取溶劑和水相的性質有關.水相條件對萃取的影響 1）PH 影響選擇性.如青霉素在PH2萃取,萃取液中(醋酸_酯)青霉烯酸可達青霉素_量度2.5%,在PH3中則下降到4%,PH選擇在使產物穩(wěn)定的范圍內.2）溫度:影響穩(wěn)定性,一般在低溫下進行,影響分配子數3）鹽析:降低產物在水中的溶解度.如提Vb12時加硫銨，促進Vb12從水轉入有機相中；提青霉素進加NaCl.促進青霉素從水轉入有機相中4）帶溶劑:它們能與產物形成復合物,使產物易溶于有機溶劑中.復合物在一定條件下又要易分解.如青霉素可用脂肪堿作帶溶劑.

7、（化學萃?。┹腿〔僮?1)混合:料液與萃取劑充分混合形成具有很大比表面積的乳濁液.產物自料液轉入萃取劑中.(2)分離:分離或萃取相和萃余相(3)溶劑回收:從萃取相中分離出有機溶劑.所需設備：混合器（如攪拌混合器）、分離器（如碟片式離心機）、溶劑回收裝置（如蒸餾塔）混合萃取和分離也可在同一臺設備中，如Alfa-Laval萃取機。單級萃?。?料液與萃取劑加入混合物中攪拌平衡后的溶液送到分離器內分離得萃取相L萃余相R,L送到回收器.多級萃?。菏枪I(yè)生產最常用的萃取流程 分離效率高 產品回收率高 溶劑用量少 萃取流程使含溶質的溶液（h）和萃取劑（L）混合，靜止后分成兩層。單級萃取多級錯流萃?。簩⒍鄠€混

8、合澄清器單元串聯起來，各個混合器中分別通入新鮮萃取劑，而料液從第一級通入，逐次進入下一級混合器的萃取操作稱為多級錯流接觸萃取， 每次加新溶劑, 目標物濃度低, 萃取完全 多級逆流萃取將多個混合澄清器單元串聯起來，分別在左右兩端的混合器中連續(xù)通入料液和萃取液，使料液和萃取液逆流接觸，即構成多級逆流接觸萃取。反向進入，目標物在萃取液中濃度高，耗量少三級錯流萃取裝置a艾德連式三級錯流萃取裝置b泵混合分離器三級錯流萃取裝置c加擋齊格勒接觸器三級錯流萃取裝置d霍米莫脫接觸器乳化和去乳化實際發(fā)酵產物的萃取操作中常發(fā)生乳化現象。乳化即水或有機溶劑以微小液滴形式分散于有機相或水相中的現象。產生乳化后使有機相和

9、水相分層困難，出現兩種夾帶：發(fā)酵廢液(萃余液)中夾帶有機溶劑(萃取液)微滴，使目標產物受到損失；有機溶劑(萃取相)中夾帶發(fā)酵液(萃余液)，給后處理操作帶來閑難。 油水是互不相容的，要形成穩(wěn)定的乳濁液，一般要有第三種物質表面活性劑的存在。表面活性劑指一端具親水基團,一端具有親油基團,發(fā)酵液中PR（O/W）是主要的表面活性劑.如果當表面活性劑的親水基團強度大于親油基團易生成水包油型,反之形成油包水型.產生乳化的主要原因是發(fā)酵液中存在的蛋白質相固體顆粒等物質，這些物質具有表面活性劑的作用，使有機溶劑(油)和水的表面張力降低，油或水易于以微小液滴的形式分散于水相或油相中。產生乳化后，需采取某種手段破壞

10、乳濁液，提高萃取操作收率。破乳方法在實施萃取操作前，對發(fā)酵液進行過濾或絮凝沉淀處理，可除去大部分蛋白質及固體微攪，防止乳化現象的發(fā)生。破乳方法:過濾,離心,加入電解質,物理法(加熱,稀釋釋,吸附)、頂替法(戊醇)、轉型法防止乳化:除去Pr.雙水相萃取Two-aqueous phase extraction 基因工程產品如蛋白質和酶往往是胞內產品，需經細胞破碎后才能提取、純化，細胞顆粒尺寸的變化給固-液分離帶來了困難，同時這類產品的活性和功能對pH值、溫度和離子強度等環(huán)境因素特別敏感。由于它們在有機溶劑中的溶解度低并且會變性，因此傳統的溶劑萃取法并不適合。采用在有機相中添加表面活性劑產生反膠束的

11、辦法可克服這些問題，但同樣存在相的分離問題。因此基因工程產品的商業(yè)化迫切需要開發(fā)適合大規(guī)模生產的、經濟簡便的、快速高效的分離純化技術。其中雙水相萃取技術(two-aqueous phase extraction,ATPS)，又稱水溶液兩相分配技術(Partion of two aqueous phase extraction)是近年來出現的引人注目、極有前途的新型分離技術。 雙水相萃取法的特點是能夠保留產物的活性，整個操作可以連續(xù)化，在除去細胞或細胞碎片時，還可以純化蛋白質25倍，與傳統的過濾法和離心法去除細胞碎片相比，無論在收率上還是成本上都要優(yōu)越得多。除此以外，處理量相同時，雙水相萃取法比

12、傳統的分離方法,設備需用量要少310倍，因此已被廣泛地應用在生物化學、細胞生物學和生物化工領域，進行生物轉化、蛋白質、核酸和病毒等產品的分離純化和分析等。用此法來提純的酶已達數十種，其分離過程也達到相當規(guī)模，如乙醇脫氫酶的分離已達到幾十千克濕細胞規(guī)模，-半乳糖苷酶的提取也到了中試規(guī)模等。雙水相萃取法和傳統的分離方法(如鹽析或有機溶劑沉淀等)相比也有很大的優(yōu)勢，如以-半乳糖苷酶為例，用沉淀或雙水相萃取純化的比較見下表。雙水相系統：某些親水性高分子聚合物的水溶液超過一定濃度后可形成兩相系統。利用物質在不相溶的，兩水相間分配系數的差異進行萃取的方法應用：蛋白質特別是胞內蛋白質的分離純化。一、雙水相系

13、統形成原因：聚合物的不相容性，即聚合物分子的空間阻礙作用，無法形成均一相，具有相分離傾向，一定條件下分成兩相。常用于分離的雙水相系統：雙聚合物：聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dex)。該系統上相富含PEG，下相富含Dex；聚合物與無機鹽：聚乙二醇(PEG)/磷酸鉀（KPi)。該系統上相富含PEG，下相富含KPi。雙水相萃取的原理依據懸浮粒子與其周圍物質具有的復雜的相互作用：氫鍵電荷力疏水作用范德華力構象效應a兩相區(qū)雙節(jié)線均相區(qū)兩相區(qū)臨界點雙水相系統的相圖（雙節(jié)線）系線：連接雙節(jié)線上兩點的直線。同一系線上各點：兩相組成相同，體積不同。系線(TMB)長度：衡量兩相間相對差別的尺度。越長則兩相間性質差

14、別越大，反之則越??；趨向于零時，（雙節(jié)線上的點，臨界點），兩相差別消失，成為均一相。 在系線上各點處系統的總濃度不同，但均分成組成相同而體積不同的兩相。兩相的體積近似服從杠桿規(guī)則，即二、雙水相中的分配平衡 與溶劑萃取相同，溶質在雙水相中的分配系數也用m=c2/c1表示。為簡便起見，用c1 和c2分別表示平衡狀態(tài)下下相和上相中溶質的總濃度。 有關雙水相系統中溶質分配平衡的理論已有很多研究報導。但是，由于影響雙水相系統中溶質分配平衡的因素非常復雜，很難建立完整的熱力學理論體系。從雙水相萃取過程設計的角度出發(fā)，確定影響分配系數的主要因素是非常重要的。已有的大量研究表明，生物分子的分配系數取決于溶質與

15、雙水相系統間的各種相互作用，其中主要有靜電作用、疏水作用和生物親和作用等。因此，分配系數是各種相互作用的和.lnm=lnme+lnmh+lnmlme，mh，ml 分別為靜電作用、疏水作用和生物親和作用對溶質分配系數的貢獻。成相高聚物濃度界面張力成相高聚物的相對分子量一般來說，蛋白質等高分子量物質易集中于低分子量相鹽類(包括離子的類型和濃度、離子強度、pH值)，溶質的物理化學性質(包括分子量、等電點)以及體系的溫度等。影響物質分配平衡的因素三、影響萃取效果的因素1.成相聚合物分子量：降低聚合物的分子量，則蛋白質容易分配于富含該聚合物的相中?？倽舛龋涸酱髣t兩相性質的差別越大，系線越長，蛋白質越容易

16、分配于其中的某一相。鹽的種類和濃度對分配系數的影響主要反映在對相間電位和蛋白質疏水性的影響。在雙聚合物系統中，無機離子具有各自的分配系數，不同電解質的正負離子的分配系數個同，當雙水相系統中含有這些電解質時，由于兩相均應各自保持電中性，從而產生不同的相間電位，因此，鹽的種類(離子組成)影響蛋白質、核酸等生物大分子的分配系數，鹽濃度不僅影響蛋白質的表面疏水性，而且擾亂雙水相系統，改變各相中成相物質的組成和相體積比。2.鹽和緩沖液的影響例如，PEG/KPi系統中上、下相(或稱輕重相)的PEG和磷酸鉀濃度以及Cl離子在上、下相中的分配平衡隨添加NaCl濃度的增大而改變。這種相組成即相性質的改變直接影響

17、蛋白質的分配系數。離子強度對不同蛋白質的影響程度不同，利用這一特點，通過調節(jié)雙水相系統中的鹽濃度，可有效地萃取分離不同的蛋白質。3.pH值影響蛋白質的表面電荷數Z：影響蛋白質的解離度。影響：影響磷酸鹽的解離。4.溫度主要影響雙水相系統的相圖。大規(guī)模雙水相萃取操作一般在室溫下進行，主要基于以下考慮：PEG對蛋白質有穩(wěn)定作用；溶液粘度較低，容易相分離；節(jié)省冷卻費用。雙水相萃取的優(yōu)點較多用于胞內酶的提取和精制平衡時間短、含水量高、截面張力小，特別適合于生物活性物質的分離純化操作簡便易于放大要成功運用雙水相萃取應滿足的條件：欲提取的酶和細胞碎片應分配在不同的相中；酶的分配系數應足夠大，使在一定的相體積

18、比時，經過一次萃取，就能得到較高的收率；兩相用離心機很容易分離。四、雙水相萃取操作1.萃取和平衡1）雙水相系統的選擇：根據目標蛋白質和雜質的疏水性、分子量、等電點和表面電荷等性質上的差別，綜合利用靜電作用、疏水作用和添加適當種類和濃度的鹽，可選擇性萃取目標產物。設計試差實驗，確定最佳萃取系統：常利用多組10mL刻度離心管進行分配平衡實驗。配制高濃度的聚合物和鹽的備用溶液，利用其配制一系列不同濃度、pH和離子強度的雙水相；加入料液后，再加水稀釋，然后充分混合；離心使兩相完全分離；分別測定上、下相中目標產物濃度或生物活性，計算分配系數。2）胞內蛋白質的萃取優(yōu)勢：可選擇性地使細胞碎片分配于下相，目標產物分配于上相，同時實現目標產物的部分純化和細胞碎片的除去。細胞勻漿液濃度選擇：為降低成本，應盡量高，但過高會擾亂系統，降低分配系數，系統粘度增高，相分離困難。一般上限為200400g濕細胞/