水環(huán)境保護(hù)：第三章 藻類毒性試驗(yàn)

1、第三章藻類毒性試驗(yàn)第七章第三章魚(yú)類毒性試驗(yàn)請(qǐng)?jiān)诖随I入您自己的內(nèi)容藻類毒性試驗(yàn)基本內(nèi)容(一) 試驗(yàn)方法：靜止試驗(yàn)：完全不換水半靜止試驗(yàn)：至少每24h換水一次，對(duì)不穩(wěn)定易揮發(fā)的樣品每h或六h換水一次更好。藻類急性毒性試驗(yàn)定為96h(4d)一儀器(一) 儀器1、 顯微鏡2、分光光度計(jì)（波長(zhǎng)400750nm）3、 酸度計(jì)，014PH單位，準(zhǔn)確度 0.1pH單位。 4、 照度計(jì) 5、0.1ml浮游植物計(jì)數(shù)框或血球計(jì)數(shù)板6、臺(tái)式離心機(jī)4000轉(zhuǎn)分7、分析天秤，靈敏度0.1mg,稱重100mg 8、滅菌鍋(15磅(1.1kg/cm2)以上,121以上) 9、 恒溫干燥箱10 、搖床100110次分（二）玻璃

2、容器及容器的清洗1、 三角瓶（100、250、或500ml）2、50ml比色管3、量筒（10、100、250、1000ml）4、移液管（0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10, 100ml）5、 離心管6、試劑瓶 容器的清洗 1 、 玻璃器皿用洗劑刷洗2 、用自來(lái)水沖洗5次3 、水濾干后置10%的鹽酸溶液中浸泡過(guò)夜4 、再用自來(lái)水反復(fù)沖洗干凈5 、然后用蒸餾水洗 3次6 、 在105條件下烘干。7 、培養(yǎng)用的玻璃器皿在使用前經(jīng)1.5磅 (1.1kg/ cm2)、121，高壓滅菌15分鐘，160-180干熱消毒2小時(shí),8 、滅菌后,隨后用培養(yǎng)基蕩洗,倒立在吸水紙 上20-30分鐘至干。(三

3、) 培養(yǎng)基制備水生4號(hào)培養(yǎng)基硫酸銨(NH4)2SO4 0.20g過(guò)磷酸鈣Ca(H2PO4)2H2O+(CaSO4H2O) 0.030g 硫酸鎂MgSO47H2O 0.080g 碳酸氫鈉NaHCO 0.100g氯化鉀KCL 0.023三化鐵FeCl3 0.150ml土壤浸出液 0.5ml蒸餾水 1000ml1 、按每種營(yíng)養(yǎng)，分別配成1000倍貯備液。2 、每種貯備液各取1mL加到蒸餾水中， 最終體積為1升。3 、 必須注意，每加一種貯備液后應(yīng)充分搖勻后，再加入另一種貯備液。配 制 步 驟4 、土壤浸出液配制:用田土和水1：1混合，搖勻,靜置24小時(shí)，取上清液過(guò)濾，除去未能自然沉降的膠狀物。5 、

4、過(guò)濾液經(jīng)高壓滅菌20分鐘，貯存?zhèn)溆?使用期一年。配 制 步 驟現(xiàn) 用 培 養(yǎng) 基 NH4NO 0.2g KH2PO4 0.1g CaCL2 0.1g MgSO4 0.1g FeCL3 痕量 A5 1mg 水 1L(四) 試驗(yàn)藻種蛋白核小球藻 Chlorella pyrenoidosa銅銹微囊藻 Microcystis aeruginosa水華魚(yú)腥藻 Anabaena flos-apuae小球藻 Cyclotella sp菱形藻 Nitzschia sp羊角月芽藻 Selenastrum capri cornutum普通小球藻 Chlorella vulgaris斜生柵藻 Scenedemus

5、obliqus1 、上述藻種可以從備有藻種的有關(guān)單位索取;2 、也可以從鄰近的水體采取;3 、必須先經(jīng)分離與純化;4 、獲得純種，用于毒性試驗(yàn). 備注：二 試驗(yàn)處理藻種預(yù)培養(yǎng)1、將試驗(yàn)藻種經(jīng)無(wú)菌操作移種到盛有培養(yǎng)基的容器內(nèi);2、在所需溫度和光強(qiáng)下，通氣或振蕩培養(yǎng);3 、96小時(shí)移種一次，反復(fù)23次;4 、使藻類達(dá)到同步生長(zhǎng)階段,保持純種。三 毒性預(yù)備試驗(yàn)?zāi)康脑谟谔矫鞫疚飳?duì)藻類的半數(shù)有效濃度(EC50)的范圍; 為正式試驗(yàn)打基礎(chǔ);其處理濃度的間距可大一些，以盡可能卡住EC50值。預(yù) 試 驗(yàn) 濃度 活動(dòng)的大型溞 90 0 35 0 10 0 3.5 0 1 0 0.35 5 0.035 5 0.0

6、1 5 因此進(jìn)行正式試驗(yàn)的濃度范圍應(yīng)為0.35-1%.預(yù) 試 驗(yàn) 結(jié) 果T是試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，每種濃度中活動(dòng)的大型溞總數(shù)。 P是試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，每種濃度中不大活動(dòng)大型溞的百分?jǐn)?shù)。 濃度%1234TP055552000.35553417150.48224312400.6231127650.8016214801.00000190 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 90 8070605040 30 20 10 . . .24h(EC500.55%)對(duì)數(shù)濃度死亡率 大型溞的半數(shù)有效濃度24hEC50的測(cè)定有效濃度中4dEC50的測(cè)定1 在圖上用內(nèi)插法可計(jì)算出有效濃度

7、中4dEc50為0.55%;2 對(duì)廢水可表示為4dEc500.55%或 5.5mg/L，3 對(duì)化學(xué)物質(zhì)可表示為4dEc500四 預(yù)備試驗(yàn)試驗(yàn)濃度按等對(duì)數(shù)間距設(shè)置;一般至少要5個(gè)毒物濃度和個(gè)對(duì)照;如果能做7個(gè)毒物濃度，對(duì)試驗(yàn)更為有利;預(yù)備試驗(yàn)的方法與培養(yǎng)條件均同正式試驗(yàn) .內(nèi)容：五 正式試驗(yàn)(一) 培養(yǎng)容器1、一般要求質(zhì)量好的硼硅酸鹽玻璃容器;2、研究恒量元素則應(yīng)選用特殊的玻璃器皿;3、在同一批試驗(yàn)中自始至終應(yīng)使用一種類型的玻璃，以便于試驗(yàn)結(jié)果的比較.(二) 樣品的制備 根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)的結(jié)果:1 、按等對(duì)數(shù)間距取5至7個(gè)毒物濃度;2 、其中一個(gè)能引起生長(zhǎng)率下降50%的濃度;3 、并在此濃度上下至少

8、各設(shè)兩個(gè)濃度;4、另外加一個(gè)對(duì)照，各濃度組均設(shè)三個(gè)平行樣。(三) 藻種的制備與移種量1、 取同步生長(zhǎng)的藻類培養(yǎng)液離心;2 、棄去上清液;3、用適量體積的濃度為15mgL的碳酸氫鈉溶液將沉淀細(xì)胞再懸浮并再離心;4、用同樣濃度的碳酸氫鈉溶液懸浮細(xì)胞，配成 所需的初始細(xì)胞濃度. 不同藻種的初始細(xì)胞密度參考表 細(xì)胞密度（個(gè)/ml） 羊角月芽藻 1103 水華魚(yú)腥藻 5104 銅銹微囊藻 5104 普通小球藻 5105 斜生柵藻 1105不同藻種的初始細(xì)胞密度計(jì)算 例如：假定月芽藻液細(xì)胞密度為5105個(gè)細(xì)胞/ml，培養(yǎng)液體積為10ml，那么加0.2ml藻液即可得到1103個(gè)細(xì)胞/ml的初始濃度。（四）藻

9、類培養(yǎng)條件1 藍(lán)（硅）藻，在242，白色熒光燈光照下培養(yǎng)，光強(qiáng)2000米燭光（或2152米燭光）10%；2 綠藻在同樣溫度4000米燭光（或4304米燭光）10%的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)容器可置搖床上振蕩（110次/分）;（四）藻類培養(yǎng)條件人工通以含CO2 3%的空氣或定時(shí)搖動(dòng)，以便空氣交換，光暗比為14:10或12:12。（五）藻類生長(zhǎng)測(cè)定 一般為24或48h取樣一次; 在96h，取樣測(cè)定毒物對(duì)藻類影響的EC50值，并與對(duì)照比，生長(zhǎng)率下降50%的毒物濃度。確定藻類生長(zhǎng)的指標(biāo):1 光密度：用分光光度計(jì)或比色儀在波長(zhǎng)600750nm處直接測(cè)定藻類的吸光率。 2 細(xì)胞數(shù) （） 用血球計(jì)數(shù)板或浮游植物計(jì)數(shù)

10、框直接顯微鏡計(jì)數(shù)或用電子顆粒計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)， （）如果是絲狀藻類，則先用超速攪拌器或超聲處理使絲狀藻體破碎后，再用顯微鏡計(jì)數(shù), （）同一樣品計(jì)數(shù)兩次，計(jì)數(shù)結(jié)果之差如果15%，則需計(jì)數(shù)第三次。3 葉綠素含量在萃?。?0%的丙酮）之后，常用分光光度法在波長(zhǎng)663和645nm處測(cè)定其吸光率，按下式計(jì)算葉綠素含量。全葉綠素（mg/L）20.2A645+8.02A6633 葉綠素含量葉綠素a(mg/l)=12.7A 663-2.69A645葉綠素b(mg/l)=22.9A645-4.68A663式中：A=吸光率。4測(cè)定藻類細(xì)胞干重將藻類離心或沉淀、過(guò)濾后，用坩堝烘干，稱重為藻類細(xì)胞的干重。5 藻類生物量藻類細(xì)胞數(shù)和光密度