肺結(jié)核新診斷技術(shù)

1、肺結(jié)核新診斷技術(shù)NTP中現(xiàn)行實(shí)驗(yàn)室技術(shù)涂片：萋尼染色顯微鏡檢培養(yǎng)：固體培養(yǎng)基：簡(jiǎn)單法、離心法藥敏：固體培養(yǎng)基：絕對(duì)濃度法、比例法菌種鑒定：鑒別培養(yǎng)基生化試驗(yàn)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)不能適應(yīng)不斷深入的結(jié)核病防治工作的需要實(shí)驗(yàn)室新診斷技術(shù)總覽細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法發(fā)光二極管熒光顯微鏡LED液體培養(yǎng)分子生物學(xué)檢測(cè)方法GenexpertHAINGenechip免疫學(xué)檢測(cè)方法ELISOPT&TSPOT 和Quantiferon血清學(xué)診斷方法熒光 比色 (MIGIT) (MB Bact Alert)Ruthenium complex CO2 pH液體培養(yǎng)BACTEC TB460原理：標(biāo)本經(jīng)前處理接種至含有14C-棕櫚酸的1

2、2B培養(yǎng)基，37C培養(yǎng)。分枝桿菌分解14C-棕櫚酸，產(chǎn)生14CO2，BACTEC TB460儀自動(dòng)檢測(cè)，14CO2含量，并換算成生長(zhǎng)指數(shù)GI。優(yōu)點(diǎn)：快速：將別離培養(yǎng)的陽性檢出時(shí)間由常規(guī)培養(yǎng)所需的2-8周縮短至3-14天，將藥敏試驗(yàn)的報(bào)告時(shí)間由常規(guī)方法的4周縮短至1周。操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，可進(jìn)一步做藥敏試驗(yàn)、菌種初步鑒定。缺點(diǎn)：放射性同位素污染。儀器與試劑價(jià)格昂貴。未實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化污染率高原理：是BACTEC TB460的換代產(chǎn)品。標(biāo)本經(jīng)前處理后接種到系統(tǒng)配套的液體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中包被有對(duì)氧濃度敏感的熒光物質(zhì)，當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝消耗培養(yǎng)基中的氧時(shí)，氧濃度降低，熒光被激發(fā)，系統(tǒng)可以連續(xù)檢測(cè)熒光水平，自

3、動(dòng)報(bào)告結(jié)果。優(yōu)點(diǎn)：系統(tǒng)進(jìn)一步優(yōu)化，操作更簡(jiǎn)便、自動(dòng)化更強(qiáng)。解決了BACTEC TB460的同位素污染問題。24小時(shí)連續(xù)檢測(cè)，有利于早期報(bào)告陽性結(jié)果。缺點(diǎn)：儀器與試劑價(jià)格更昂貴。未能解決高污染率的問題BACTEC MGIT 960 分枝桿菌生長(zhǎng)指示管液體培養(yǎng)1Cruciani M, et al. JCM 2004; 42:2321-23252 ) = acceptable rangeMGIT 7 mlMGIT 7 mlMGIT 7 mlMGIT 7 mlMGIT 7 mlMGIT 7 mlMGIT 7 ml +SMGIT 7 ml +IMGIT 7 ml +RMGIT 7 ml +EGCSIRE

4、0,8 ml BACTEC MGIT SIRE 補(bǔ)充劑每種藥物0,1 ml轉(zhuǎn)移 0,5 ml 陽性 MGIT 培養(yǎng)物0,1 ml 陽性 MGIT 培養(yǎng)物9,9 ml 蒸餾水轉(zhuǎn)移 0,5 ml插入BACTEC MGIT 960BACTEC MGIT 960 TB 藥敏試驗(yàn) S.I.R.E.LED顯微鏡發(fā)光二級(jí)管 (LED) 技術(shù)提供價(jià)廉、穩(wěn)定的光源壽命 150,000 h反復(fù)開關(guān)不影響壽命不釋放有毒氣體不需要暗室操作人員工作負(fù)荷減輕快速藥敏-商業(yè)化線性探針檢測(cè)LPAs GenoType MTBDRplus, HAIN檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群以及利福平、異煙肼耐藥相關(guān)的突變檢測(cè)XDR的試劑盒也已經(jīng)發(fā)

5、布INNO-Lipa Rif TB檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群以及于利福平耐藥相關(guān)的突變大多數(shù)利福平耐藥的菌株同時(shí)也耐異煙肼WHO 鼓勵(lì)使用的工具可使用涂陽痰標(biāo)本和培養(yǎng)物進(jìn)展操作快速、簡(jiǎn)便易用，僅需根本PCR技術(shù)然而，價(jià)格比較昂貴，且不能檢測(cè)造成耐藥突變的熱點(diǎn)區(qū)域外的突變11MTBDRplus 操作流程DNA提取用NALC/NaOH處理痰標(biāo)本2) PCR擴(kuò)增3) 雜交擴(kuò)增產(chǎn)物和 固化在膜上的特異性探針雜交4) 結(jié)果判讀rpoB 野生型探針: WT1 - WT8rpoB 突變探針: MUT1-3: D516V, H526Y, H526D, S531L 野生型缺失 野生型突變MTBDRplus rpoB

6、511513516518522526531533rpoB WT2rpoB WT4rpoB WT6rpoB WT8rpoB WT7rpoB MUT1 (D516V)rpoB MUT3 (S531L)rpoB MUT2A (H526Y)rpoB MUT2B (H526D)514515rpoB WT1rpoB WT3rpoB WT5509508505katG 基因突變MTBDRplus katGMTBDRplus inhAinhA 基因突變MTBDRplus 反響條帶(示范)南非的經(jīng)歷：Genotype MTBDR plus assay:直接從涂片陽性標(biāo)本中檢測(cè)rpob基因突變 (耐利福平), ka

7、tG 基因 (高濃度異煙肼耐藥), inhA 基因(低濃度異煙肼耐藥)靈敏度、特異度，陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值耐利福平 98.9, 99.4, 97.9, 和耐異煙肼 94.2, 99.7, 99.1, 和 耐MDR-TB 98.8, 100, 100, 和 Barnard M, et al. Am J Respir Crit Care Med 2021;177:787-92結(jié)核耐藥檢測(cè)基因芯片激光共焦掃描儀軟件判讀結(jié)核耐藥檢測(cè)芯片獲北京市自主創(chuàng)新產(chǎn)品證書樣品制備儀雜交儀通 量：兩個(gè)一線抗結(jié)核藥速 度： 6 小時(shí)比傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)法快 50-100 倍靈敏度：103 CFU/反響特異性：對(duì)照設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)

8、；自動(dòng)判讀基于rpoB/katG/inhA的基因突變，快速檢測(cè)別離株或者痰樣本中結(jié)核桿菌多藥耐藥利福平、異煙肼。International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 13:914-920, 202118獲國(guó)家醫(yī)療器械證書和歐盟CE認(rèn)證Xpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)利福平耐藥直接標(biāo)本檢測(cè)100分鐘可獲得結(jié)果工作流程痰簡(jiǎn)單，僅需1個(gè)步驟的準(zhǔn)備工作獲得結(jié)果的時(shí)間 16 樣本 / 天 / 模塊不需要生物平安規(guī)綜合控制性能對(duì) MTB特異敏感性與培養(yǎng)相似通過rpoB 基因檢測(cè)利福平耐藥產(chǎn)品和系統(tǒng)設(shè)計(jì)GeneXpert 系統(tǒng)的檢測(cè)模塊

9、測(cè)試模塊的擴(kuò)大和交換 對(duì)非分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室人員僅需要最多1天的培訓(xùn)GeneXpert樣本準(zhǔn)備、擴(kuò)增、檢測(cè)自動(dòng)化MTB / 利福平耐藥性檢測(cè)痰標(biāo)本可以直接放入模塊中，而無需與任何試劑進(jìn)展混合處理報(bào)告結(jié)果時(shí)間: 1 h 45 minGeneXpertDNA 分子與PCR試劑混合樣本自動(dòng)過濾和清洗超聲裂解捕獲的生物體，釋放DNA半嵌套實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增 & 檢測(cè)集成反應(yīng)管456濃縮細(xì)菌去除抑制劑12標(biāo)本液化和作用15分鐘后轉(zhuǎn)移 2 ml3 結(jié)束手工工作7結(jié)果可打印Xpert MTB/RIF單中心評(píng)估研究初步結(jié)果不同研究設(shè)計(jì)和研究人群，肺結(jié)核和肺外結(jié)核標(biāo)本檢測(cè)結(jié)核匯總的未經(jīng)校正的敏感性 92%匯總的未經(jīng)校正

10、的特異性 98%檢測(cè)利福平耐藥匯總的未經(jīng)校正的敏感性 98%匯總的未經(jīng)校正的特異性 99%操作方面廢棄物管理 如痰標(biāo)本容器儲(chǔ)存和供給 反響盒龐大, 2 - 28C, 有效期12個(gè)月 電力供給 UPS (400 VA) 或電池組 培訓(xùn) 需求不高 (使用計(jì)算機(jī)、預(yù)防污染) 生物平安 與涂片鏡檢一樣每年校正 模塊更換平安 防盜 (計(jì)算機(jī))世界衛(wèi)生組織快速開展Xpert MTB/RIF診斷試驗(yàn)技術(shù)和實(shí)施方面的考慮2021年3月WHO對(duì)Xpert MTB/RIF的建議摘要：高度推薦用于疑心MDR-TB以及合并HIV感染的結(jié)核病病人的初診診斷對(duì)于MDRTB、HIV不嚴(yán)重的地區(qū)，可以在涂片之后考慮使用Xpe

11、rt MTB/RIF，特別是用于診斷涂陰病人取決于費(fèi)用肺外標(biāo)本的有關(guān)證據(jù)尚有限增加檢測(cè)次數(shù)可能增加敏感性，但需考慮費(fèi)用增加適用于兒童不能替代傳統(tǒng)涂片、培養(yǎng)、藥敏試驗(yàn)步驟 1: 特異抗原激發(fā)淋巴細(xì)胞IFN- 釋放陰性對(duì)照ESAT-6或CFP-10孵育孵育顯影步驟 2:用ELISA 檢測(cè) IFN- Y Y YYYYY Y YYYY洗滌Y Y YYYY 洗滌Y Y YQuantiFERON TB Gold實(shí)驗(yàn)T-SPOT TB (ELISPOT)技術(shù) 單核細(xì)胞別離TB抗原刺激，IFN- 釋放一抗捕獲IFN- 與標(biāo)記的二抗結(jié)合 酶作用標(biāo)記物顯色每一斑點(diǎn)代表釋放IFN-的一個(gè)細(xì)胞YYYYYYYYYYYY

12、YYYYYYYYYYYYIFN-抗原小 結(jié)NTP中如何應(yīng)用 給誰用？哪里做？怎么用？國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室推薦建議液體培養(yǎng)用于: 結(jié)核病可疑病癥者檢查, 可以作為結(jié)核病耐藥的診斷依據(jù)和結(jié)核病患者治療效果判斷, 液體培養(yǎng)可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)培養(yǎng)推薦理由:液體培養(yǎng)在已經(jīng)在我國(guó)注冊(cè)；國(guó)內(nèi)外研究顯示其敏感性和TAT優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)；數(shù)據(jù)顯示在我國(guó)具有可行性,符合本錢效果；推薦使用層級(jí): 區(qū)縣、地市和省級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾病預(yù)防機(jī)構(gòu)國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室推薦建議GenXpert 即將可以用于: 結(jié)核病可疑病癥者檢查, 可以作為結(jié)核病的輔助診斷方法和結(jié)核病患者治療效果判斷, 它有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)的培養(yǎng)和利福平的藥敏試驗(yàn)可疑耐藥結(jié)核病

13、患者推薦理由:即將在我國(guó)獲得注冊(cè)證書；國(guó)內(nèi)外研究顯示其敏感性和特異性，陽性結(jié)果報(bào)告時(shí)間優(yōu)于傳統(tǒng)方法；WHO 在全球推薦數(shù)據(jù)顯示在我國(guó)具有可行性,符合本錢效果；可能使用層級(jí): 區(qū)縣？、地市和省級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾病預(yù)防機(jī)構(gòu)國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室推薦建議LPA可以用于: 可疑耐藥結(jié)核病患者查,它有望代替利福平和異煙肼的傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)推薦理由:在我國(guó)獲得注冊(cè)證書；國(guó)內(nèi)外研究顯示其敏感性和特異性TAT)較好；WHO 在全球推薦數(shù)據(jù)顯示在我國(guó)具有可行性,符合本錢效果；可能使用層級(jí): 地市和省級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾病預(yù)防機(jī)構(gòu)國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室推薦建議基因芯片可以用于: 可疑耐藥結(jié)核病患者查,它有望代替利福平和異煙肼的傳統(tǒng)

14、藥敏試驗(yàn)推薦理由:在我國(guó)獲得注冊(cè)證書；國(guó)內(nèi)研究顯示其敏感性和特異性和(TAT)較好；民族品牌數(shù)據(jù)顯示在我國(guó)具有可行性,符合本錢效果；可能使用層級(jí): 地市和省級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾病預(yù)防機(jī)構(gòu)國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室推薦建議 干擾素釋放試驗(yàn)可以用于: 結(jié)核菌潛伏感染篩查,兒童和老年人以及免疫力低下者結(jié)核病的輔助診斷參考推薦理由:在我國(guó)獲得注冊(cè)證書，國(guó)家對(duì)一些特殊診斷試劑的規(guī)定；國(guó)內(nèi)外研究顯示其敏感性和特異性較好；數(shù)據(jù)顯示在我國(guó)具有可行性可能使用層級(jí): 縣區(qū)、地市和省級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾病預(yù)防機(jī)構(gòu)我國(guó)新診斷技術(shù)應(yīng)用設(shè)想根據(jù)國(guó)家結(jié)核病防治規(guī)劃的需要，按照不同級(jí)別的實(shí)驗(yàn)室職能定位選擇相應(yīng)的通過系統(tǒng)評(píng)估適宜新診斷方法；依據(jù)各地實(shí)際情況，在縣級(jí)同時(shí)開展培養(yǎng)，地市級(jí)同時(shí)開展藥敏試驗(yàn)工作。依據(jù)：盡管新診斷技術(shù)快簡(jiǎn)和靈敏，目前還沒有哪種新技術(shù)的靈敏度和特異性都完全超過傳統(tǒng)培養(yǎng)；耐多藥結(jié)核病的治療需要