地黃中水蘇糖的提取與分離實驗(共5頁)

1、學院 2014 實驗報告PAGE PAGE 8地黃中水蘇(shu s)糖的提取與分離實驗一、前言(qin yn)水蘇(shu s)糖是天然存在的一種四糖，是一種可以顯著促進雙歧桿菌等有益菌增殖的功能性低聚糖，不被人體消化酶完全水解，熱量為1.5-2.4 kcal/g。因而可進入結腸，并被腸道細菌酵解利用。有對腸道有益菌如雙歧桿菌、乳桿菌有特異性的增殖作用，具有抗便秘和腹瀉的雙重作用，有防齲齒的功能，可通過調節(jié)腸道pH值促進人體對鈣、鐵的吸收等特性1。根據水蘇糖的理化和生物學特點，其應用十分廣泛，在食品、藥品、化妝品、飼料、釀酒、工業(yè)添加劑等領域都有廣泛應用。水蘇糖的生產方法有天然提取法和酶法兩

2、種，酶法生產水蘇糖是最近發(fā)展起來的方法，目前尚處于實驗室階段。天然提取法是目前水蘇糖工業(yè)化生產中常用的方法，經過研究和工業(yè)化試點，該方法已經逐步成熟2。地黃中梓醇含量、還原糖和多糖的含量均為鮮品高于干品4，本次實驗通過三種不同方法對熟地黃中水蘇糖進行提取，比較水提取法、超聲波提取法和微波提取法之間的區(qū)別，再通過乙醇沉淀、大孔樹脂吸附過濾等方法純化，以得到較純的水蘇糖。并通過HPLC-RID4高效液相色譜-示差折光檢測器對樣品中水蘇糖進行檢測，通過分析數據比較得出不同提取方法之間效率區(qū)別兵。 二、材料及方法1.材料實驗材料市售熟地黃（塊狀），每組50-100g，共1 kg。D101大孔樹脂500

3、g。試劑1）乙醇 4 L ； 實驗用品（以下為每組用品，每組4人）1）50mL離心管 8個； 2）50mL離心管架 1個3）1mL 取液器 1只； 4）1mL 替補頭 1盒；5）1000mL燒杯 1個； 6）200-250mL 燒杯 1個；7）20cm玻璃棒 1個； 8）記號筆 1個9）50 mL 量筒； 共用實驗用品：1）稱量用天平 2臺； 2）離心管平衡用臺秤 2個；3）8-9cm布氏漏斗 5只； 4）封口膜 1卷； 5）8-9cm濾紙 4盒； 6）剪刀 3把；7）層析柱（10mm 40cm） 5只； 8）氨基C18柱；9）0.22um水性(shuxng)濾膜（5cm） 1盒； 10）計時

4、鬧鐘(nozhng) 4個；11）1000mL試劑瓶 1個； 12）5mL 離心管 3包；13）標簽(bioqin)紙，若干； 14）100mL量筒 2個；15）蒸餾水 1桶； 16）手套 2包；17）1000mL量筒 1個； 18）500mL量筒 1個；19）抽濾用緩沖瓶 5只（與布氏漏斗配套）2. XXXXX。指某項具體的研究方法（如XXX微生物培養(yǎng)、PCR、蛋白質純化、酶活性測定、蛋白質的含量測定、C/N比對植物花芽分化的影響、pH對YYY酶活性的影響等）。3. YYYYYY。同上。4.液相色譜。同上。此處所給出的實驗技術中僅指具體的、主要的操作過程，不必寫實驗原理。也可以給出實驗的注意

5、事項。2. 水蘇糖的提取與濃縮-高溫水煮法每組稱取10g混勻后的地黃樣品，置于250mL三角瓶中，加入提取液（蒸餾水）120mL，浸泡1h，然后置于100條件下煎煮1.0h，簡單封口以保濕，期間不斷攪拌（注意達到預定溫度時的液面高度，以便適當補充水分以保持水分總量）。加熱結束的溶液待放涼后，用雙層濾紙進行過濾，濾液于旋轉蒸發(fā)儀濃縮至原體積的約1/10，之后上述濃縮液于12000g離心15 min，迅速取出并保存好上清液（棄沉淀），該樣品中不得含有任何可見顆粒狀雜質，標清樣品號。3. 水蘇糖提取液的乙醇沉淀每組各取上述上清液（濃縮的提取液）6mL 2管，冰浴30min或以上，之后加入24mL冷乙

6、醇，靜置1-2h或過夜，然后10000g離心15min，迅速倒掉上清液（棄），保存好沉淀，沉淀顏色呈黑色。然后在兩管中各用純乙醇約10mL將上述沉淀懸浮。相同條件下離心后，迅速倒出上清液（棄），保存好沉淀。之后沉淀于40-45干燥、恒重后，稱重0.111mg。稱重后溶解于12mL的去離子水中后用于液相色譜檢測。4、水蘇糖的大孔樹脂吸附純化1）大孔樹脂柱的安裝：取內徑10mm、高度30-40cm層析柱洗凈后（實際柱高=22cm，體積=17.27mL），垂直架設，在其下部裝入1/4-1/3的去離子水，然后將去離子水浸泡、清洗后的大孔樹脂均勻倒入層析柱內，不少于25cm，用去離子水沖洗（平衡）。流速

7、約10滴/min（0.5%柱體積/min）。2）進樣與沖洗：柱子平衡后，使柱內液面降至與樹脂面平，然后加入5mL的上述濃縮的提取液，液面下降至與樹脂面平時，進樣結束，然后加入5倍柱體積的去離子水進行沖洗層析柱（此過程稱之為洗脫），收集5倍柱體積的洗脫液后，洗脫結束。洗脫液體積86( Y ) mL。上述洗脫液中，于每個柱體積取一個樣，用于液相色譜檢測。5. 高效液相色譜檢測水蘇糖層析柱：氨基(nj)色譜柱，250*4.6監(jiān) 測：RID。流 速：1ml/min。收 集：2%柱體積(tj)/管（約2-3mL/管）或者(huzh)見峰收集。流動相：乙腈/純水 7/3，使用前需過0.22m濾膜過濾。需配

8、制1 L。樣 品：1）最初提取液；2）乙醇沉淀后所得的樣品；3）大孔樹脂吸附純化后所得洗脫液樣品。三、結果及分析1.實驗結果（2-12-7為本組結果）理論上水蘇糖樣品的峰應在17min左右出現。備注：標品1的濃度為11mg/ml;標品001的濃度為34mg/ml。不同圖的縱坐標不一致。1-1樣品峰分離不明顯。1-2樣品峰分離效果顯著1-3 沒有峰1-4 樣品峰未分開2-1 沒有峰2-2 沒有峰2-3 沒有峰2-4未分開2-5 沒有峰2-6 樣品峰分離較好2-7未分開3-1未分開(fn ki)3-2 沒有(mi yu)峰3-3沒有(mi yu)峰4-14-2 沒有峰4-3 沒有峰5-15-2 峰

9、值為負。5-3 峰未分開標樣 峰未分開標樣 不明顯。 分析：1）指本次結果與理論上或原設想是否相符；2）本次結果同其他相關研究結果的異同。2.結果分析從實驗結果可知，大部分峰都為分開，只有1-2,2-6兩組樣品結果較理想。因1-2組屬于30min水煮，對比1h水煮處理，所得水蘇糖濃度更高，提取效果更好。 根據文獻記載，超聲波和微波更容易破壞細胞結構，故提取效果應比水提取法更高。當然也有可能是因為沒有摸索到超聲波和微波提取法適合的條件，未達到最佳提取條件。 又因大部分樣品未出峰，表明提取液中水蘇糖純度不夠高。判斷可能是在過濾膜純化時，水蘇糖損失量過多，離心純化可能有更好結果，3.思考題1）文獻中

10、提供的地黃中有哪些糖類？答：地黃中包含(bohn)的糖類有多糖、小分子(fnz)總糖、葡萄糖、蔗糖、棉籽糖、水蘇糖等5 ，。2）在本實驗結果的基礎上以及理論課所學知識，你認為(rnwi)可以用何種方法或技術能夠獲得水蘇糖的純品？答：對樣品溶解后進行活性炭脫色7處理并離心除有色雜質，然后用葡聚糖色譜分離或用生物膜分離的方法去除其他單糖或低聚糖雜質，得到水蘇糖的純品。3）根據生物統(tǒng)計學的知識，要考察提取溫度、提取溶劑/物料比、提取次數、材料粒度等四因素對可溶性多糖提取的影響，如何進行實驗設計？答：實驗有四個變量，9指9列,3是三水平,4是四因素，設計一個L9(34)正交試驗，將所有人分成多個組，各

11、組采用不同的提取溫度、提取溶劑/物料比、提取次數、材料粒度進行可溶性多糖提取，保持后續(xù)操作一致。 四、結論 30min水煮，對比1h水煮處理，所得水蘇糖濃度更高，效果更好。在提取過程中應注意避免水蘇糖的損失謹慎操作，以及注意標準樣問題防止出現不良樣品。參考文獻1任宏強.水蘇糖J.精細與專用化學品,2003,11(14):15-17.DOI:10.3969/j.issn.1008-1100.2003.14.006.2尤新.我國低聚糖生產技術研究進展J.食品工業(yè)科技,2002,(4):4-7.DOI:10.3969/j.issn.1002-0306.2002.04.001.3梁蔚陽,馮煒菁.高效液相色譜-示差折光檢測法測定注射用轉化糖中果糖與葡萄糖的含量J.中國生化藥物雜志,2007,28(2):116-117.DOI:10.3969/j.issn.1005-1678.2007.02.014.4李計萍,馬華,王躍生等.鮮地黃與干地黃中梓醇、糖類成分含量的比較J.中國藥學雜志,2001,36(5):300-302.DOI:10.3321/j.issn:1001-2494.2001.05.004.5梁麗心.水蘇糖的提取及初步精制工藝的研究J.中國食品添加劑,2005,(6):25-28.DOI:10.3969/j.issn.1006-2513.20