基因工程載體和受體

1、關(guān)于基因工程的載體和受體第一張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 一、用于基因克隆的載體（1）攜帶外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞的工具。（2）能夠運(yùn)載外源DNA片段（目的基因）進(jìn)入受體細(xì)胞，具有自我復(fù)制能力，使外源DNA片段在受體細(xì)胞中得到擴(kuò)增和表達(dá)，不被受體細(xì)胞的酶系統(tǒng)所破壞的一類DNA分子。（3）實(shí)質(zhì)：用來攜帶目的基因片段進(jìn)入受體細(xì)胞。1.載體的概念第二張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2.載體的功能（function of vector）運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件第三張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月3.

2、載體應(yīng)具備的條件（characteristics of vector）可轉(zhuǎn)移性：具有針對受體細(xì)胞的親緣性或親和性。具有與受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)（ori，origin of replication）或整合位點(diǎn) 。具有較高的外源DNA的裝載能力。多克隆位點(diǎn)（multiple cloning site, MCS）：具有多種限制性內(nèi)切酶的單一切點(diǎn) 。具有合適的篩選標(biāo)記（selection marker）。安全，不含對受體細(xì)胞有害的基因，不會任意轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞以外的其他生物細(xì)胞中。第四張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)粒（plasmid）噬菌體或病毒DNA考斯質(zhì)粒（cosmid）與噬菌粒人造染

3、色體載體4.載體的種類第五張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）質(zhì)粒（plasmid）1.質(zhì)粒的定義質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于染色體而自主復(fù)制，并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子。質(zhì)粒常見于原核細(xì)菌和真菌中。絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的。絕大多數(shù)質(zhì)粒具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA（covalently closed circularDNA，cccDNA）。質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1 - 300 kb。功能：進(jìn)行細(xì)胞間接合，并帶有一些基因，如產(chǎn)生毒素、抗藥性、固氮、產(chǎn)生酶類、降解功能等。第六張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的

4、DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制。根據(jù)在每個細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒：1 - 3 拷貝 stringent plasmid松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒：10 - 60 拷貝 relaxed plasmid但這種對應(yīng)關(guān)系不是絕對的，若細(xì)胞生長環(huán)境中存在蛋白質(zhì)合成抑制劑（氯霉素、壯觀霉素等）時，細(xì)胞的染色體DNA的復(fù)制受阻，而質(zhì)粒仍可擴(kuò)增，使其數(shù)量可達(dá)數(shù)千拷貝。2.質(zhì)粒的基本特征第七張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）質(zhì)粒的不相容性（incompatibility）任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時存在于一個細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相

5、容性，不相容性的質(zhì)粒組成不相容性群。以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容；pSC101、F、RP4 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容；p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容。通常一個質(zhì)粒含有一個與相應(yīng)的順式作用控制要素結(jié)合在一起的復(fù)制起始區(qū)（整個遺傳單位定義為復(fù)制子）。在不同的質(zhì)粒中，復(fù)制起始區(qū)的組成方式是不同的，有的可決定復(fù)制的方式，如滾環(huán)復(fù)制和 復(fù)制。在大腸桿菌中使用的大多數(shù)載體都帶有一個來源于 pMB1 質(zhì)粒或 ColE1 質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)。第八張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)粒不相容的分子機(jī)制兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的質(zhì)

6、粒，在復(fù)制時受同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的控制而產(chǎn)生競爭，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同。其中，拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢，并逐步將另一質(zhì)?！跋♂尅碧蕴?。兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒，在復(fù)制時受各自的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此經(jīng)過若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一細(xì)胞內(nèi)。第九張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性據(jù)此，革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|(zhì)粒：能在天然條件下自發(fā)地從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞（接合作用），如F質(zhì)粒。非接合型質(zhì)粒：不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用如Col、R質(zhì)粒的一些成員。值得注意的是，某些

7、非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個過程由 bom 和mob 基因決定。第十張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（4）攜帶特殊的遺傳標(biāo)記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性：抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物物質(zhì)合成：細(xì)菌毒素、有機(jī)堿這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義。第十一張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月3.幾種代表性質(zhì)粒F因子（fertility factor）：又稱致育因子或性因子，62106 Dalton，94.5 kb，相當(dāng)于核染色體DN

8、A大小的2%，環(huán)狀雙鏈DNA，足以編碼94個中等大小多肽，其中1/3基因（tra區(qū)）與接合作用有關(guān)。存在于腸細(xì)菌屬、假單胞菌屬、嗜血桿菌、奈瑟氏球菌、鏈球菌等細(xì)菌中，決定性別。Figure. Representative FERTILITY PLASMID. A fertility plasmid carries the genes for conjugation as well as a number of other genes. In this figure the fertility plasmid also carries antibiotic resistant genes.第十二

9、張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月最初發(fā)現(xiàn)于痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae），后來發(fā)現(xiàn)還存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。R因子由相連的兩個DNA片段組成，即抗性轉(zhuǎn)移因子（resistence transfor factor， RTF ）和抗性決定R因子（r-determinant）。RTF為分子量約為11106 Dalton，控制質(zhì)粒拷貝數(shù)及復(fù)制?？剐詻Q定因子大小不固定，從幾百萬到100106 Dalton以上，其上帶有抗生素的抗性基因。R因子在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)：從12個到幾十個，

10、分為嚴(yán)緊型和松弛型兩種，經(jīng)氯霉素處理后，松弛型質(zhì)?？蛇_(dá)20003000個/細(xì)胞。R因子（resistance factor）第十三張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月Col因子（colicinogenic factor）含有編碼大腸桿菌素因子的質(zhì)粒。大腸桿菌素是由E. coli的某些菌株所分泌的細(xì)菌素，能通過抑制復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯或能量代謝等專一地殺死其它腸道細(xì)菌，由Col因子編碼。Col因子可分為兩類，分別以ColE1和ColIb為代表。ColE1：分子量約為5106 Dalton，無接合作用，多拷貝； ColE1研究得很多，并被廣泛地用于重組DNA 的研究和用于體外復(fù)制系統(tǒng)上。ColI

11、b分子量約為80106 Dalton，與F因子相似，具有通過接合作用轉(zhuǎn)移的功能，屬于嚴(yán)緊型控制，只有12個拷貝。凡帶Col因子的菌株，由于質(zhì)粒本身編碼一種免疫蛋白，從而對大腸桿菌素有免疫作用，不受其傷害。第十四張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月只在假單胞菌屬中發(fā)現(xiàn)。它們的降解性質(zhì)?？梢跃幋a一系列能降解復(fù)雜物質(zhì)的酶，從而能利用一般細(xì)菌所難以分解的物質(zhì)作碳源。這些質(zhì)粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟腦）質(zhì)粒，XYL（二甲苯）質(zhì)粒，SAL（水楊酸）質(zhì)粒，MDL（扁桃酸）質(zhì)粒，NAP（萘）質(zhì)粒和TOL（甲苯）質(zhì)粒等。降解性質(zhì)粒近年來在Rhizobium（根瘤菌屬）中發(fā)現(xiàn)的一種質(zhì)粒，分

12、子量為200300106 Dalton，比一般質(zhì)粒大幾十倍到幾百倍，故稱巨大質(zhì)粒，其上有一系列固氮基因。巨大質(zhì)粒（mega質(zhì)粒）第十五張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月Ti質(zhì)粒（tumor inducing plasmid）誘癌質(zhì)粒存在于根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）中,可引起許多雙子葉植物的根癌。當(dāng)細(xì)菌侵入植物組織后，可以把細(xì)菌的DNA釋放到植物細(xì)胞中。這時，Ti質(zhì)粒的小片段與植物細(xì)胞中的核染色體發(fā)生整合，破壞控制細(xì)胞分裂的激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)，從而使它轉(zhuǎn)變成癌細(xì)胞。Ti質(zhì)粒大小約200 kb，是一個大型質(zhì)粒。當(dāng)前，Ti質(zhì)粒已成為植物遺傳工程研究中的重要載

13、體。一些具有重要性狀的外源基因可借DNA重組技術(shù)設(shè)法插入到Ti質(zhì)粒中，并進(jìn)一步使之整合到植物染色體上，以改變該植物的遺傳性，達(dá)到培育植物優(yōu)良品種的目的。第十六張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月4.質(zhì)粒的改造天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工改造。第十七張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月刪除不必要的DNA區(qū)域，縮小分子量，提高外源DNA片段的裝載量滅活質(zhì)粒上的某些編碼基因加入易于識別的選擇標(biāo)記基因選擇標(biāo)記基因內(nèi)引入內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)序列-多克隆接頭(Polylinker

14、)加入特殊的基因表達(dá)調(diào)控元件（1）質(zhì)粒改造的策略第十八張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）一個合格質(zhì)粒的組成要素復(fù)制起始位點(diǎn)Ori：控制復(fù)制起始的位點(diǎn)。原核生物DNA分子中只有一個復(fù)制起始點(diǎn)；而真核生物DNA分子有多個復(fù)制起始位點(diǎn)抗生素抗性基因：便于對目的基因的檢測，如Ampr、Kanr多克隆位點(diǎn)MCS：克隆攜帶外源基因的片段P/E（Promoter/Enhancer）：啟動子/增強(qiáng)子T（Terminator）：終止信號poly(A)加尾信號：穩(wěn)定mRNA第十九張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月5.質(zhì)粒的分類人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類： 高拷貝質(zhì)粒 突變拷

15、貝數(shù)控制基因，拷貝數(shù)1000-3000，擴(kuò)增基因低拷貝質(zhì)粒 來自pSC101，拷貝數(shù)小于10，表達(dá)某些毒性基因溫敏質(zhì)粒 在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)測序質(zhì)粒 含有測序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker整合質(zhì)粒 裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn)，便于外源基因的整合穿梭質(zhì)粒 裝有針對兩種不同受體的復(fù)制子，便于基因克隆表達(dá)質(zhì)粒 裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件探針質(zhì)粒 裝有報告基因，便于啟動子等元件的克隆篩選第二十張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十一張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月21第三章基因工程的載體和受體（5學(xué)時）6.如何閱讀質(zhì)粒圖譜第二十二張

16、，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月RBS：ribosome-binding site 原核RBS：SD sequence真核RBS：Kozak sequence 第二十三張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月7.重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制 （1）pBR322氯霉素可擴(kuò)增拷貝數(shù) 50-100/cell用于基因克隆 第二十四張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）pUC18/19拷貝數(shù)：2000-3000/cell用于基因克隆和測序 多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記 lacZ：E.coli lacZ基因的 5端序列，表達(dá)半乳糖苷酶的片段。LacZ的上游包括乳糖操縱子上的啟

17、動子Plac和操縱基因O。第二十五張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十六張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月pUC18/19的正選擇標(biāo)記 lacZ 的顯色原理pUC18/19PlaclacZMCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷 （IPTG）X-gal第二十七張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月藍(lán)白斑篩選pUC18/19質(zhì)粒上的LacZ基因包括一段-半乳糖苷酶的啟動子、編碼肽鏈的區(qū)段、一個多克隆位點(diǎn)(MCS)。MCS位于編碼肽鏈的區(qū)段中，是外源DNA的選擇性插入位點(diǎn)，但其本身不影響載體編碼肽鏈的功能活性。當(dāng)菌體中含有帶lacz的質(zhì)

18、粒后，質(zhì)粒lacz基因編碼的肽鏈和菌株基因組表達(dá)的N端缺陷的-半乳糖苷酶突變體互補(bǔ)，具有與完整-半乳糖苷酶相同的作用，使X-gal生成藍(lán)色物質(zhì)，這種現(xiàn)象即-互補(bǔ)。用這種質(zhì)粒進(jìn)行克隆時，如果外源基因破壞了LacZ的編碼序列，所產(chǎn)生的蛋白產(chǎn)物就會喪失-互補(bǔ)能力，在含有X-gal和IPTG的平板下形成無色菌斑，可用于重組子的篩選。第二十八張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月標(biāo)志補(bǔ)救（-半乳糖苷酶法）lacZAmprN2H片段COOH片段lacZ第二十九張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（LacZ基因序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因 N端序列LacZ酶第三十張，PPT共八十

19、九頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）pGEM-3Z多拷貝裝有兩個噬菌體的強(qiáng)啟動子，用于外源基因的高效表達(dá) 裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記 lacZ注意：T7和SP6啟動子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合酶所識別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等第三十一張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月8.質(zhì)粒DNA的分離純化實(shí)驗室一般使用下列三種方法制備質(zhì)粒DNA 氯化銫密度梯度離心法 質(zhì)粒DNA純度高；但周期長，設(shè)備要求高，存在溴乙錠污染。堿裂解法質(zhì)粒DNA純度低；優(yōu)點(diǎn)是快速、操作簡便。沸水浴法 質(zhì)粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和沸水浴

20、之間第三十二張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）氯化銫密度梯度離心法 用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 加CsCl和溴乙錠超速離心過夜在紫外燈下吸取cccDNA稀釋沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAsocDNA：開環(huán)DNAL-DNA：線狀DNA第三十三張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）堿裂解法 用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 加NaOH和SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物 加高濃度的醋酸鉀溶液，沉淀染色體，去除染色體DNA及大部分蛋白質(zhì) 離心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除蛋白質(zhì)乙醇或異丙

21、醇沉淀水相質(zhì)粒DNA用無DNase的RNase去除殘余的RNA cccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA第三十四張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月溶液I：調(diào)節(jié)pH，懸浮菌體，抑制DNase的活性溶液II：裂解細(xì)胞膜（主要是NaOH），臨用前配制，SDS是為沉淀染色體DNA作準(zhǔn)備溶液III：中和NaOH，促進(jìn)SDS沉淀蛋白質(zhì)和基因組DNA詳見/77/article/i8082-p2.html第三十五張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十六張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十七張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）沸水浴法用含有EDTA和Trit

22、on X-100的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 沸水浴40秒離心，用無菌牙簽挑去沉淀物 乙醇或異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA第三十八張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）噬菌體或病毒DNA噬菌體（phage）或病毒（virus）是一類非細(xì)胞微生物，能高效率、高特異性地侵染宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會相互轉(zhuǎn)化。噬菌體或病毒的上述特性使得其DNA能被開發(fā)成為基因工程的載體，因為：高效率的感染性能，使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞自主復(fù)制繁殖性能，使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增第三十九張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月1.

23、大腸桿菌的噬菌體DNA噬菌體是比細(xì)菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細(xì)胞一樣，噬菌體侵犯細(xì)菌，也可以認(rèn)為它是細(xì)菌里的“寄生蟲”。它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA，結(jié)構(gòu)上有一個蛋白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細(xì)菌內(nèi)。第四十張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月(1)噬菌體的生物學(xué)特性l噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體l噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成l-DNA全長48502個核苷酸l-DNA上至少有61個基因 生物結(jié)構(gòu)5 TCCAGCGGCGGGG33CCCGCCGCTGGA 5 COSCOS第四十一張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月感染周期E.coli吸

24、附LamB受體注入復(fù)制包裝裂解100個左右的拷貝體內(nèi) 包裝野生型l-DNA本身長度為48.5kb，包裝范圍為原DNA的75-105%，即36-51 kb。第四十二張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月溶原狀態(tài)l噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細(xì)胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種狀態(tài)稱為溶原狀態(tài)。整合主要由l-DNA上的cI和int兩個基因的產(chǎn)物所激活，而這兩個基因的開放與關(guān)閉又取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì)。人們可以根據(jù)需要改變l-DNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于溶原狀態(tài)，或處于溶菌狀態(tài)。DNA重組技術(shù)一般需要l噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)。第四十三

25、張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體從溶原轉(zhuǎn)為裂解是一種可誘導(dǎo)過程。 誘導(dǎo)的因素可能很多，實(shí)驗室常用的是熱誘導(dǎo):某些噬菌體，在低溫時（30）保持溶原狀態(tài)，在高溫（42）時進(jìn)入溶菌狀態(tài)。這些噬菌體的cl基因是溫度敏感突變型的，稱為c1ts。clts1857，可作為組件插入質(zhì)粒DNA內(nèi)。目的基因插在cl ts1857下游，重組體的目的基因在42表達(dá)，30不表達(dá)。這種方法稱為熱誘導(dǎo)表達(dá)，使用的是溫敏開關(guān)。第四十四張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）DNA載體的構(gòu)建野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時，才能被

26、包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此需要縮短野生型l-DNA的長度，才能提高裝載量。其實(shí)，野生型l-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解非必需的。在構(gòu)建載體時，這些片段可以刪除。根據(jù)切除的多少，可將l-DNA分成兩大類載體：插入型載體和取代型載體?？s短長度第四十五張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月插入型載體體外包裝插入位點(diǎn)體外包裝插入片段載體長度 37 kb插入片段大小0 - 14 kb通過特定的酶切位點(diǎn)允許外源 DNA 片段插入的載體稱為插入型載體（insertion vectors）。由于 噬菌體對所包裝的 DNA 有大小的限制，因此一般插入型載體設(shè)計為可插入 6 kb 長的外源

27、 DNA 片段，最大 14 kb 。第四十六張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月取代型載體：必須有外源基因片段的插入體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長度 10 kb（36-26） kb載體長度 26 kb插入片段最大裝載長度 25 kb（51-26） kb插入位點(diǎn)體外包裝第四十七張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)野生型的l-DNA鏈上有5個EcoRI位點(diǎn)和7個HindIII位點(diǎn)，不利于重組操作，必須刪除多余的酶切位點(diǎn)，每種限制酶只保留1 - 2個位點(diǎn)。同時，為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點(diǎn)。除了簡單的切割外，還需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)

28、去除或增添限制酶位點(diǎn)。第四十八張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月加裝選擇標(biāo)記與質(zhì)粒不同，野生型l-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝選擇標(biāo)記是l-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容。Imm434標(biāo)記imm434基因編碼一種阻止l-噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的l-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活， l-重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑。第四十九張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月lacZ標(biāo)記lacZ基因編碼b-半乳糖苷酶的片段，與b-半乳糖苷酶的片段互補(bǔ)，能催化無色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基

29、因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍(lán)色化合物，形成白色噬菌斑；而空載體l-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色噬菌斑。X-Gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷,是-半乳糖苷酶的顯色底物IPTG：異丙基-D-硫代半乳糖苷，半乳糖的類似物，是乳糖操縱子的誘導(dǎo)物。第五十張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月構(gòu)建琥珀密碼子的突變體 琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。構(gòu)建策略：將野生型l-DNA上D和E兩個頭部包裝蛋白基因序列中的CAG密碼子突變成UAG。當(dāng)這種l-DNA進(jìn)入一般的

30、大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散。基因工程實(shí)驗中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株。 第五十一張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）-DNA載體的主要類型：插入滅活型載體： lgt10、lgt11取代型載體：lEMBL4、Charon40第五十二張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（4）DNA重組分子的體外包裝l-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞。用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了l噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為互補(bǔ)的兩部

31、分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組l-DNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行。任何一種蛋白包裝液被重組l-DNA污染，均不能產(chǎn)生有感染力的噬菌體顆粒，這是基于安全考慮而設(shè)計的。第五十三張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（5）DNA及其重組分子的分離純化將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。加入噬菌體或重組噬菌體的懸浮液，37培養(yǎng)1小時。用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4 -12小時。這時噬菌體顆粒密度可達(dá)1013 -1014/L，而大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解。超速離心，沉淀噬菌體 。苯酚抽提，釋放-DNA。 乙醇或異丙醇沉淀-DNA。 第五

32、十四張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（6）-DNA作為載體的特點(diǎn)l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌。l-DNA載體的裝載能力可達(dá)25 kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量。重組l-DNA分子的篩選較為方便。重組l-DNA分子的提取較為簡便。l-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá)外源基因。第五十五張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2.大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNA（1）M13噬菌體的生物學(xué)特性M13噬菌體的外型呈絲狀M13 噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成 M13 DNA全長6407個核苷酸M13 DNA上至少有10個基因2700個外殼蛋白分子

33、M13 噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長 正鏈DNA第五十六張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）M13 DNA載體的構(gòu)建III VI I IV II X V VII IX VIII野生型M13 RF-DNAIII VI I IV II X V VII IX VIIIM13 mp系列載體lacZpolylinker復(fù)制DNA(replication form DNA，RF DNA) 第五十七張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）M13 DNA載體的特點(diǎn)使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)胞外（因為M13噬菌體只包裝正鏈），這在DNA定向突變中非常有用。M13重組分

34、子篩選簡便：被M13噬菌體感染的受體細(xì)胞生長緩慢，形成混濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大。但是，M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5 kb。第五十八張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月動植物細(xì)胞作為受體細(xì)胞時，一般選擇相應(yīng)動植物的病毒基因組DNA作為載體。動植物病毒種類繁多，每一種動植物都有多種特異性的病毒。按照基因組的結(jié)構(gòu)，可將動植物病毒分成四大類： 單鏈DNA病毒雙鏈DNA病毒單鏈RNA病毒雙鏈RNA病毒RNA病毒在自我復(fù)制時大多存在相應(yīng)的DNA中間反應(yīng)物，這些中間體可作為載體用于DNA重組實(shí)驗。3. 病毒DNA載體第五十九張，PPT共八十九頁

35、，創(chuàng)作于2022年6月（三）考斯質(zhì)粒(cosmid) 與噬菌粒(phagemid)l-DNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25 kb和1.5 kb。但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提高噬菌體DNA的裝載量。在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體DNA的長度，就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體DNA上與包裝有關(guān)的序列和質(zhì)粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長度，同時又能保證重組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這便是構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路。注意：考斯質(zhì)粒和噬菌粒不攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細(xì)胞

36、內(nèi)不能形成噬菌體顆粒。第六十張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月1.考斯質(zhì)粒（cosmid）（1）考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有l(wèi)-DNA cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的載體。1978年Collins和Hohn發(fā)明構(gòu)建pHC796400 bpTcrl fragmentcosoriAmprPstIBamHISalIcos site-carrying plasmid1.8 kb的l-DNA片段 + pBR322片段裝載范圍為30 - 45 kbpHC79第六十一張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）考斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)能像l-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體

37、細(xì)胞 裝載量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范圍能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡便，篩選容易不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞第六十二張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2.噬菌粒（phagemid or phasmid）（1）噬菌粒載體的特點(diǎn)噬菌粒是一類人工構(gòu)建的含有單鏈?zhǔn)删w的包裝序列、復(fù)制子以及質(zhì)粒的復(fù)制子、克隆位點(diǎn)、標(biāo)記基因的特殊類型的載體。能像M13-DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 裝載量比常規(guī)的M13 mp系列載體要大很多（10 kb）能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡便，篩選容易通過克隆雙鏈DNA能獲得同等長度的單鏈DNA第六十三張，PPT共八十

38、九頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）重要的噬菌粒載體pUC118：pUC18 + M13間隔區(qū) IGpUC119：pUC19 + M13間隔區(qū) IG500 個拷貝3200 bpMCSlacZlacIoriAmprM13-IGpUC118 / 119表示M13輔助噬菌體：為噬菌粒提供基因II產(chǎn)物和包裝蛋白，使其能夠合成單鏈DNA。 pUC118 / 119第六十四張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月pBluescript：體外轉(zhuǎn)錄載體pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT72958 bpMCSlacZPT7oriAmprf1-oripBluescriptPT

39、3噬菌體啟動子PT3和PT7強(qiáng)化外源基因的轉(zhuǎn)錄。提取出來的單鏈DNA重組分子，在噬菌體RNA聚合酶的存在下，可實(shí)現(xiàn)外源基因的體外轉(zhuǎn)錄。f1-ori：線狀噬菌體復(fù)制起始區(qū)第六十五張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）人造染色體載體人類、動物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚至上千 kb 的DNA片段， 此時考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要。將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。目前常用的人造染

40、色體載體包括：細(xì)菌人造染色體（BAC）酵母人造染色體（YAC）第六十六張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月1.細(xì)菌人造染色體Bacterial Artificial Chromosome，BAC細(xì)菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的。裝載量：50 kb - 300 kb拷貝數(shù)：各種類型的BAC在大腸桿菌受體菌中只能維持單一拷貝。BAC主要適用于： 克隆大型基因簇（gene cluster） 構(gòu)建動植物基因文庫（gene library）第六十七張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2.酵母人造染色體 Yeast Artificial Chromosome (YAC)

41、（1）酵母人造染色體的組成pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAmprTRP1ARS1兩個來自嗜熱四膜蟲的末端重復(fù)序列(TEL)：保持重組YAC為線狀結(jié)構(gòu)酵母染色體的著絲粒序列 (centromere4,CEN4)酵母選擇標(biāo)記：URA3、TRP1大腸桿菌的復(fù)制子：ori大腸桿菌的選擇標(biāo)記：AmprYAC載體的裝載量為350 kb-400 kb酵母染色體的復(fù)制子 (autonomously replicatingsequence，ARS) 克隆位點(diǎn)：EcoRI。該位點(diǎn)位于酵母菌Sup4 tRNA基因內(nèi)。Sup4 基因編碼產(chǎn)物抑制赭色表型 (成為白色)。如果用不含外源D

42、NA片段的pYAC4載體轉(zhuǎn)化酵母菌，轉(zhuǎn)化子的菌落呈白色。而帶有插入的外源DNA片段的pYAC4重組載體，其Sup4已經(jīng)失活，結(jié)果轉(zhuǎn)化酵母菌后所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子形成赭色菌落。這種插入失活選擇標(biāo)記的應(yīng)用，大大簡化了陽性克隆工作。第六十八張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）酵母人造染色體的使用pYAC4CENEcoRIURATELBamHITELoriAprTRPARSEcoRIEcoRIEcoRIBamHI連接轉(zhuǎn)化酵母菌重組酵母染色體在利用pYAC4載體克隆DNA片段時，要將pYAC4載體線性化，分離純化帶有染色體末端序列的兩個臂，同時分離純化大分子DNA片段，連接后用于轉(zhuǎn)化酵母菌感受態(tài)細(xì)

43、胞。 Target DNA第六十九張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第七十張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 二、用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞各種基因工程受體的特性實(shí)驗室常用的基因工程受體受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件第七十一張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月作為基因工程的受體細(xì)胞，應(yīng)利于外源DNA的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時又要有較好的安全性。野生型的大腸桿菌并不是理想的受體細(xì)胞，因其自身具有限制和修飾系統(tǒng)，對未經(jīng)甲基化處理的外源DNA分子有一定的降解作用，導(dǎo)致外源DNA的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低下。此外，野生型大腸桿菌對其他生物種群可能存在潛在的致病性。因此必須通過適當(dāng)?shù)恼T變手段對野生型大腸桿菌

44、進(jìn)行遺傳性狀改造，以獲得適宜作為受體細(xì)胞的突變菌株。第七十二張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件限制性缺陷型：外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（hsdR-）重組整合缺陷型：用于基因擴(kuò)增或高效表達(dá)的受體細(xì)胞（recA-， recB-，recC- ） 具有較高的轉(zhuǎn)化效率具有與載體選擇標(biāo)記互補(bǔ)的表型感染寄生缺陷型：防止重組細(xì)菌擴(kuò)散污染（生物武器除外）。 第七十三張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月限制與修飾系統(tǒng)限制與修飾系統(tǒng)是維持野生型細(xì)菌種屬特異性的保護(hù)系統(tǒng)，其限制與修飾作用分別由限制性核酸內(nèi)切酶和修飾甲基化酶來完成。當(dāng)外源DNA分子進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部時，限制系統(tǒng)產(chǎn)生限制

45、作用，將來自不同生物的外源DNA分子或重組DNA分子降解破壞。而對于自身DNA分子則由修飾系統(tǒng)加以甲基化修飾，免于限制系統(tǒng)的限制作用。這是導(dǎo)致外源重組DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低下的主要原因之一。應(yīng)選用限制系統(tǒng)缺陷型的突變菌株作為受體細(xì)胞，以提高外源DNA分子的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。大腸桿菌的限制系統(tǒng)主要由hsdR基因控制，因此具有hsdR-遺傳表型的大腸桿菌菌株均喪失了降解外源DNA的能力，大大增加了外源DNA的可轉(zhuǎn)化性，轉(zhuǎn)化效率可提高1000倍左右。若進(jìn)一步使修飾系統(tǒng)也發(fā)生缺陷，則受體菌細(xì)胞既不能修飾，也不能限制外源DNA分子，更便于重組DNA分子的多種基因操作。 第七十四張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于

46、2022年6月重組系統(tǒng)在野生型細(xì)菌中，進(jìn)入細(xì)胞的外源DNA分子能自發(fā)地與染色體DNA發(fā)生體內(nèi)同源重組反應(yīng)，該重組反應(yīng)由rec基因家族的編碼產(chǎn)物所控制。其中RecA是一個單鏈蛋白，在同源重組過程中起著不可替代的作用，它能促進(jìn)DNA分子之間的同源聯(lián)會和DNA單鏈交換，recA基因的突變使大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的遺傳重組頻率降低至10-6。同樣,recB、recC和recD基因的突變也可以降低遺傳重組的發(fā)生頻率。因此受體細(xì)胞必須選擇體內(nèi)同源重組缺陷型的遺傳表型，其相應(yīng)的基因型為recA-、recB-或recC-等，有些大腸桿菌突變體菌株則將三個基因同時失活。第七十五張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月

47、易于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)可以利用遺傳誘變技術(shù)改變受體菌細(xì)胞壁的通透性及細(xì)胞膜的特異吸附性，從而提高其轉(zhuǎn)化效率。如大腸桿菌膜蛋白Lama就是噬菌體的特異性吸附受體。另外，還可以選擇能夠誘導(dǎo)形成感受態(tài)細(xì)胞的菌株作為受體菌，這樣做能大大提高外源DNA分子的轉(zhuǎn)化效率。第七十六張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月有明顯的選擇性差異遺傳表型差異大，可便于重組子的檢測。通常是使受體細(xì)胞呈現(xiàn)與載體所攜帶的選擇標(biāo)記互補(bǔ)的遺傳性狀。例如，在大腸桿菌系統(tǒng)中，重組質(zhì)粒載體上多含有氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因，則所選用的受體細(xì)胞應(yīng)對這種抗生素敏感。當(dāng)重組DNA分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞后，載體上的標(biāo)記基因賦予受體細(xì)胞抗生素的抗性特征，據(jù)此可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子。如果受體細(xì)胞具有與外源基因表達(dá)產(chǎn)物活性互補(bǔ)的遺傳特征，可以直接篩選到外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，如藍(lán)白斑篩選。第七十七張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月感染寄生缺陷型相當(dāng)多的細(xì)菌對其他生物（尤其是人和牲畜）具有感染和寄生效應(yīng)，重