Illumina 、454 、ABI 測序儀比較

1、Illumina、454、ABI測序儀比較Illumina測序儀Illumina公司的新一代測序儀GenomeAnalyzer最早由Solexa公司研發(fā)，利用其專利核心技術(shù)DNA簇”和可逆性末端終結(jié)（reversibleterminator）”，實現(xiàn)自動化樣本制備及基因組數(shù)百萬個堿基大規(guī)模平行測序。lllumina公司于2007年花費6億美金的巨資收購了Solexa,就是為了促成GenomeAnalyzer的商品化。GenomeAnalyzer作為新一代測序技術(shù)平臺，具有高準(zhǔn)確性，高通量，高靈敏度，和低運行成本等突出優(yōu)勢，可以同時完成傳統(tǒng)基因組學(xué)研究（測序和注釋）以及功能基因組學(xué)（基因表達(dá)及調(diào)

2、控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。GenomeAnalyzer自上市以來，已經(jīng)為千人基因組計劃立下了赫赫戰(zhàn)功。今年早期，荷蘭科學(xué)家利用它首次繪出女性的基因組圖譜。而就在前兩周，Nature雜志上一連出現(xiàn)三個人類基因組圖譜：炎黃一號-第一個亞洲人圖譜；第一個癌癥病人圖譜；第一個非洲人圖譜。它們?nèi)且蕾嘒enomeAnalyzer完成的。嘩，一下就來仨！這和第一個人類基因組圖譜的13年形成了多么鮮明的對照。根據(jù)去年底的數(shù)據(jù)，GenomeAnalyzer已售出約200臺，估計是市場占有率最廣的。前不久，華大基因再添置了12臺，準(zhǔn)備放在香港和深圳的實驗室，至此華大基因已經(jīng)有29臺GenomeAn

3、alyzer。而著名的麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)Broad研究院擁有47臺Illumina測序儀。眾多實驗室之所以選擇川umina，看中的無疑是GenomeAnalyzer的高性價比。上個月，Illumina將GenomeAnalyzerII升級到GenomeAnalyzerllx，距年底實現(xiàn)單次運行獲得95GB數(shù)據(jù)的宏偉目標(biāo)又近了-步。GenomeAnalyzerIIx有兩個核心特征：其一是更大的試劑冷卻器，支持超過100個測序循環(huán)，進(jìn)一步提升了系統(tǒng)的易用性和自動化；其二是全新的流動池支架，讓每輪運行所得的高質(zhì)量數(shù)據(jù)增加20%。依靠系統(tǒng)軟件和試劑的改進(jìn)，GenomeAnalyzerIIx現(xiàn)在能夠

4、支持100bp以上的配對末端讀長，并在每次運行中產(chǎn)生超過20GB的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。GenomeAnalyzer技術(shù)的基本原理：1.文庫制備將基因組DNA打成幾百個堿基(或更短)的小片段，在片段的兩個末端加上接頭(adapter)。2.產(chǎn)生DNA簇利用專利的芯片，其表面連接有一層單鏈引物，DNA片段變成單鏈后通過與芯片表面的引物堿基互補(bǔ)被一端“固定”在芯片上。另外一端(5或3)隨機(jī)和附近的另外一個引物互補(bǔ)，也被“固定”住，形成“橋(bridge)“。反復(fù)30輪擴(kuò)增，每個單分子得到了1000倍擴(kuò)增，成為單克隆DNA簇。DNA簇產(chǎn)生之后，擴(kuò)增子被線性化，測序引物隨后雜交在目標(biāo)區(qū)域一側(cè)的通用序列上。m00

5、D:Dla0生晦iatrde.ccKnII3.測序GenomeAnalyzer系統(tǒng)應(yīng)用了邊合成邊測序(SequencingBySynthesis)的原理。加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP。這些核苷酸是可逆終止子”，因為3羥基末端帶有可化學(xué)切割的部分，它只容許每個循環(huán)摻入單個堿基。此時，用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類。之后，將這些基團(tuán)化學(xué)切割，恢復(fù)3端粘性，繼續(xù)聚合第二個核苷酸。如此繼續(xù)下去，直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。這樣，統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號結(jié)果，就可以得知每個模板DNA片段的序列。目前的配對末端讀長可達(dá)到2x50bp，

6、更長的讀長也能實現(xiàn)，但錯誤率會增高。讀長會受到多個引起信號衰減的因素所影響，如熒光標(biāo)記的不完全切割。3-aAaCA.hTCA由逛妄-Surface-CTCCT1.FLI-dATP-(bloekei)十FL2旳GTP-鬧址*訓(xùn))*FL3dCTP-(bl&d+FU-dTTP-jblck&r)2.FllEdrsiienG&im自自in雷詁four亡hiiiln召令2ChemrMElycleavelabelsant4.數(shù)據(jù)分析自動讀取堿基，數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)移到自動分析通道進(jìn)行二次分析。GenomeAnalyzer系統(tǒng)之所以如此暢銷，關(guān)鍵在于其技術(shù)上的優(yōu)勢?？蓴U(kuò)展的超高通量GenomeAnalyzer系統(tǒng)目前每

7、次運行后可獲得超過20GB的高品質(zhì)過濾數(shù)據(jù)。這個技術(shù)的可擴(kuò)展性保證了更高的數(shù)據(jù)密度和輸出，能用更少的經(jīng)費完成更復(fù)雜的項目。到今年底，通量還有望上升到95GB,相當(dāng)于人類基因組的30倍覆蓋度。需要樣品量少GenomeAnalyzer系統(tǒng)需要的樣品量低至100ng，能應(yīng)用在很多樣品有限的實驗（比如免疫沉淀、顯微切割等）中。這也是很多研究人員所考慮的因素。簡單、快速、自動化GenomeAnalyzer系統(tǒng)提供了最簡單和簡潔的工作流程。即使是最小的實驗室也能像大型基因組中心一樣進(jìn)行大規(guī)模的實驗。制備樣品文庫可以在幾小時內(nèi)完成，一個星期內(nèi)就能得到高精確度的數(shù)據(jù)。ClusterStation可以說是Gen

8、omeAnalyzer的核心。由獨立軟件控制的自動生成DNA簇的過程可以在5小時之內(nèi)（30分鐘手工操作）完成。這個自動化的流程不需要進(jìn)行EmulsionPCR，減少了手工操作誤差和污染可能性，也不需要機(jī)器人操作或潔凈室?？焖俚膶嶒灹鞒淌笹enomeAnalyzer的能力增至最大，而自動化步移降低了項目的時間和費用。新穎的測序化學(xué)技術(shù)GenomeAnalyzer通過合成測序來支持大規(guī)模并行測序。利用新穎的可逆熒光標(biāo)記終止子，可以在DNA鏈延伸的過程中檢測單個堿基摻入。由于四個可逆終止子dNTP在每個測序循環(huán)都存在，自然的競爭減少了摻入的誤差。單個或配對末端支持GenomeAnalyzer系統(tǒng)支持

9、單個片段或配對末端文庫。文庫構(gòu)建過程簡單，減少了樣品分離和制備的時間。制備基因組DNA的單個片段或配對末端文庫需要6個小時，只有3個小時需要手工操作。2x50個堿基或更長的讀長增加了比對基因組的能力，并拓展了在其他方面的應(yīng)用。然而，精明的用戶更看重的是性價比，這也是他們選擇lllumina的重要原因。川umina的售價約為45萬美元，低于454GSFLX的50萬和SOLiD系統(tǒng)的59萬（以上皆為美國的售價）。此外，運行成本也是一個關(guān)鍵因素。美國鳳凰城翻譯基因組學(xué)研究院（TGen）的主管DavidDuggan曾表示，當(dāng)年購買新一代測序儀時，每次運行的費用就成為他下決定的主要因素。他最終選擇了ll

10、luminaGenomeAnalyzer,因為每輪的運行費用為3000-4000美元（2007年的數(shù)據(jù)），較為合理，而其他測序儀可能更高。當(dāng)然，他也綜合考慮了通量、運行時間和樣品量。弗吉尼亞聯(lián)邦大學(xué)的高原（音譯）博士認(rèn)為：“GenomeAnalyzer的操作費用、易用性和可擴(kuò)展性讓我實現(xiàn)了大規(guī)?；蚪M實驗?，F(xiàn)在，我的小型實驗室正在進(jìn)行過去只能在大型基因組中心才能完成的實驗。低樣品需求、簡單的流程、高質(zhì)量的數(shù)據(jù)以及應(yīng)用靈活性讓IlluminaGenomeAnalyzer從其他高通量測序技術(shù)中脫穎而出?！盧OCH-454測序儀454公司可謂新一代測序技術(shù)的奠基人。2005年底，454公司推出了革命

11、性的基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統(tǒng)GenomeSequencer20System,被Nature雜志以里程碑事件報道，開創(chuàng)了邊合成邊測序(sequencing-by-synthesis)的先河。之后,454公司被羅氏診斷公司以1.55億美元收購。一年后，他們又推出了性能更優(yōu)的第二代基因組測序系統(tǒng)GenomeSequencerFLXSystem(GSFLX)。去年10月，全新的GSFLXTitanium系列試劑和軟件的補(bǔ)充，讓GSFLX的通量一下子提高了5倍，準(zhǔn)確性、讀長也進(jìn)一步提升。想當(dāng)年，GS20的出現(xiàn)，揭開了測序歷史上嶄新的一頁。JonathanRothberg博士就是大規(guī)模并行

12、測序的發(fā)明者，同時也是454的創(chuàng)始人。上世紀(jì)90年代，很多學(xué)者也都想到了大規(guī)模并行測序，他們試圖將Sanger測序移到芯片上，但都以失敗告終，因為這項技術(shù)沒有可擴(kuò)展性。1999年，Rothberg的兒子出世，他放了兩個星期的陪產(chǎn)假。小家伙出生后被送入嬰兒特護(hù)病房，Rothberg非常擔(dān)心，甚至想獲取兒子的基因組信息。這段擔(dān)驚受怕的經(jīng)歷給了他靈感，他突然意識到焦磷酸測序(pyrosequencing)不僅簡單，而且具有可擴(kuò)展性。兩個星期之后，Rothberg就開始設(shè)計芯片和流動室，讓測序在更小的反應(yīng)室中進(jìn)行，并同時進(jìn)行幾百萬個反應(yīng)。硬件的設(shè)計和制造也只是成功的一半，在樣品制備上還有同樣漫長的路要

13、走。Rothberg摒棄了傳統(tǒng)的細(xì)菌克隆與挑選，將DNA打斷成隨機(jī)片段，并尋找一種方法來克隆每個片段。受到其他學(xué)者乳液實驗的啟發(fā)，他也想將DNA放入油包水的乳液中，這樣就省去了反應(yīng)管。一個好漢三個幫。在JoelBader等人的幫助下，Rothberg驗證了這些想法的可行性，并利用了炸藥中的表面活性劑來維持乳液的熱穩(wěn)定性。就這樣，乳液PCR終于誕生了。之后，454生命科學(xué)公司用新一代測序儀對DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)明者JamesWatson進(jìn)行了基因組測序。第一份個人基因組圖譜的繪制只用了兩年時間，花費不到100萬美元。雖然現(xiàn)在看來這并不算什么，但就當(dāng)時而言，它相對于人類基因組計劃已是質(zhì)的飛躍。GS

14、FLX系統(tǒng)的工作流程GSFLX系統(tǒng)的流程概括起來，就是“一個片段=一個磁珠=一條讀長（Onefragment=Onebead=Oneread）”。1）樣品輸入并片段化:GSFLX系統(tǒng)支持各種不同來源的樣品，包括基因組DNA、PCR產(chǎn)物、BAC、cDNA、小分子RNA等等。大的樣品例如基因組DNA或者BAC等被打斷成300800bp的片段；對于小分子的非編碼RNA或者PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，這一步則不需要。短的PCR產(chǎn)物則可以直接跳到步驟3）。2）文庫制備：借助一系列標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，將A和B接頭（3和5端具有特異性）連接到DNA片段上。接頭也將用于后續(xù)的純化，擴(kuò)增和測序步驟。具有A、B接頭的單鏈D

15、NA片段組成了樣品文庫。3）一個DNA片段二一個磁珠：單鏈DNA文庫被固定在特別設(shè)計的DNA捕獲磁珠上。每一個磁珠攜帶了一個獨特的單鏈DNA片段。磁珠結(jié)合的文庫被擴(kuò)增試劑乳化，形成油包水的混合物，這樣就形成了只包含一個磁珠和一個獨特片段的微反應(yīng)器。4）乳液PCR擴(kuò)增：每個獨特的片段在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨立的擴(kuò)增，而沒有其他的競爭性或者污染性序列的影響。整個片段文庫的擴(kuò)增平行進(jìn)行。對于每一個片段而言，擴(kuò)增后產(chǎn)生了幾百萬個相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴(kuò)增的片段仍然結(jié)合在磁珠上。5）個磁珠二一條讀長：攜帶DNA的捕獲磁珠隨后放入PTP板中進(jìn)行后繼的測序。PTP孔的直徑（29um）只能容納一

16、個磁珠（20um）。然后將PTP板放置在GSFLX中，測序開始。放置在四個單獨的試劑瓶里的四種堿基，依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進(jìn)入PTP板，每次只進(jìn)入一個堿基。如果發(fā)生堿基配對，就會釋放一個焦磷酸。這個焦磷酸在ATP硫酸化酶和螢光素酶的作用下，經(jīng)過一個合成反應(yīng)和一個化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，最終將螢光素氧化成氧化螢光素，同時釋放出光信號。此反應(yīng)釋放出的光信號實時被儀器配置的高靈敏度CCD捕獲到。有一個堿基和測序模板進(jìn)行配對，就會捕獲到一分子的光信號；由此一一對應(yīng)，就可以準(zhǔn)確、快速地確定待測模板的堿基序列。這也就是大名鼎鼎的焦磷酸測序。6）數(shù)據(jù)分析：GSFLX系統(tǒng)在10小時的運行當(dāng)中可獲得100多萬個

17、讀長，讀取超過4-6億個堿基信息。GSFLX系統(tǒng)提供兩種不同的生物信息學(xué)工具對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，適用于不同的應(yīng)用：達(dá)400MB的從頭拼接和任何大小基因組的重測序。GSFLX系統(tǒng)的準(zhǔn)確率在99%以上。其主要限制來自同聚物，也就是相同堿基的連續(xù)摻入，如AAA或GGG。由于沒有終止元件來阻止單個循環(huán)的連續(xù)摻入，同聚物的長度就需要從信號強(qiáng)度中推斷出來。這個過程就可能產(chǎn)生誤差。因此，454測序平臺的主要錯誤類型是插入-缺失，而不是替換。新升級讓性能全面提升去年底發(fā)布的Titanium系列試劑，是對現(xiàn)有GSFLX平臺的重要升級。升級內(nèi)容包含耗材、試劑和軟件。你無需對儀器的硬件做任何昂貴的升級，只改進(jìn)試劑和

18、軟件，就能立刻實現(xiàn)性能提升。升級之后，每輪測序能產(chǎn)生100萬個讀長片段，高質(zhì)量（Q20）的讀長增加至400bp。第400個堿基的準(zhǔn)確率是99%，之前的更高。通量也提高了5倍，目前每輪運行能獲得4-6億個堿基對，所需時間為10小時。PTP平板的創(chuàng)新重設(shè)計重新設(shè)計之后，PTP平板上孔的密度更高，利用更小的DNA捕獲磁珠進(jìn)行金屬覆蓋，改善了信號質(zhì)量，因此讀長的數(shù)量和長度都明顯改善，同時準(zhǔn)確性更高。目前孔的直徑是29um，DNA捕獲磁珠的大小是20um。改進(jìn)的測序試劑改進(jìn)的GSFLXTitanium試劑顯著降低了背景噪音，因此在幾乎相同的運行時間內(nèi)，讀長更加長。升級的軟件優(yōu)化用于超高通量測序的軟件，能

19、輕松對更大、更復(fù)雜的基因組進(jìn)行拼接和作圖。GSFLX2.0版它與以前版本的輸出數(shù)據(jù)也完全兼容，讓片段能夠共同拼接和作圖。廣闊的應(yīng)用天地在新一代測序技術(shù)中，GS系統(tǒng)是最多產(chǎn)的。截至2008年9月，已經(jīng)發(fā)表了250多篇高質(zhì)量的paper。其中Nature20篇、Scienee13篇、Cell6篇、GenomeResearch20篇、PNAS24篇。光是這些數(shù)據(jù)就讓人咂舌。這些研究跨越了測序應(yīng)用的多個方面：82篇全基因組測序論文包括比較基因組學(xué)的從頭測序和重測序；54篇小分子RNA研究；37篇聚焦快速興起的宏基因組學(xué)；27篇關(guān)于轉(zhuǎn)錄組圖譜分析，包括全轉(zhuǎn)錄組拼接和表達(dá)圖譜；13篇研究染色體結(jié)構(gòu)和表觀遺

20、傳學(xué)；10篇有關(guān)稀有變異檢測的超深度測序這個新領(lǐng)域；11篇研究古老RNA。其余的文章關(guān)注454測序系統(tǒng)的技術(shù)和生物信息學(xué)。多種多樣的應(yīng)用彰顯出454測序系統(tǒng)的能力，那些傳統(tǒng)意義上無法用測序來解決的問題現(xiàn)在也一并解決了。454測序系統(tǒng)除了為多項研究領(lǐng)域開辟了基因組分析之路，同時也加速了探索的步伐。一般來說，研究、分析、撰寫并提交論文，經(jīng)同行評議后發(fā)表，需要一年左右的時間。而利用GenomeSequencer系統(tǒng)發(fā)表論文的速度，顯然表明454測序結(jié)果的數(shù)據(jù)質(zhì)量高，且分析簡單。超長讀長與易用的分析工具相結(jié)合，讓研究人員能更集中精力于科學(xué)研究，而不是研究測序過程中的某個技術(shù)細(xì)節(jié)。這樣研究項目能快速完成

21、，接著踏上新的研究道路。與其他新一代測序平臺相比，454平臺的突出優(yōu)勢是讀長。目前GSFLX系統(tǒng)的序列讀長已超過400bp。雖然454平臺的測序成本比其他平臺要高很多，不過對于那些需要長讀長的應(yīng)用，如從頭拼接和宏基因組學(xué)，它仍是最理想的選擇。去年底，美國加利福尼亞大學(xué)的研究小組利用全新的GSFLXTitanium系列試劑對海洋樣品的宏基因組進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)了一種全新的藍(lán)藻物種，文章發(fā)表在11月14日的Scienee雜志上。這項研究是系統(tǒng)升級后發(fā)表的首篇文章。首席研究員JonathanZehr對于獲得數(shù)據(jù)及分析結(jié)果的速度非常震驚。他表示：多年來我們一直試圖培養(yǎng)這種微生物，但都沒有成功。有了GSFL

22、XTitanium，我們在幾天之內(nèi)就通過單次測序運行，從環(huán)境樣品直接獲得了寶貴的基因組信息。這個系統(tǒng)超長的讀長對于我們從復(fù)雜的微生物群體中鑒定并分析這種獨特的細(xì)菌基因組來說非常關(guān)鍵?！弊罱?，在454測序平臺的協(xié)助下，研究人員完成了油棕櫚的全基因組測序、拼接和注釋。油棕櫚是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，它的基因組很大，達(dá)17GB。基因組的測序工作是由GSFLXTitanium系統(tǒng)完成的，拼接和分析則是由馬來西亞一家生物信息學(xué)公司完成的。值得注意的是，這是史上第一次在沒有添加傳統(tǒng)Sanger測序數(shù)據(jù)的情況下，完成了對大且非常復(fù)雜的植物基因組進(jìn)行從頭拼接。這種快速經(jīng)濟(jì)的方法為了解多種經(jīng)濟(jì)作物的遺傳結(jié)構(gòu)打開了大

23、門。此外，羅氏旗下的另一家公司NimbleGen正在全球性地捕獲定向重測序市場。NimbleGen序列捕獲芯片與454的測序儀結(jié)合，能讓完整的人外顯組測序成為現(xiàn)實，最終將為研究流水線輸送技術(shù)，并促進(jìn)個性化醫(yī)療的開發(fā).ABI測序儀過去20年，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)在測序方面一直占據(jù)著壟斷地位。自公司的共同創(chuàng)始人LeroyHood在上世紀(jì)80年代中期設(shè)計了第一臺自動熒光測序儀之后，生命科學(xué)研究就擺脫了手工測序的繁瑣和辛勞，驕傲地邁入自動測序的新時代。直到2005年,454推出了FLX焦磷酸測序平臺，ABI的領(lǐng)先地位開始有些動搖。之后，ABI迅速收購了一家測序公司AgencourtPerso

24、nalGenomics，并在2007年底推出了SOLiD新一代測序平臺。從SOLiD到如今的SOLiD3，短短一年多時間，它已經(jīng)上演了一出精彩的“一級方程式賽車”。SOLiD全稱為supportedoligoligationdetetion，它的獨特之處在于以四色熒光標(biāo)記寡核苷酸的連續(xù)連接合成為基礎(chǔ)，取代了傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)，可對單拷貝DNA片段進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增和高通量并行測序。就通量而言，SOLiD3系統(tǒng)是革命性的，目前SOLiD3單次運行可產(chǎn)生50GB的序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于17倍人類基因組覆蓋度。而其無以倫比的準(zhǔn)確性、系統(tǒng)可靠性和可擴(kuò)展性更讓它從其他新一代測序平臺中脫穎而出。為什么SOLiD能

25、輕松實現(xiàn)貌似不可能的任務(wù)？讓生物通帶你從測序原理入手，一探究竟。SOLiD工作流程a.文庫制備SOLiD系統(tǒng)能支持兩種測序模板：片段文庫(fragmentlibrary)或配對末端文庫(mate-pairedlibrary)。使用哪一種文庫取決于你的應(yīng)用及需要的信息。片段文庫就是將基因組DNA打斷，兩頭加上接頭，制成文庫。如果你想要做轉(zhuǎn)錄組測序、RNA定量、miRNA探索、重測序、3,5-RACE、甲基化分析、ChIP測序等，就可以用它。如果你的應(yīng)用是全基因組測序、SNP分析、結(jié)構(gòu)重排/拷貝數(shù)，則需要用配對末端文庫。配對末端文庫是將基因組DNA打斷后，與中間接頭連接，再環(huán)化，然后用EcoP15

26、酶切，使中間接頭兩端各有27bp的堿基，再加上兩端的接頭，形成文庫。b.乳液PCR/微珠富集在微反應(yīng)器中加入測序模板、PCR反應(yīng)元件、微珠和引物，進(jìn)行乳液PCR(EmulsionPCR)。PCR完成之后，變性模板，富集帶有延伸模板的微珠，去除多余的微珠。微珠上的模板經(jīng)過3修飾，可以與玻片共價結(jié)合?？吹竭@里，是不是有一種似曾相識的感覺呢？那就對了，此步驟與454的GSFLX基本相同。不過SOLiD系統(tǒng)的微珠要小得多，只有1um。乳液PCR最大的特點是可以形成數(shù)目龐大的獨立反應(yīng)空間以進(jìn)行DNA擴(kuò)增。其關(guān)鍵技術(shù)是“注水到油”，基本過程是在PCR反應(yīng)前，將包含PCR所有反應(yīng)成分的水溶液注入到高速旋轉(zhuǎn)的

27、礦物油表面，水溶液瞬間形成無數(shù)個被礦物油包裹的小水滴。這些小水滴就構(gòu)成了獨立的PCR反應(yīng)空間。理想狀態(tài)下，每個小水滴只含一個DNA模板和一個P1磁珠，由于水相中的P2引物和磁珠表面的P1引物所介導(dǎo)的PCR反應(yīng)，這個DNA模板的拷貝數(shù)量呈指數(shù)級增加，PCR反應(yīng)結(jié)束后，P1磁珠表面就固定有拷貝數(shù)目巨大的同來源DNA模板擴(kuò)增產(chǎn)物。微珠沉積3修飾的微珠沉積在一塊玻片上。在微珠上樣的過程中，沉積小室將每張玻片分成1個、4個或8個測序區(qū)域。SOLiD系統(tǒng)最大的優(yōu)點就是每張玻片能容納更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中輕松實現(xiàn)更高的通量。連接測序這一步可就是SOLiD的獨門秘笈了。它的獨特之處在于沒有采用慣常的聚合

28、酶，而用了連接酶。SOLiD連接反應(yīng)的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物。連接反應(yīng)中，這些探針按照堿基互補(bǔ)規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對。探針的5末端分別標(biāo)記了CY5、TexasRed、CY3、6-FAM這4種顏色的熒光染料。探針3端15位為隨機(jī)堿基，可以是ATCG四種堿基中的任何一種堿基，其中第1、2位構(gòu)成的堿基對是表征探針染料類型的編碼區(qū)，下圖的雙堿基編碼矩陣規(guī)定了該編碼區(qū)16種堿基對和4種探針顏色的對應(yīng)關(guān)系，而35位的“n”表示隨機(jī)堿基，68位的“z”指的是可以和任何堿基配對的特殊堿基。AG匚G2ndWWWl生物謹(jǐn)Vk3tFdd.ccnn單向SOLiD測序包括五輪測序反應(yīng)，每輪測序反應(yīng)含有多次連

29、接反應(yīng)。第一輪測序的第一次連接反應(yīng)由連接引物“n”介導(dǎo)，由于每個磁珠只含有均質(zhì)單鏈DNA模板，所以這次連接反應(yīng)摻入一種8堿基熒光探針，SOLiD測序儀記錄下探針第1、2位編碼區(qū)顏色信息，隨后的化學(xué)處理斷裂探針3端第5、6位堿基間的化學(xué)鍵，并除去68位堿基及5末端熒光基團(tuán)，暴露探針第5位堿基5磷酸，為下一次連接反應(yīng)作準(zhǔn)備。因為第一次連接反應(yīng)使合成鏈多了5個堿基，所以第二次連接反應(yīng)得到模板上第6、7位堿基序列的顏色信息，而第三次連接反應(yīng)得到的是第11、12位堿基序列的顏色信息IgnplhieSequence化生物通 HYPERLINK http:/www.e www.ejoirde.cofnWip

30、fe:&SequenceWEIHMIHII川IIIIIHIIIII川IIIIIHIII擷嘲幗：泊;nenesJetnoku馳口噸ncHIM丁Ad部starSeiKe+HiChChr【5叭lllllliHIIIIIIIIIIIIIMlll幾個循環(huán)之后，引物重置，開始第二輪的測序。由于第二輪連接引物n-1比第一輪錯開一位，所以第二輪得到以0，1位起始的若干堿基對的顏色信息。五輪測序反應(yīng)反應(yīng)后，按照第0、1位，第1、2位.的順序把對應(yīng)于模板序列的顏色信息連起來，就得到由“0,1,2,3”組成的SOLiD原始顏色序列。e.數(shù)據(jù)分析SOLiD測序完成后，獲得了由顏色編碼組成的SOLiD原始序列。理論上來

31、說，按照“雙堿基編碼矩陣”，只要知道所測DNA序列中任何一個位置的堿基類型，就可以將SOLiD原始顏色序列“解碼”成堿基序列。但由于雙堿基編碼規(guī)則中雙堿基與顏色信息的簡并特性（一種顏色對應(yīng)4種堿基對），前面堿基的顏色編碼直接影響緊跟其后堿基的解碼，所以一個錯誤顏色編碼就會引起“連鎖解碼錯誤”改變錯誤顏色編碼之后的所有堿基。和其它所有測序儀一樣，測序錯誤在所難免，關(guān)鍵是對測序錯誤的評價和后續(xù)處理。由于SOLiD系統(tǒng)采用了雙堿基編碼技術(shù)，在測序過程中對每個堿基判讀兩遍，從而減少原始數(shù)據(jù)錯誤，提供內(nèi)在的校對功能。這樣，雙保險確保了SOLiD系統(tǒng)原始堿基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于99.94%,而在15X覆蓋率時

32、的準(zhǔn)確度可以達(dá)到99.999%，是目前新一代基因分析技術(shù)中準(zhǔn)確度最高的。為避免“連鎖解碼錯誤”的發(fā)生，SOLiD數(shù)據(jù)分析軟件不直接將SOLiD原始顏色序列解碼成堿基序列，而是依靠referenee序列進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。SOLiD序列分析軟件首先根據(jù)“雙堿基編碼矩陣”把reference堿基序列轉(zhuǎn)換成顏色編碼序列然后與SOLiD原始顏色序列進(jìn)行比較,來獲得SOLiD原始顏色序列在referenee的位置，及兩者的匹配性信息。Referenee轉(zhuǎn)換而成的顏色編碼序列和SOLiD原始序列的不完全匹配主要有兩種情況：“單顏色不匹配”和“兩連續(xù)顏色不匹配”。由于每個堿基都被獨立地檢測兩次，且SNP位點將

33、改變連續(xù)的兩個顏色編碼，所以一般情況下SOLiD將單顏色不匹配處理成測序錯誤，這樣一來，SOLiD分析軟件就完成了該測序錯誤的自動校正；而連續(xù)兩顏色不匹配也可能是連續(xù)的兩次測序錯誤，SOLiD分析軟件將綜合考慮該位置顏色序列的一致性及質(zhì)量值來判斷該位點是否為SNP。在初步了解了SOLiD系統(tǒng)的工作原理之后，我們才能明白它的魅力所在。系統(tǒng)可擴(kuò)展性SOLiD系統(tǒng)采用開放玻片式的結(jié)構(gòu)，使用包被DNA樣品的微珠來輸入基因組信息。微珠密度并不是一成不變的，系統(tǒng)支持更高密度的微珠富集。開放式玻片形式、微珠富集、以及軟件算法的結(jié)合，能使平臺輕松升級到更高的通量，而無需對基礎(chǔ)技術(shù)和配置做重大改變。這也是SOL

34、iD系統(tǒng)平均每季度將通量擴(kuò)大一倍的原因所在。無以倫比的通量目前SOLiD3系統(tǒng)單次運行能產(chǎn)生50GB的人基因組序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于基因組的17倍覆蓋度，這顯然是其他任一臺新一代測序系統(tǒng)都無法達(dá)到的。今年初，ABI公司和貝勒醫(yī)學(xué)院人類基因組測序中心（HGSC）的科學(xué)家總結(jié)了他們在千人基因組計劃首次數(shù)據(jù)發(fā)布中的貢獻(xiàn)。作為商業(yè)參與者以及與HGSC共同協(xié)作，ABI公司利用SOLiD系統(tǒng)產(chǎn)生了超過460GB可作圖的序列數(shù)據(jù)，比這兩個機(jī)構(gòu)的預(yù)定目標(biāo)高出了65%。而通量的升高也有望進(jìn)一步降低基因組測序的費用，成本只需1萬美元的人類基因組測序指日可待。最大的靈活性SOLiD3系統(tǒng)具有兩個獨立的流動室，讓用戶能在一

35、臺SOLiD分析儀中運行兩個完全獨立的實驗同時提供兩套儀器。玻片也能分成1個、4個或8個小室。而20個條形碼序列則提供了額外的靈活性，顯著增加了定向重測序、表達(dá)和ChIP分析的經(jīng)濟(jì)性。目前最多能同時運行320個樣品（2x8x20）。至此，SOLiD系統(tǒng)已不再是一臺單純的測序儀，而是成為功能更全面的基因分析儀。除了測序和重測序，還能進(jìn)行全基因表達(dá)圖譜分析、SNP、microRNA、ChIP、甲基化等多種分析。全基因表達(dá)圖譜分析芯片大概是目前應(yīng)用最廣泛的從全局角度分析基因表達(dá)整體模式的方法。然而，基于雜交技術(shù)的微陣列技術(shù)只限用于已知序列，無法檢測新的mRNA；而且雜交技術(shù)靈敏度有限，難以檢測低豐度的目標(biāo)（需要更多的樣品量），難以檢測重復(fù)序列；也無法捕捉到目的基因表達(dá)水平的微小變化而這恰恰是研究在刺激下或環(huán)境變化時的生物反應(yīng)所必需的。與芯片技術(shù)相比，基于測序的高靈敏SOLiD技術(shù)可對單個細(xì)胞和癌癥樣品中存在的痕量RNA進(jìn)行整體的全基因組表達(dá)圖譜分析，每次運行能定位高達(dá)2億4千萬個標(biāo)簽（mRNA的相對表達(dá)水平可通過系統(tǒng)產(chǎn)生的序列標(biāo)簽數(shù)目來計算），可檢測低至每個細(xì)胞中10-40pg的總RNA，即使mRNA表達(dá)水平很低，SOLiD系統(tǒng)也能夠無偏向性地分析樣品中存在的已知和未知mRNA,從而定量特定mRNA的差異表達(dá)模式。起