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文檔簡介
1、實驗一 植物葉綠素含量的測定(分光光度法)(張憲政,1992)一、原理根據(jù)葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收,利用分光光度計在某一特定波長測定其吸光 度,即可用公式計算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯一比爾定律,某有色溶液的吸光度 A與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比,即A = aCL式中:a比例常數(shù)。當溶液濃度以百 分濃度為單位,液層厚度為1cm時,a為該物質(zhì)的吸光系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長 下的吸光系數(shù)可通過測定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù) 種吸光物質(zhì),則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應波長下吸光度的總和。 這就是吸光度的加和性。今欲測定葉綠
2、體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量, 只需測定該提取液在三個特定波長下的吸光度A ,并根據(jù)葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長 下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。在測定葉綠素a、b時為了排除類胡蘿卜素的干擾,所用單色 光的波長選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。高等植物中葉綠素有兩種:葉綠素a和b ,兩 者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。葉綠素a和葉綠素b的比值反映植物對光能利用效率 的大小,比值高則大,則反之。二、材料、儀器設備及試劑試劑:1 ) 95%乙醇(或80%丙酮)三、實驗步驟稱取剪碎的新鮮樣品0.20.3g,加乙醇10ml,提取直至無綠色為止。把葉綠體色素提 取液倒入光徑1cm的比
3、色杯內(nèi),以95%乙醇為空白,在波長663nm和645nm下測定吸光 度。四、實驗結(jié)果按計算丙酮法(Arnon法)【可以用于丙酮乙醇混合法和80%丙酮提取法的計算】葉綠素a的含量(mg/g )葉綠素b的含量(mg/g)葉綠素a、b的總含量(mg/g)=(12.71 xOD663 - 2.59xOD645)V/1000*W =(22.88OD645 - 4.67OD663) V/1000*W =(8.04xOD663 +20.29xOD645) V/1000*W按Inskeep公式葉綠素 a 的含量(mg/g)=( 12.63xOD663 - 2.52xOD645)V/1000*W葉綠素 b 的含
4、量(mg/g)=(20.47OD645 - 4.73OD663) V/1000*W葉綠素 a、b 的總含量(mg/g)=(7.90 xOD663 + 17.95xOD645) V/1000*W注:1、葉綠素a和葉綠素b的比值反映植物對光能利用率【1】 比如陽生植物葉綠素a和葉綠素b的比值較大【2】陰生植物葉綠素a和葉綠素b的比值較小2、丙酮熔點:-94C ;沸點:56.48C ;是一種無色透明液體,有特殊的辛辣氣味 易溶于水和甲醇、乙醇、乙醚、氧仿、毗啶等有機溶劑.下一步實驗方法比較【1】95%乙醇直接提取(4)【2】95%乙醇加熱提?。T瑞云,1985 )【3】無水酒精和80%丙酮等體積混合
5、提取實驗二、不良環(huán)境對植物細胞膜的傷害(張憲政,1992)一、原理植物組織在受到各種不利的環(huán)境條件(如干旱、低溫、高溫、鹽漬和大氣污染)危害時, 細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能首先受到傷害,細胞膜透性增大。若將受傷害的組織浸入無離子水中, 其外滲液中電解質(zhì)的含量比正常組織外滲液中含量增加,組織受傷害越嚴重,電解質(zhì)含量增加越多。用電導儀測定外滲液電導率的變化,可反映出質(zhì)膜受傷害的程度。在電解質(zhì)外滲透 的同時,細胞內(nèi)可溶性有機物也隨之滲出,引起外滲液可溶性糖、氨基酸、核苷酸等含量增 加,氨基酸和核苷酸對紫外光有吸收,對紫外分光光度計測定受傷害組織外滲液消光值,同 樣可反映出質(zhì)膜受傷害的程度。用電導儀法和紫外法
6、測定結(jié)果有很好的一致性。二、方法步驟1、取樣及處理采用電導法(張憲政,1992):將選取的幼嫩葉片和成熟葉片剪下,包在密封袋內(nèi)置于冰盒 中帶回實驗室。將新鮮的葉樣先用自來水輕輕沖洗葉片,除去表面沾污物,再用去離子水沖 洗12次,用濾紙輕輕吸干葉片表面水分,稱0.2 0.3 g并剪成切段,放入50 mL帶塞試管 中,加入20 mL去離子H2O,浸沒樣品45 h ,各處理浸泡時間和測定溫度一致,在室溫下 進行,用DDs 11型電導儀測其電導率,然后沸水浴15 min,冷卻至室溫再測一次總電導率 值。以相對電導率表示細胞質(zhì)膜透性大小。2、計算:植物組織浸泡的電導率,特稱外滲電導率,此測定方法稱外滲電
7、導率法。(1 )外滲電導率K( us/cm*g) =SQ=測定電導率/稱取質(zhì)量或 K( us/cm*g*ml) =SQ=定電導率/稱取質(zhì)量*量取體積(2)相對電解質(zhì)滲出率.電解質(zhì)滲出率(% ) = L1 (浸泡液電導率)/ L2(煮沸后電導率)x100電解質(zhì)滲出率(%)= L1(浸泡液電導率)-本底電導率/ L2 (煮沸后電導率)-本底電導率x100 式中:L1 :組織殺死前外滲液的電導值;L2組織殺死后外滲液的電導值。注:1、事先測定水的電導率2、用吸水紙吸干探頭的水分實驗三植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的測定、目的在逆境條件下(旱、熱、冷、凍),植物體內(nèi)脯氨酸的含量顯著增加,植物體內(nèi)脯氨酸含 量在
8、一定程度上反映了植物的抗逆性,抗旱性強的品種積累的脯氨酸多。因此測定脯氨酸含 量可以作為抗旱育種的生理指標。另外,由于脯氨酸親水性極強,能穩(wěn)定原生質(zhì)膠體及組織 內(nèi)的代謝過程,因而能降低冰點,有防止細胞脫水的作用。在低溫條件下,植物組織中脯氨 酸增加,可提高植物的抗寒性,因此,亦可作為抗寒育種的生理指標。二、原理磺基水楊酸對脯氨酸有特定反應,當用磺基水楊酸提取植物樣品時,脯氨酸便游離于磺 基水楊酸溶液中。然后用酸性茚三酮加熱處理后,茚三酮與脯氨酸反應,生成穩(wěn)定的紅色化 合物,再用甲苯處理,則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中,色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低。在 520nm波長下測定吸光度,即可從標準曲線上查
9、出脯氨酸的含量。三、材料、儀器及試劑試劑及配制:(1 ) 2.5%酸性茚三酮溶液配制:將1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol-L-i磷 酸中(原液稀釋2.3倍),攪拌加熱(70。)溶解,貯于4C冰箱中,2-3日有效。(2 ) 3%磺基水楊酸配配制:3.496g磺基水楊酸加蒸餾水溶解后定容至100ml。(3 ) 10pg-ml-1脯氨酸標準母液配制:精確稱取20mg脯氨酸,倒入小燒杯內(nèi),用少量 蒸餾水溶解,再倒入200ml容量瓶中,加蒸餾水定容至刻度(為100pg-ml- 1脯氨酸母液), 再吸取該溶液10ml ,加蒸餾水稀釋定容至100ml ,即為10pg-ml-1脯氨酸標準
10、液。四、實驗步驟1、脯氨酸標準曲線的制作1.1取6支試管,編號,按下表配制每管含量為0 12歸的脯氨酸標準液。加入表中試 劑后,置于沸水浴中加熱30min。取出冷卻。以去離子水溶液為空白對照,在520mm波長 處測定吸光度(A )值。管 號試劑01234510g-ml-1脯氨酸標準液(ml )00.20.40.60.81.0蒸餾水(ml )21.81.61.41.21.0冰醋酸(ml)2222223%磺基水楊酸2222222.5%酸性茚三酮(ml )444444每管脯氨酸含量(pg )02468101.3標準曲線的繪制以1 5號管脯氨酸含量為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制標準曲線。樣品的測定2
11、.1脯氨酸的提取稱取0.2 0.3g葉片于20ml試管+ 10ml 3%磺基水楊酸溶液t沸水浴10min(提取過程 中要經(jīng)常搖動)t冷卻過濾于干凈的試管中t脯氨酸提取液。2.2測定吸取酶提取液2ml + 2ml H2O + 2ml冰醋酸+ 4ml 2.5%酸性茚三酮t沸水浴30minT溶液 呈紅色t冷卻t取上層液于比色杯520mm處測定吸光度(A )值。五、計算結(jié)果從標準曲線上查出樣品測定液中脯氨酸的含量,按下公式計算樣品中脯氨酸含量:Xx提取液總量(ml)脯氨酸含量(pg g - iFw )=樣品鮮重(g )x測定時提取液用量(ml)公式中:x -從標準曲線中查得的脯氨酸含量(pg)實驗四植
12、物體內(nèi)丙二醛含量的測定一、原理丙二醛(MDA )是由于植物官衰老或在逆境條件下受傷害,其組織或器官膜脂質(zhì)發(fā)生過 氧化反應而產(chǎn)生的。它的含量與植物衰老及逆境傷害有密切關系。測定植物體內(nèi)丙二醛含量, 通常利用硫代巴比妥酸(TBA )在酸性條件下加熱與組織中的丙二醛產(chǎn)生顯色反應,生成紅棕色 的三甲川(3、5、5-三甲基惡唑2、4-二酮),三甲川最大的吸收波長在532nm。但是測 定植物組織中MDA時受多種物質(zhì)的干擾,其中最主要的是可溶性糖,糖與硫代巴比妥酸顯 色反應產(chǎn)物的最大吸收波長在450nm處,在532nm處也有吸收。植物遭受干旱、高溫、低 溫等逆境脅迫時可溶性糖增加,因此測定植物組織中丙二醛與
13、硫代巴比妥酸反應產(chǎn)物含量時 一定要排除可溶性糖的干擾。此外在532nm波長處尚有非特異的背景吸收的影響也要加以排 除。低濃度的鐵離子能顯著增加硫代巴比妥酸與蔗糖或丙二醛顯色反應物在532、450nm處 的吸光度值,所以在蔗糖、丙二醛與硫代巴比妥酸顯色反應中需要有一定的鐵離子,通常植 物組織中鐵離子的含量為100 - 300pg-g - 1Dw ,根據(jù)植物樣品量和提取液的體積,加入Fe3 +的終濃度為0.5nmolL - 1。在532nm、600nm和450nm波長處測定吸光度值,即可計 算出丙二醛含量。二、實驗步驟(1 )提取采用硫代巴比妥酸顯色法(趙世杰等,2002 )b稱取0.2 0.3
14、g樣品,加10%三氯乙酸2 mL 和少量石英砂,研磨至勻漿,再加8ml三氯乙酸進一步研磨,勻漿后4000 rpm,離心10min。(2)顯色取上清液5 mL,加0.6% TBA 5 mL,混合后在100C水浴上煮沸30 min,迅速在冰浴上 冷卻后再離心一次。分別測定上清液在450nm、532 nm和600 nm處的吸光度值,方法一:MDA質(zhì)量摩爾濃度(nmol/g)=( A532-A600)xVZxV1/(0.155xWxV2)式中:VZ:反應液總量(4 mL) ;V1:提取液體積(10 mL);V2:測定用用提取液量(2 mL) ; W:取樣葉鮮重(g)0.155:為MDA的消光系數(shù)(nm
15、ol/l )方法二:方程組:A450= ( 85.4x10 - 3 )C 糖(A532 - A600 ) = ( 155x10 - 3 )CMDA+ ( 7.4x10 - 3 )C 糖解得:A450C 糖=11.71A450 ( mmol-L - 1 )85.4x10 - 3CMDA= 6.45 ( A532 - A600 )- 0.56A450 (pmol-L - 1 )公式中:A450-在 450nm波長下測得的吸光度值A532在 532nm波長下測得的吸光度值A600在 600nm波長下測得的吸光度值 1.55x105為摩爾比吸收系數(shù)C糖、CMDA分別是反應混合液中可溶性糖、MDA的濃度
16、。按下式計算提取液中MDA濃度反應液體積(ml )CMDA *1000提取液中MDA濃度(pmolml - 1 )=測定時提取液用量(ml)2.按下式計算樣品中MDA含量提取液中MDA濃度(pmolml - 1 )x提取液總量(ml )MDA 含量(pmol.g - 1 Fw )=植物組織鮮重(g)試劑:1、10%三氯乙酸:稱取三氯乙酸55.5556g加水溶解定容至500ml2、0.6%硫代巴比妥酸(用10%三氯乙酸配制):稱0.6707g TBA用少量1mol/L氫氧化鈉溶解后加10%TCA溶解定容至100ml ( 4C貯存)實驗五、SOD活力測定(NBT還原法)植物葉片在衰老過程中發(fā)生一系
17、列生理生化變化,如核酸和蛋白質(zhì)含量下降、葉綠素降 解、光合作用降低及內(nèi)源激素平衡失調(diào)等。這些指標在一定程度上反映衰老過程的變化。近 來大量研究表明,植物在逆境脅迫或衰老過程中,細胞內(nèi)自由基代謝平衡被破壞而有利于自 由基的產(chǎn)生。過剩自由基的毒害之一是引發(fā)或加劇膜脂過氧化作用,造成細胞膜系統(tǒng)的損傷, 嚴重時會導致植物細胞死亡。自由基是具有未配對價電子的原子或原子團。生物體內(nèi)產(chǎn)生的 自由基主要有超氧自由基(O2 -X羥自由基(OH. X過氧自由基(ROD X烷氧自由基(RO ) 等。植物細胞膜有酶促和非酶促兩類過氧化物防御系統(tǒng),超氧化物歧化酶(SOD X過氧化 氫酶(CAT X過氧化物酶(POD )
18、和抗壞血酸過氧化物酶(ASA-POD )等是酶促防御系統(tǒng) 的重要保護酶??箟难幔╒C X VE和還原型谷胱甘肽(GSH )等是非酶促防御系統(tǒng)中的重 要抗氧化劑。SOD、CAT等活性氧清除劑的含量水平和O2 -、H2O2、OH.和O2等活性 氧的含量水平可作為植物衰老的生理生化指標。超氧自由基(O2.-)是生物細胞某些生理生化反應常見的中間產(chǎn)物。自由基是本身帶 有不成對價電子的分子、原子、原子團或離子,化學性質(zhì)非?;顫?,是活性氧的一種。如果 細胞中缺乏清除自由基的酶時,機體就會受到各種損傷。超氧化物歧化酶( Superoxide Dismutase ),簡稱SOD ,能通過歧化反應清除生物細胞
19、中的超氧自由基(O2.-),生成H2O2 和O2。H2O2由過氧化氫酶(CAT )催化生成H2O和O2,從而減少自由基對有機體的毒害。一、原理超氧物歧化酶(superoxidedismutase , SOD )普遍存在于動、植物體內(nèi),是一種清除超 氧陰離子自由基的酶。本實驗依據(jù)超氧物歧化酶抑制氮藍四唑(NBT )在光下的還原作用來 確定酶活性大小。在有氧化物質(zhì)存在下,核黃素可被光還原,被還原的核黃素在有氧條件下 極易再氧化而產(chǎn)生O2-,可將氮藍四唑還原為藍色的甲蹤,后者在560nm處有最大吸收。而 SOD可清除O2-,從而抑制了甲蹤的形成。于是光還原反應后,反應液藍色愈深,說明酶活 性愈低,反
20、之酶活性愈高。據(jù)此可以計算出酶活性大小。二、試劑(一)試劑(1 ) 0.2 mol/L pH7.8 磷酸鈉(Na2HPO4-NaH2PO4 )緩沖液:A演 0.2 mol/L NaH2PO4溶液)準確稱取 NaH2PO4 2H2O ( MW=156.01 )15.715g于50mL小燒杯中,用少量蒸餾水溶解后,移入500mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度,充 分混勻。4C冰箱中保存?zhèn)溆?。B 演 0.2 mol/L Na2HPO4 溶液):準確稱取 Na2HPO4 - 12H2O( MW=358.14 )71.63g 于100mL小燒杯中,用少量蒸餾水溶解后,移入1000mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻
21、度, 充分混勻。4C冰箱中保存?zhèn)溆?。取上述A液34mL與B液366mL充分混勻后即為0.2mol/L pH7.8的磷酸鈉緩沖液。 4C冰箱中保存?zhèn)溆谩?2 ) 0.05 mol/L pH7.8磷酸鈉緩沖液取0.2 mol/L pH7.8的磷酸鈉緩沖液250mL,移入1000 mL容量瓶中用蒸餾水定容至 刻度,充分混勻。4C冰箱中保存?zhèn)溆谩?3 ) 130mmol/L蛋氨酸(Met)磷酸鈉緩沖液準確稱取L-蛋氨酸(C5H11NO2S , MW=149.21 ) 0.9699g于小燒杯中,用少量0.05 mol/L pH7.8的磷酸鈉緩沖液溶解后,移入50mL容量瓶中并用0.05 mol/L pH
22、7.8的磷酸鈉 緩沖液定容至刻度,充分混勻(現(xiàn)用現(xiàn)配)。【溶于水,3.3g/100ml 25C,不溶于有機溶劑】 4C保存可用1 2d.(4 )750p mol/L氮藍四唑溶液:稱取0.03066g NBT用磷酸緩沖液定容至50ml ,避光4C 保存,先用現(xiàn)配.(5 ) 100p mol/L EDTA - Na2 溶液:稱取 0.03721g EDTA - Na2 用水定容至 1000ml【稱 取7.442 g EDTA - Na2用水定容至200ml ,吸取1ml用水定容1000ml】(6)20p mol/L核黃素溶液:稱取0.0753g核黃素用蒸餾水定容至1000ml避光保存【稱取 1.8
23、825g核黃素用少量NaOH溶解并用蒸餾水定容至25ml吸取1ml用水定容1000ml】4C 保存810天。三、實驗步驟酶液提取取植物葉片0.2g 0.3g于預冷的研缽中,加2ml預冷的0.05 mol/L pH7.8磷酸緩沖液 在冰浴上研磨成漿,加緩沖液使終體積為10ml。于4000rpm下離心15min,上清液即為SOD 粗提液。2.顯色反應取試管3支,1支為測定管,另2支為對照管,按下列加入一依次加入各溶液:名稱樣品管對照管1對照管250mmol/L磷酸緩沖液(ml)5.05.05.0130mmol/L Met 溶液(ml)0.30.30.3750p mol/L NBT 溶液(ml)0.
24、30.30.3100|j mol/L EDTA - Na2 液(ml)1.01.01.0去離子水(ml )2.02.02.020 “mol/L 核黃素(ml)0.30.30.30.3 (酶液)0.3 (緩沖液)0.3 (緩沖液)混勻后將1支對照管置暗處,其它各管于4000Lx日光下反應20min,然后立即遮光,以 遮光管為對照調(diào)零,于560nm下測定光密度。(要求各管受光情況一致,溫度高時間縮短, 低時延長)。3.SOD活性測定與計算至反應結(jié)束后,以不照光的對照管做空白,分別測定其它各管的吸光度。四、結(jié)果計算已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位表示,按下式計算SOD
25、活性。SOD 總活性=(Ack - AE)XV/(AckX0.5XWXVt)=(Ack - AE)/(AckX 0.015 XW)SOD比活力=SOD總活性/蛋白質(zhì)含量上式中:SOD總活性以每克鮮重酶單位表示;SOD比活力:單位以酶單位/ mg蛋白表示Ack :照光對照管的吸光度AE :樣品管的吸光度V :樣品液總體積(ml)Vt測定時樣品用量(ml)實驗六、過氧化物酶活性測定一、試驗目的:過氧化物酶是植物體內(nèi)普遍存在的活性較高的一種酶,他與呼吸作用、光合作用以及生 長素的氧化等都有密切關系。在植物生長發(fā)育過程中他的活性不斷發(fā)生變化,因此測量這種 酶,可以反映某一時期植物體內(nèi)代謝的變化。通過本
26、實驗了解過氧化物酶的作用,掌握常用 的測定過氧化物酶的方法愈創(chuàng)木酚法。二、實驗原理:在過氧化物酶催化下,雙氧水將愈創(chuàng)木酚氧化成茶褐色產(chǎn)物,此產(chǎn)物在泌70 nm處有最 大吸收峰,故可以通過測其吸光度的變化測定過氧化物酶的活性。三、實驗試劑1、0.05 mol/L PH 7.0的磷酸緩沖液:0.2M A 液(Na2HPO4 ) 61ml 和 0.2M B 液(NaH2PO4 ) 39ml 混合 100ml,用去離 子水定容400ml2、0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚溶液:取0.6207g定容100ml1%愈創(chuàng)木酚溶液:吸取1毫升愈創(chuàng)木酚,加入少量95%酒精溶解,用水定容100ml , 放于棕色試劑瓶
27、中保存?zhèn)溆?、2%雙氧水溶液:取30% H2O2 10ml用去離子水定容150ml4、反應混合液取50mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)30mL,2%過氧化氫10mL,1%愈創(chuàng)木酚10mL混合。四、操作步驟1 .酶液提?。呵逑锤蓛羧~片擦干,稱取0.2 0.3 g葉片,剪成小片,放入研缽加入適量 10%PVPP (除去酚類物質(zhì)X石英沙、及2ml 50mmol的PH 7.0()的磷酸緩沖液PBS (0.02-0.1mmol )進行研磨,磨碎后在加入8mlPBS溶液洗滌研缽一并裝入離心管內(nèi),4。 下4000rmin-1離心15min,收集上清液4C保存?zhèn)溆?。顯色反應類別對照管樣品管反應液3.0 m
28、L溫度25P緩沖液0.5 mL酶液0.5 mL測定波長470nm五、計算過氧化物酶活性(OD470/(min.g) = (A470 xVT )/( WxVSx0.01xt)式中:A470為反應時間內(nèi)吸光度的變化,W為葉片鮮重g , t為反應時間min , Vt為提取酶液總體積ml , Vs為測定時取用的酶液體積ml。實驗19植物組織中可溶性蛋白質(zhì)含量的測定I考馬斯亮藍G -250染色法、原理考馬斯亮藍G- 250 ( Coomassie brilliant blue , G-250 )法是利用蛋白質(zhì)-染料 結(jié)合的原理,定量地測定微量蛋白質(zhì)濃度的快速、靈敏的方法??捡R斯亮藍G-250存在著兩種不
29、同的顏色形式,紅色和藍色。它和蛋白質(zhì)通過范德瓦 爾鍵結(jié)合,在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi),蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律。此染料與蛋白質(zhì)結(jié) 合后顏色由紅色形式轉(zhuǎn)變成藍色形式,最大光吸收由465 nm變成595 nm,通過測定595 nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。蛋白質(zhì)和染料結(jié)合是一個很快的過程,約2 min即可反應完全,呈現(xiàn)最大光吸收,并可 穩(wěn)定1 h,之后,蛋白質(zhì)-染料復合物發(fā)生聚合并沉淀出來。此法靈敏度高(比Lowry法靈 敏4倍),易于操作,干擾物質(zhì)少,是一種比較好的定量法。其缺點是在蛋白質(zhì)含量很高時 線性偏低,且不同來源蛋白質(zhì)與色素結(jié)合狀況有一定差異。二、實驗材料、試劑與儀器設備(
30、一)試劑標準蛋白質(zhì)溶液(100四g/mL牛血清白蛋白):稱取牛血清蛋白25 mg,加水溶解 并定容至100 mL,吸取上述溶液40 mL,用蒸餾水稀釋至100 mL即可??捡R斯亮藍試劑:稱取100 mg考馬斯亮藍G-250,溶于50 mL 90 %乙醇中, 加入100 mL 85%( W/V )的磷酸,再用蒸餾水定容到1000 mL,貯于棕色瓶中。常溫下 可保存一個月。三、實驗步驟標準曲線的繪制取6支試管,按表26-1加入試劑,搖勻,向各管中加入5 mL考馬斯亮藍試劑,搖 勻,并放置5 min左右,以0號試管為空白對照,在595 nm下比色測定吸光度。以蛋白 質(zhì)含量為橫坐標,以吸光度為縱坐標繪
31、制標準曲線。試劑管號012345標準蛋白質(zhì)(mL )00.200.400.60.801.0蒸餾水量(mL )1.00.800.600.40.200蛋白質(zhì)含量(pg )020406080100樣品測定(1 )樣品提取稱取鮮樣0.25 - 0.5 g,用5 mL蒸餾水或緩沖液研磨成勻漿后, 3000 r/min離心10 min,上清液備用。(2 )吸取樣品提取液0.3 mL (視蛋白質(zhì)含量適當稀釋),放入試管中(每個樣品重 復2次),加入5 mL考馬斯亮藍試劑,搖勻,放置2 min后在595 nm下比色,測定吸 光度,并通過標準曲線查得蛋白質(zhì)含量。四、結(jié)果計算廣樣品中蛋白質(zhì)的含量=一匚叫處X吼xl
32、OOO(mg/g )式中:c查標準曲線值,四。V T提取液總體積,mL。W F 樣品鮮重,g。V S測定時加樣量,mL。注意點:1,考馬斯亮藍G-250所配溶液不穩(wěn)定,所以每次實驗都必須新配,且必須新做標準曲線;2,考馬斯亮藍G-250配制完畢,如果發(fā)現(xiàn)溶液中有絮狀沉淀,可以試用濾紙過濾后使用,如果實驗中發(fā)現(xiàn)使用過濾后的考馬斯亮藍G-250溶液在與樣品接觸后短時間內(nèi)便又發(fā)生絮 凝,基本上推測該考馬斯亮藍G-250過期(比較容易出現(xiàn))。實驗七、過氧化氫酶的活性測定一一高錳酸鉀滴定法【原理】過氧化氫酶(CAT )屬于血紅蛋白酶,含有鐵,它能催化過氧化氫分解為水和分子氧, 在此過程中起傳遞電子的作用
33、,過氧化氫則既是氧化劑又是還原劑。據(jù)此,可根據(jù)H2O2的消耗量或02的生成量測定該酶活力大小。在反應系統(tǒng)中加入一定 量(反應過量)的H2O2溶液,經(jīng)酶促反應后,用標準高錳酸鉀溶液(在酸性條件下)滴定多 余的h2o25H O +2KMnO +4H SO 50 +2KHS0 +8H 0+2MnS02 24242424即可求出消耗的h2o2的量?!驹噭俊?】3M H2SO4 :吸取濃硫酸80ml用去離子水定容至500ml【2】0.2mol/L磷酸緩沖液pH7.0 ;【3】0.1mol/L高錳酸鉀標準液:稱取KMnO4( AR)16 g,用新煮沸冷卻蒸餾水配制成 1000ml,用0.1mol/L草酸
34、溶液標定;0.1mol/L H2O2 :市售 30% H202 大約等于 17.6mol/L,取 30% H202 溶液 4.87ml,稀釋 至500ml,用標準0.1mol/ KMnO4溶液(在酸性條件下)進行標定;【實驗步驟】1、酶液提取 取葉片0.2 0.3g加入2ml pH7.0的磷酸緩沖液少量研磨成勻漿,在加緩 沖液定容轉(zhuǎn)移至10ml后轉(zhuǎn)入離心管中,4000rpm離心15min,上清液即為過氧化氫酶的粗 提液。2.滴定反應管號對照管樣品管粗酶液(ml)0.20.23mol/L H2SO4 (ml)50PH 7.0磷酸緩沖液1.81.80.1mol/L H2O2 (ml)55條件加入H
35、2O2立即計時于35P恒溫水浴中保溫3min3mol/L H2SO4 (ml)05用0.1mol/L KMnO4標準溶液滴定H2O2,至出現(xiàn)粉紅色(在30min內(nèi)不消失)為終點所用KMnO4體積(ml)AB【結(jié)果計算】:酶活性用每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示:(A - B) x * x 1.7FW x V1 x t酶活(mgH2O2/gFW-min)=式中 A一對照KMnO4滴定毫升數(shù);B一酶反應后KMnO4滴定毫升數(shù);VT一酶液總量(ml );V一反應所用酶液量(ml );W樣品鮮重(g );1.71ml 0.1mol/L的 KMnO4相當于 1.7mg H2O2。過氧化氫酶
36、的活性測定紫外吸收法、原理H2O2在240nm波長下有強烈吸收過氧化氫酶能分解過氧化氫使反應溶液吸光度(A240) 隨反應時間而降低。根據(jù)測量吸光率的變化速度即可測出過氧化氫酶的活性。二、實驗步驟1、酶液提取 取葉片0.20.3g加入2ml pH7.0的磷酸緩沖液少量研磨成勻漿,在加緩 沖液定容轉(zhuǎn)移至10ml后轉(zhuǎn)入離心管中,4000rpm離心15min,上清液即為過氧化氫酶的粗 提液。4。下保存?zhèn)溆?。測定:取10ml試管3支,其中1號為樣品測定管,1號為空白管,按表40-2順序加 入試劑。表40-2紫外吸收法測定H2O2樣品液配置表管號樣品管對照管粗酶液(ml)0.2(煮死酶液)0.2pH7.
37、0 磷酸(ml)1.51.5蒸餾水(ml)1.01.025。預熱后,逐管加入0.5ml 0.1mol/L的H2O2,每加完一管立即記時,并迅速倒入石 英比色杯中,240nm下測定吸光度,每隔1min讀數(shù)1次,共測4min,待3支管全部測定完 后,按下式計算酶活性。3.結(jié)果計算:以1min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個酶活單位(u )。過氧化氫酶活性(u/gFW/min)=(41 +4 2)2式中 A A240 一 AS0 -AS0-加入煮死酶液的對照管吸光值;AS1, AS2樣品管吸光值;Vt粗酶提取液總體積(ml );V1測定用粗酶液體積(ml);FW樣品鮮重(g );0.1A240每下降0.1為1個酶活單位(u );t加過氧化氫到最后一次讀數(shù)時間(min )。高錳酸鉀滴定液的配制和標定.高錳酸鉀滴定液(0.1mol / L )的配制市售高錳酸鉀常含有少量MnO2等雜質(zhì),蒸餾水也常有微量的灰塵,溶液在配制初期不 夠穩(wěn)定,濃度常降低,因此高錳酸鉀溶液不能用直接法配制,所以先配制成近似所需的濃度?!?】方法:稱取稍多于理論用
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