新編第3章蛋白質(zhì)課件

1、第一篇 物質(zhì)篇第3章 蛋 白 質(zhì)3.1 蛋白質(zhì)的化學(xué)組成與分類3.2 氨基酸與肽3.3 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)3.4 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)3.5 蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)及其在食 品加工中的應(yīng)用蛋白質(zhì)存在于所有的生物細(xì)胞中，是構(gòu)成生物體最基本的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能物質(zhì)。蛋白質(zhì)是生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，它參與了幾乎所有的生命活動過程。蛋白質(zhì)是食品的主要營養(yǎng)成分，除保證食品的營養(yǎng)價值外，在決定食品特征上也起重要作用。早在1878年，思格斯就在反杜林論中指出：“生命是蛋白體的存在方式，這種存在方式本質(zhì)上就在于這些蛋白體的化學(xué)組成部分的不斷的自我更新?！?可以看出，第一，蛋白體是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)；第二，生命是物質(zhì)運(yùn)動的特殊形式，是

2、蛋白體的存在方式；第三，這種存在方式的本質(zhì)就是蛋白體與其外部自然界不斷的新陳代謝。現(xiàn)代生物化學(xué)的實(shí)踐完全證實(shí)并發(fā)展了恩格斯的論斷。蛋白質(zhì)的生物學(xué)意義1. 生物體的組成成分2. 酶3. 運(yùn)輸4. 運(yùn)動5. 抗體6. 干擾素7. 遺傳信息的控制8. 細(xì)胞膜的通透性9. 高等動物的記憶、識別機(jī)構(gòu)木瓜蛋白酶3.1 蛋白質(zhì)的化學(xué)組成與分類蛋白質(zhì)是一類含氮有機(jī)化合物，除含有碳、氫、氧外，還有氮和少量的硫。某些蛋白質(zhì)還含有其他一些元素，主要是磷、鐵、碘、碘、鋅和銅等。這些元素在蛋白質(zhì)中的組成百分比約為： 碳 50-60% 氫 6-8% 氧 19%-24 氮 16% 硫 04 其他 微 量一、蛋白質(zhì)的化學(xué)組成

3、1. 蛋白質(zhì)的含氮量氮占生物組織中所有含氮物質(zhì)的絕大部分。因此，可以將生物組織的含氮量近似地看作蛋白質(zhì)的含氮量。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)的含氮量接近于16%，所以，可以根據(jù)生物樣品中的含氮量來計算蛋白質(zhì)的大概含量：蛋白質(zhì)含量（克%）=每克生物樣品中含氮的克數(shù) 6.252. 蛋白質(zhì)的大小與分子量蛋白質(zhì)是分子量很大的生物分子。蛋白質(zhì)可以被酸、堿或酶催化水解。盡管蛋白質(zhì)的種類千差萬別，但水解的最終產(chǎn)物都是氨基酸。構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸共20種，稱為基本氨基酸。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位。蛋白質(zhì)分子量的上下限是人為規(guī)定的，因?yàn)檫@決定于蛋白質(zhì)和分子量概念的定義。某些蛋白質(zhì)是由兩個或更多個蛋白質(zhì)亞基(多肽鏈)通過非

4、共價結(jié)合而成的，稱寡聚蛋白質(zhì)。有些寡聚蛋白質(zhì)的分子量可高達(dá)數(shù)百萬甚至數(shù)千萬。（一）依據(jù)蛋白質(zhì)的組成分類按照蛋白質(zhì)的組成，可以分為：簡單蛋白(simple protein) 和結(jié)合蛋白(conjugated protein) 。二、蛋白質(zhì)的分類1、簡單蛋白又稱為單純蛋白質(zhì)；這類蛋白質(zhì)只含由-氨基酸組成的肽鏈，不含其它成分。（1）清蛋白和球蛋白(albumin and globulin )：廣泛存在于動物組織中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。（2）谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀堿中，后者可溶于7080乙醇中。（3）精蛋

5、白和組蛋白：可溶于水或稀酸，堿性蛋白質(zhì)，存在與細(xì)胞核中。（4）硬蛋白：溶解度最低，能抗酶水解。存在于各種軟骨、腱、毛、發(fā)、絲等組織中，分為角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白和絲蛋白。2、結(jié)合蛋白由簡單蛋白與其它非蛋白成分結(jié)合而成，色蛋白：由簡單蛋白與色素物質(zhì)結(jié)合而成。如血紅蛋白、葉綠蛋白和細(xì)胞色素等。糖蛋白：由簡單蛋白與糖類物質(zhì)組成。如細(xì)胞膜中的糖蛋白等。脂蛋白：由簡單蛋白與脂類結(jié)合而成。 如血清-，-脂蛋白等。核蛋白：由簡單蛋白與核酸結(jié)合而成。如細(xì)胞核中的核糖核蛋白等。(二) 依據(jù)蛋白質(zhì)的外形分類按照蛋白質(zhì)的外形可分為球狀蛋白質(zhì)和纖維狀蛋白質(zhì)。球狀蛋白質(zhì)globular protein ：外形接近球

6、形或橢圓形，溶解性較好，能形成結(jié)晶，大多數(shù)蛋白質(zhì)屬于這一類。纖維狀蛋白質(zhì)fibrous protein ：分子類似纖維或細(xì)棒。它又可分為可溶性纖維狀蛋白質(zhì)和不溶性纖維狀蛋白質(zhì)。（三）根據(jù)蛋白質(zhì)來源分類 根據(jù)蛋白質(zhì)來源的不同，蛋白質(zhì)可分為動物性蛋白質(zhì)、植物性蛋白質(zhì)和單細(xì)胞蛋白質(zhì)三類。 動物性蛋白質(zhì)：主要來源于肉類、乳類和蛋類。 肉類蛋白質(zhì)：約含有70%的結(jié)構(gòu)蛋白和30%的水溶性蛋白質(zhì)。水溶性蛋白質(zhì)又可分為肌漿蛋白和肌清蛋白兩種。 乳類蛋白質(zhì)：乳蛋白包括酪蛋白、乳清蛋白和脂肪球膜蛋白質(zhì)。 蛋類蛋白質(zhì)：蛋類蛋白質(zhì)包括蛋清、蛋黃蛋白質(zhì)兩類。 植物性蛋白質(zhì)：主要是來源于蔬菜、谷物和油料種子中的蛋白質(zhì)。

7、蔬菜蛋白， 谷類蛋白, 油料種子蛋白。單細(xì)胞蛋白質(zhì)：單細(xì)胞蛋白質(zhì)來源于微生物。在酵母菌中可達(dá)40%60%，細(xì)菌中甚至可達(dá)80%以上。單細(xì)胞蛋白質(zhì)特點(diǎn)是核蛋白含量高，目前主要用于飼料生產(chǎn)。 3.2 氨基酸與肽一、氨基酸氨基酸 是蛋白質(zhì)的基本組成單位。從細(xì)菌到人類，所有蛋白質(zhì)都由20種基本氨基酸（20 standard amino acids)組成。1、氨基酸的結(jié)構(gòu)通式：19種氨基酸具有一級氨基（-NH3+）和羧基（-COOH）結(jié)合到碳原子（C），同時結(jié)合到（C）上的是H原子和各種側(cè)鏈（R）；脯氨酸（Pro）具有二級氨基（-亞氨基酸）（一）氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類不帶電形式 H2NCHCOOHR +H3

8、NCHCOO-R兩性離子形式C如是不對稱C（除Gly），則：具有兩種立體異構(gòu)體 D-型和L-型2. 具有旋光性 左旋（-）或右旋（+）20種氨基酸甘氨酸丙氨酸纈氨酸亮氨酸異亮氨酸絲氨酸半胱氨酸蘇氨酸甲硫氨酸脯 氨酸苯丙氨酸天冬氨酸酪氨酸色氨酸組氨酸賴氨酸精氨酸谷氨酸天冬酰胺谷氨酰胺苯丙氨酸2、氨基酸的分類 根據(jù)側(cè)鏈R的性質(zhì)不同，可將氨基酸分為四類：非極性或疏水性氨基酸、極性不帶電荷氨基酸、在pH7.0時R帶負(fù)電荷氨基酸和在pH7.0時R帶正電荷氨基酸。 非極性或疏水性氨基酸和極性不帶電荷氨基酸是中性氨基酸，在pH7.0時R帶負(fù)電荷氨基酸為酸性氨基酸，在pH7.0時R帶正電荷氨基酸為堿性氨基酸。

9、 非極性或疏水性氨基酸 含有非極性的側(cè)鏈，呈中性，具有不同程度的疏水性。主要包括脂肪烴側(cè)鏈的丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸以及脯氨酸；芳香環(huán)側(cè)鏈的苯丙氨酸和色氨酸；含硫氨基酸的甲硫氨酸或稱蛋氨酸。 極性不帶電荷氨基酸 側(cè)鏈帶有羥基、巰基或酰胺基等極性基團(tuán)，因此，比極性基團(tuán)易溶于水，但在水溶液中不電離。主要包括絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺和半胱氨酸。甘氨酸雖然不帶有R基團(tuán)，但由于其帶電荷的氨基和羧基占據(jù)了整個分子的大部分，具有明顯的極性，所以也可歸入這一類。 R側(cè)鏈帶負(fù)電荷的氨基酸 這類氨基酸在pH7.0時帶有凈的負(fù)電荷，在側(cè)鏈中含有羧基，易解離出H+ 而具有酸性。包括天冬氨酸和

10、谷氨酸兩種氨基酸。 R側(cè)鏈帶正電荷的氨基酸 這類氨基酸的R側(cè)鏈在pH7.0時帶有正電荷，易接受H+ 而具有堿性。包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。溶解性：各種氨基酸在水中的溶解度差別很大，并能溶解于稀酸或稀堿中，但不能溶解于有機(jī)溶劑。通常酒精能把氨基酸從其溶液中沉淀析出。 (2)熔點(diǎn)：氨基酸的熔點(diǎn)極高，一般在200以上。(3)味感：其味隨不同氨基酸有所不同，有的無味、有的為甜、有的味苦，谷氨酸的單鈉鹽有鮮味，是味精的主要成分。（二）氨基酸的性質(zhì)1. 氨基酸的物理性質(zhì)除甘氨酸外，氨基酸均含有一個手性-碳原子，因此都具有旋光性。比旋光度是氨基酸的重要物理常數(shù)之一，是鑒別各種氨基酸的重要依據(jù) （4）氨基酸

11、的旋光性（5）氨基酸的光吸收構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在遠(yuǎn)紫外區(qū)(97%以上）；2，知道蛋白質(zhì)的分子量；3，知道蛋白質(zhì)由幾個亞基組成；4，多肽鏈的拆分。5，測定多肽鏈的氨基酸組成。6，測定多肽鏈的氨基酸順序。(1)，測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定(2)，多肽鏈的拆分。幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進(jìn)行拆分。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定(3)，二硫鍵的斷裂幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起?？稍诳捎?mol/L尿素或6mol/L鹽酸

12、胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定1作用：這些反應(yīng)可用于巰基的保護(hù)。巰基（-SH）的保護(hù)(4)測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比；蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定(5)分析多肽鏈的N-末端和C-末端多肽鏈端基氨基酸分為兩類：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。末端基氨基酸測定Sanger法。2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性條件下水解

13、，得到黃色DNP-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進(jìn)行鑒定。末端基氨基酸測定 二硝基氟苯（DNFB）法在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的優(yōu)點(diǎn)是丹磺酰-氨基酸有很強(qiáng)的熒光性質(zhì)，檢測靈敏度可以達(dá)到110-9mol。末端基氨基酸測定 丹磺酰氯法此法是多肽鏈C-端氨基酸分析法。多肽與肼在無水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。末端基氨基酸測定 肼解法氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個的向里水解。

14、根據(jù)不同的反應(yīng)時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時間和氨基酸殘基釋放量作動力學(xué)曲線，從而知道蛋白質(zhì)的N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端的肽鍵速度最大。末端基氨基酸測定氨肽酶法羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個的水解。根據(jù)不同的反應(yīng)時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的C-末端殘基順序。目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和Y；A和B來自胰臟；C來自柑桔葉；Y來自面包酵母。羧肽酶A能水解除哺氨酸（Pro）,精氨酸（Arg）和賴氨酸（Lys）以外的所有C-末端氨基酸殘基；B只能水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽

15、鍵。末端基氨基酸測定羧肽酶法(6)多肽鏈斷裂成多個肽段，可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定 酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶多肽鏈的選擇性降解 化學(xué)法：(Cyanogen bromide)溴化氰水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。多肽鏈的選擇性降解(7)測定每個肽段的氨基酸順序。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定Edman （苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分析法實(shí)際上也是一種N-端分析法。此法的特點(diǎn)是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。Edman氨基酸順序分析法異硫

16、氰酸苯酯(8)確定肽段在多肽鏈中的次序。 利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定(9)確定原多肽鏈中二硫鍵的位置蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定一般采用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個肽段，用過甲酸處理后，將每個肽段進(jìn)行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置。二硫鍵位置的確定蛋白質(zhì)測序序列的確定涉及要用特殊的蛋白水解酶或切割特定肽鍵的化學(xué)試劑將蛋白質(zhì)分割成一系列的小肽。例如胃蛋白酶只切割賴氨酸（K）或精氨酸（R）之后的肽鍵，V8蛋白酶只在谷氨酸（E）后切割；而溴化氰在甲硫氨酸殘基后切割肽

17、鍵。然后將每一段小肽用自動蛋白質(zhì)測序儀采用Edman降解法（Edman degradation）進(jìn)行自動序列測定。 原初樣品蛋白質(zhì)的肽鏈順序可以通過測定經(jīng)不同蛋白酶處理產(chǎn)生出的肽段的序列，并根據(jù)重疊序列的辦法推測出來。 （i）胰蛋白酶裂解多肽鏈；（）V8蛋白酶的裂解；（iii）Edman降解法測定胰蛋白酶裂解的肽片段（T1T3）和V8蛋白酶裂解的肽片段（V1V3）的氨基酸序列；（）根據(jù)重疊肽段組裝完整的全長序列肽鏈.二、 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu) 多肽鏈折疊、盤曲，形成特有而穩(wěn)定的三維空間結(jié)構(gòu)。具有空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)才有生物功能。 研究蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)最有效的方法是X射線衍射法。近年來，高分辨核磁共振技術(shù)

18、在蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)研究中獲得了廣泛應(yīng)用。 蛋白質(zhì)分子中各原子和基團(tuán)在三維空間所處的相對位置構(gòu)成的特定空間結(jié)構(gòu)，稱為蛋白質(zhì)的構(gòu)象（protein conformation）。 天然蛋白質(zhì)分子都有與其生物活性密切相關(guān)的一種或幾種特定構(gòu)象。蛋白質(zhì)構(gòu)象十分復(fù)雜，可分為二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)。具有生物功能的完整蛋白質(zhì)必定具有三級甚至四級結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的二級(Secondary)結(jié)構(gòu)是指肽鏈的主鏈在空間盤曲、折疊所形成的構(gòu)象。它只涉及肽鏈主鏈的構(gòu)象及鏈內(nèi)或鏈間形成的氫鍵。它不涉及側(cè)鏈基團(tuán)的空間排布。二級結(jié)構(gòu)是由肽鍵的特殊結(jié)構(gòu)決定的。（一）蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu) （secondary structure） 肽

19、鍵的特點(diǎn)是氮原子上的孤對電子與羰基具有明顯的共軛作用。使C-N鍵具有部分雙鍵的性質(zhì)。組成肽鍵的原子處于同一平面。在肽鏈中，稱為肽平面。兩個相鄰肽鍵通過一個共同的-碳原子相連接。C-N鍵和C-C鍵可以自由旋轉(zhuǎn)，因此，在保持肽鍵平面結(jié)構(gòu)不變條件下，能夠形成不同的空間排列。 繞C-N鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱 （角），經(jīng)C-C鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱為（角）。原則上，和可以取-180+180之間的任意值（ =0，=0的構(gòu)象不存在）。肽平面 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要有-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角和自由肽段。1、-螺旋Pauling和Corey于1952年-螺旋是蛋白質(zhì)中最常見、含量最豐富的二級結(jié)構(gòu)。它是多肽鏈主鏈圍繞中心軸有規(guī)律的向左

20、或向右盤繞而形成的一種螺旋狀結(jié)構(gòu)。-helix 螺旋每上升一周需要3.6個氨基酸殘基，沿螺旋軸方向上升0.54nm，每個殘基繞軸旋轉(zhuǎn)100，沿軸上升0.15nm。-螺旋中的每一個氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)伸向螺旋的外側(cè)，相鄰螺旋之間形成鏈內(nèi)氫鍵，氫鍵的取向幾乎與螺旋中心軸平行。氫鍵是由肽鍵上的-N-H的氫和它后面（N-端）第四個殘基上的-CO的氧之間形成的。-螺旋要點(diǎn)左手和右手螺旋天然蛋白質(zhì)中存在的-螺旋主要是右手螺旋，既螺旋的走向?yàn)轫槙r針方向。-螺旋要點(diǎn)-折疊也是蛋白質(zhì)中常見的二級結(jié)構(gòu)，也叫-折疊片或-片層結(jié)構(gòu)。它是兩條或多條充分伸展成鋸齒狀折疊構(gòu)象的肽鏈側(cè)向聚集，按肽鍵的長軸方向平行并列，相鄰肽

21、鏈上的-NH和-CO之間形成有規(guī)則的氫鍵，形成折紙狀結(jié)構(gòu)。 -pleated sheet2、-折疊在-折疊中，-碳原子總是處于折疊的角上，氨基酸的R基團(tuán)處于折疊的棱角上并與棱角垂直，兩個氨基酸之間的軸心距為0.35nm；-折疊-折疊結(jié)構(gòu)的氫鍵主要是由兩條肽鏈之間形成的；也可以在同一肽鏈的不同部分之間形成。幾乎所有肽鍵都參與鏈內(nèi)氫鍵的交聯(lián)，氫鍵與鏈的長軸接近垂直。-折疊有兩種類型。一種為平行式，即所有肽鏈的N-端都在同一邊。另一種為反平行式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反。 在-轉(zhuǎn)角部分，由四個氨基酸殘基組成;彎曲處的第一個氨基酸殘基的 -C=O 和第四個殘基的 N-H 之間形成氫鍵，形成一個不很穩(wěn)定

22、的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，又叫-型回折、-彎曲或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。是在球狀蛋白質(zhì)分子中發(fā)現(xiàn)的另一種二級結(jié)構(gòu)。 -轉(zhuǎn)角多數(shù)處在球狀蛋白質(zhì)分子的表面，約占球蛋白全部殘基的25%左右，含量十分豐富。3、-轉(zhuǎn)角-turnN1CHCC2CHNHO=C3CHNC4CHNRRHOHRROHO4、自由肽段自由肽段蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中無規(guī)則的肽段，多與蛋白質(zhì)的功能有關(guān)。沒有一定規(guī)律的松散肽鏈結(jié)構(gòu)。酶的活性部位。 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)：-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角和自由肽段。（二）蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域 在蛋白質(zhì)分子中，由若干相鄰的二級結(jié)構(gòu)單元相互作用，形成有規(guī)則的、在空間上能辨認(rèn)的二級結(jié)構(gòu)聚集體。幾種類型的超二級結(jié)構(gòu)： ； 超二級結(jié)構(gòu)在結(jié)構(gòu)層次上高

23、于二級結(jié)構(gòu)，但沒有聚集成具有功能的結(jié)構(gòu)域1、超二級結(jié)構(gòu)（Rossmann，1973）、結(jié)構(gòu)域（Edelman,1970) 對于較大的蛋白質(zhì)分子或亞基，多肽鏈往往由兩個或兩個以上相對獨(dú)立的三維實(shí)體締合而成三級結(jié)構(gòu)。這種相對獨(dú)立的三維實(shí)體就稱結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域通常是幾個超二級結(jié)構(gòu)的組合，對于較小的蛋白質(zhì)分子，結(jié)構(gòu)域與三級結(jié)構(gòu)等同，即這些蛋白為單結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域一般由100200 個氨基酸殘基組成，但大小范圍可達(dá) 40400 個殘基。氨基酸可以是連續(xù)的，也可以是不連續(xù)的結(jié)構(gòu)域之間常形成裂隙，比較松散，往往是蛋白質(zhì)優(yōu)先被水解的部位。酶的活性中心往往位于兩個結(jié)構(gòu)域的界面上結(jié)構(gòu)域之間由“鉸鏈區(qū)”相連，使分子構(gòu)象

24、有一定的柔性，通過結(jié)構(gòu)域之間的相對運(yùn)動，使蛋白質(zhì)分子實(shí)現(xiàn)一定的生物功能。在蛋白質(zhì)分子內(nèi)，結(jié)構(gòu)域可作為結(jié)構(gòu)單位進(jìn)行相對獨(dú)立的運(yùn)動，水解出來后仍能維持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，甚至保留某些生物活性（三）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)(Tertiary Structure)是指在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，肽鏈的不同區(qū)段的側(cè)鏈基團(tuán)相互作用在空間進(jìn)一步盤繞、折疊形成的包括主鏈和側(cè)鏈構(gòu)象在內(nèi)的特征三維結(jié)構(gòu)。(Tertiary Structure)磷酸丙糖異構(gòu)酶和丙酮酸激酶的三級結(jié)構(gòu) a鹽鍵（離子鍵 ） b氫鍵 c疏水相互作用力 d 范德華力 e二硫鍵 f 酯鍵abcecdda 維系這種特定結(jié)構(gòu)的力主要有氫鍵、疏水鍵、離子鍵和范

25、德華力等。尤其是疏水鍵，在蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中起著重要作用。（四）蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)(Quaternary Structure)是由兩條或多條具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈按一定的空間排列方式，通過非共價鍵締合在一起形成的蛋白質(zhì)大分子，通常稱為寡聚蛋白。寡聚蛋白分子中的每一個三級結(jié)構(gòu)單位稱為一個亞基（或亞單位，subunit）。它一般由一條肽鏈構(gòu)成，無生理活性；連接亞基的非共價鍵主要為：疏水鍵、氫鍵和離子鍵。四級結(jié)構(gòu)分為均一的（含有相同的亞基）和不均一的（含有不同的亞基）兩類。維持亞基之間的化學(xué)鍵主要是疏水力。由多個亞基聚集而成的蛋白質(zhì)常常稱為寡聚蛋白；(Quaternary Structur

26、e)血紅蛋白(hemoglobin)的四級結(jié)構(gòu)兩個亞基的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中的共價鍵與次級鍵 一級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)超二級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域三級結(jié)構(gòu)亞基四級結(jié)構(gòu)共價鍵次級鍵化學(xué)鍵 肽鍵一級結(jié)構(gòu)氫鍵二硫鍵二、三、四級結(jié)構(gòu)疏水鍵鹽鍵范德華力三、四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中的共價鍵與次級鍵離子鍵氫鍵范德華力疏水相互作用力穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用力1、共價鍵蛋白質(zhì)分子中的共價鍵有肽鍵和二硫鍵。是生物大分子分子之間最強(qiáng)的作用力，化學(xué)物質(zhì)（藥物、毒物等）可以與生物大分子（受體蛋白或核酸）構(gòu)成共價鍵，共價鍵除非被體內(nèi)的特異性酶催化斷裂以外，很難恢復(fù)原形，是不可逆過程，對酶來講就是不可逆抑制作用。2、非共價鍵 生物體系中分子識別的過程不僅涉及

27、到化學(xué)鍵的形成，而且具有選擇性的識別。共價鍵存在于一個分子或多個分子的原子之間，決定分子的基本結(jié)構(gòu)，是分子識別的一種方式。而非共價鍵（又稱為次級鍵或分子間力）決定生物大分子和分子復(fù)合物的高級結(jié)構(gòu)，在分子識別中起著關(guān)鍵的作用。1),靜電作用 靜電作用是指荷電基團(tuán)、偶極以及誘導(dǎo)偶極之間的各種靜電吸引力。酶、核酸、生物膜、蛋白質(zhì)等生物大分子的表面都具有可電離的基團(tuán)和偶極基團(tuán)存在，很容易與含有極性基團(tuán)的底物或抑制劑等生成離子鍵和其它靜電作用離子鍵 生物大分子表面的帶電基團(tuán)可以與藥物或底物分子的帶電基團(tuán)形成離子鍵。這種鍵可以解離。偶極-偶極相互作用 兩個原子的電負(fù)性不同，產(chǎn)生價鍵電子的極化作用，成為持久

28、的偶極兩個偶極間的作用。偶極偶極相互作用的大小，取決于偶極的大小、它們之間的距離和相互位置。這種相互作用在水溶液中普遍存在。它的作用強(qiáng)度比離子偶極作用小，但比偶極誘導(dǎo)偶極作用大。這種作用對藥物受體相互作用的特異性和立體選擇性非常重要2)，氫鍵 氫鍵的形成 氫鍵是由兩個負(fù)電性原子對氫原子的靜電引力所形成，是一種特殊形式的偶極偶極鍵。它是質(zhì)子給予體X-H和質(zhì)子接受體Y之間的一種特殊類型的相互作用。 氫鍵的大小和方向 氫鍵的鍵能比共價鍵弱，比范德華力強(qiáng)，在生物體系中為8.433.4kj/mol(2-8kcal/mol)。鍵長為0.250.31nm，比共價鍵短。氫鍵的方向用鍵角表示，是指XH與HY之間

29、的夾角，一般為180250。 3)， 范德華力 這是一種普遍存在的作用力，是一個原子的原子核吸引另一個原子外圍電子所產(chǎn)生的作用力。它是一種比較弱的、非特異性的作用力。這種作用力非常依賴原子間的距離，當(dāng)相互靠近到大約0.40.6nm(46A)時，這種力就表現(xiàn)出較大的集合性質(zhì)。范德華力包括引力和排斥力，其中作用勢能與1/R6成正比的三種作用力（靜電力、誘導(dǎo)力和色散力）通稱為范德華引力。4),疏水作用 疏水作用是指極性基團(tuán)間的靜電力和氫鍵使極性基團(tuán)傾向于聚集在一起，因而排斥疏水基團(tuán)，使疏水基團(tuán)相互聚集所產(chǎn)生的能量效應(yīng)和熵效應(yīng)。蛋白質(zhì)和酶的表面通常具有極性鏈或區(qū)域，這是由構(gòu)成它們的氨基酸側(cè)鏈上的烷基鏈

30、或苯環(huán)在空間上相互接近時形成的。高分子的蛋白質(zhì)可形成分子內(nèi)疏水鏈、疏水腔或疏水縫隙，可以穩(wěn)定生物大分子的高級結(jié)構(gòu)。 三、 蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（一）蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的改變有可能影響它的功能，有些改變甚至引起其功能的完全喪失。而一級結(jié)構(gòu)的改變能否影響其生物功能，關(guān)鍵是看這種改變是否引起了構(gòu)象的改變。 進(jìn)行這方面的研究常用的方法有：同源蛋白質(zhì)氨基酸順序相似性分析、氨基酸殘基的化學(xué)修飾及切割實(shí)驗(yàn)等。例1 鐮刀形貧血?。╯ick-cell anemia）患者血紅細(xì)胞合成了一種不正常的血紅蛋白（Hb-S），它與正常的血紅蛋白（Hb-A）的差別：僅僅在于鏈的N-末端第6位殘

31、基發(fā)生了變化。（Hb-A）第6位殘基是極性谷氨酸殘基，（Hb-S）中換成了非極性的纈氨酸殘基，使血紅蛋白細(xì)胞收縮成鐮刀形，輸氧能力下降，易發(fā)生溶血。 這說明了蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的高度統(tǒng)一性。 體內(nèi)的某些蛋白質(zhì)分子初合成時，常帶有抑制肽，呈無活性狀態(tài)，稱為蛋白質(zhì)原.蛋白質(zhì)原的部分肽鏈以特定的方式斷裂后，才變?yōu)榛钚苑肿?例：胰島素，在剛合成時，是一個比成熟的胰島素分子大一倍多的單鏈多肽，稱為前胰島素原前胰島素原的N-末端有一段肽鏈，稱為信號肽.信號肽被切去，剩下的是胰島素原。胰島素原比胰島素分子多一段C肽，只有當(dāng)C肽被切除后才成為有51個殘基，分A、B兩條鏈的胰島素分子單體.例2 一級結(jié)構(gòu)的

32、局部斷裂與蛋白質(zhì)的激活(酶原的激活）例3 同源蛋白 同源蛋白：是指在不同有機(jī)體中實(shí)現(xiàn)同一功能的蛋白質(zhì).同源蛋白中的一級結(jié)構(gòu)中有許多位置的氨基酸對所有種屬來說都是相同的，稱為不變殘基；其他位置的氨基酸稱可變殘基.不同種屬的可變殘基有很大變化.可用于判斷生物體間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近.例：細(xì)胞色素C60 個物種中，有 27 個位置上的氨基酸殘基完全不變，是維持其構(gòu)象中發(fā)揮特有功能所必要的部位，屬于不變殘基.可變殘基可能隨著進(jìn)化而變異，而且不同種屬的細(xì)胞色素 C氨基酸差異數(shù)與種屬之間的親緣關(guān)系相關(guān)。親緣關(guān)系相近者，氨基酸差異少，反之則多（進(jìn)化樹）.（二）蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 1、蛋白質(zhì)的變性 一些物理

33、因素（如加熱、加壓、射線等）和化學(xué)因素（如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和有機(jī)溶劑等）會破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物活性的喪失，同時引起某些物理化學(xué)性質(zhì)的變化，如溶解度降低、發(fā)生沉淀等，這類現(xiàn)象叫蛋白質(zhì)的變性。 變性蛋白質(zhì)和天然蛋白質(zhì)在一級結(jié)構(gòu)上相同，只是空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，因而生物活性隨之喪失。 在有些情況下，變性作用是可逆的，只要除去變性因素，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)還可逐漸恢復(fù)，重新恢復(fù)其生物活性。變性蛋白質(zhì)分子恢復(fù)其天然形式，稱為復(fù)性。 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變會引起功能的改變！ 蛋白質(zhì)的熱變性是因?yàn)樵谳^高的溫度下，保持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的次級鍵斷裂，破壞了肽鍵特定的空間排列，原來在分子內(nèi)部的一些非極性疏水側(cè)鏈暴露

34、到分子表面，因而降低了蛋白質(zhì)分子的溶解度，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子間相互結(jié)合而凝聚，繼而形成不可逆的凝膠而凝固沉淀。 蛋白質(zhì)熱變性的機(jī)理：變性蛋白質(zhì)的特性溶解度顯著減小。不溶于水，在中性溶液中可沉淀或凝固，但溶于酸堿溶液。結(jié)晶及生物學(xué)活性皆消失。黏度和旋光性負(fù)值及分子的不對稱性增加，等電點(diǎn)提高。反應(yīng)基團(tuán)如SH-基、-S-S-基等數(shù)目增加。易被酶氧化。蛋白質(zhì)的凝固作用蛋白質(zhì)的凝固天然蛋白質(zhì)變性后，變性蛋白質(zhì)分子互相凝聚或互相穿插纏結(jié)在一起的現(xiàn)象。凝固作用分兩個階段： 第一階段：變性。 第二階段：失去規(guī)律的肽鏈聚集纏結(jié)在一起而凝固或結(jié)絮。 例：雞蛋加熱。 熱殺菌。思考題： 如何辯證的看待蛋白質(zhì)的變性和凝固作

35、用（從生命現(xiàn)象、人類生活和生產(chǎn)各方面考慮）？2、蛋白質(zhì)的變構(gòu)效應(yīng)（別構(gòu)效應(yīng)，allosteric effect） 多亞基蛋白質(zhì)（四級結(jié)構(gòu)）中的一個亞基空間結(jié)構(gòu)的改變會引起其它亞基空間結(jié)構(gòu)的改變，從而使蛋白質(zhì)功能和性質(zhì)發(fā)生一定的改變，叫蛋白質(zhì)的變（別）構(gòu)效應(yīng)。 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系舉例：1、折疊病。2、瘋牛病。 -螺旋-折疊正常蛋白質(zhì)朊病毒未知因素瘋牛病侵入牛腦蛋白質(zhì)構(gòu)象改變 3.4 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)一、分子質(zhì)量 蛋白質(zhì)相對分子量在10 0001 000 000之間。測定分子量的主要方法有滲透壓法、超離心法、凝膠過濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。1、最準(zhǔn)確可靠的方法-超離心法（Svedberg

36、于1940年設(shè)計） 蛋白質(zhì)顆粒在60 00080 000r/min的高速離心力作用下，蛋白質(zhì)分子會沿旋轉(zhuǎn)中心向外周方向移動，用光學(xué)方法測定界面移動的速度即為蛋白質(zhì)的離心沉降速度。蛋白質(zhì)的沉降速度與分子大小和形狀有關(guān)。沉降系數(shù)是溶質(zhì)顆粒在單位離心場中的沉降速度，用S表示。一個S單位，為110-13秒相對分子質(zhì)量越大，S值越大蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)：1200S s = v2x v =沉降速度（dx/dt）=離心機(jī)轉(zhuǎn)子角速度（弧度/s） x =蛋白質(zhì)界面中點(diǎn)與轉(zhuǎn)子中心的距離（cm）蛋白質(zhì)分子量（M）與沉降系數(shù)（s）的關(guān)系：M = RTsD（1V）R氣體常數(shù)（8.314107ergsmol -1 度-1）T

37、絕對溫度D擴(kuò)散常數(shù)（蛋白質(zhì)分子量很大，離心機(jī)轉(zhuǎn)速很快，則忽略不計）V蛋白質(zhì)的微分比容（m3g-1）溶劑密度（20，gml-1） s沉降系數(shù)2.凝膠過濾法凝膠過濾所用介質(zhì)為凝膠珠，其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。一定型號的凝膠網(wǎng)孔大小一定，只允許相應(yīng)大小的分子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，大分子則被排阻在外。洗脫時大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來，洗脫液體積小；小分子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來穿去，歷程長，后洗脫下來，洗脫體積大。測定蛋白質(zhì)分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex。測得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的洗脫體積。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出樣品蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量。3.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法SDS:十二烷基硫酸鈉，變性劑。普通

38、蛋白質(zhì)電泳的泳動速率取決于荷質(zhì)比（凈電荷、大小、形狀）。用SDS和巰基乙醇（打開二硫鍵）處理，蛋白質(zhì)變性（肽鏈伸展）并與SDS結(jié)合，形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。不同蛋白質(zhì)分子的均帶負(fù)電（SDS帶負(fù)電）；且荷質(zhì)比相同（蛋白質(zhì)分子大，結(jié)合SDS多；分子小，結(jié)合SDS少）不同蛋白質(zhì)分子具有相似的構(gòu)象。用幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的對數(shù)值對它們的遷移率作圖。測出待測樣品的遷移率。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的相對分子質(zhì)量。影響遷移率的主要因素凝膠的分子篩效應(yīng)對長短不同的棒形分子會 產(chǎn) 生不同的阻力主要因素凝膠的濃度和交聯(lián)度同一電泳條件下，分子小，受阻小，游動快，遷移率大。相對分子質(zhì)量大者，遷移率小 優(yōu)點(diǎn)：快速，

39、樣品用量少，可同時測幾個樣品 缺點(diǎn)：誤差大，約為10（誤差主要來源于遷移距離的測量誤差） 此方法只能測得 亞基肽鏈的相對分子質(zhì)量+ -+1）圓盤電泳：玻璃管中進(jìn)行的凝膠電泳。2）平板電泳：鋪有凝膠的玻板上進(jìn)行的電泳。等電聚焦電泳：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在其等電點(diǎn)時，凈電荷為零，在電場中不再移動。+5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度通電+二、滲透壓和透析 由于蛋白質(zhì)的分子量很大，蛋白質(zhì)溶液的摩爾濃度一般是很小的。所以蛋白質(zhì)溶液的滲透壓很低。 將混有小分子化合物（如無機(jī)鹽、單糖、雙糖、氨基酸、短肽以及表面活性劑等）的蛋白質(zhì)溶液盛入半透膜內(nèi)放入透析液（通常為蒸餾水或緩沖液）中，由于蛋白質(zhì)

40、分子體積大，不能透過半透膜，而溶液中的其他小分子物質(zhì)則能透過半透膜進(jìn)入透析液中，從而使蛋白質(zhì)與小分子物質(zhì)完全分開，這個分離過程叫透析（Dialysis）。 常用的半透膜有玻璃紙或高分子合成材料。此法是蛋白質(zhì)分離純化中常用的簡便方法之一。三、膠體性質(zhì) 由于蛋白質(zhì)的分子量很大，它在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如丁達(dá)爾現(xiàn)象、布郎運(yùn)動等。蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定的原因：1）表面形成水膜（水化層）； 2）帶相同電荷（雙電層） 。四、兩性解離和等電點(diǎn) 蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點(diǎn)。 在堿性介質(zhì)（pHpI）中，蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷； 在酸性介質(zhì)（pHpI）中，蛋白質(zhì)分子帶正

41、電荷。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子處于某一pH值的環(huán)境時，所帶正、負(fù)電荷恰好相等，即凈電荷為零，呈兩性離子狀態(tài)，此時溶液的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）。在等電點(diǎn)時(pI)，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場中不移動。五、蛋白質(zhì)的電泳 帶電的蛋白質(zhì)膠粒，在電場中向與自身所帶電荷相反的電極泳動的現(xiàn)象，稱為蛋白質(zhì)的電泳。電泳的速度取決于蛋白質(zhì)顆粒大小和所帶電荷的多少。在一定的pH條件下，各蛋白質(zhì)所帶電量不同，在電場中就會以不同速度泳動，根據(jù)這一原理可將混合蛋白質(zhì)予以分離。1. 自由界面電泳：蛋白質(zhì)溶于緩沖液中進(jìn)行電泳。2. 區(qū)帶電泳：將蛋白質(zhì)溶液點(diǎn)在浸了緩沖液的支持物上進(jìn)行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域。（1）紙上電泳

42、：用濾紙作支持物。（2）凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。1）圓盤電泳：玻璃管中進(jìn)行的凝膠電泳。2）平板電泳：鋪有凝膠的玻板上進(jìn)行的電泳。六、蛋白質(zhì)的沉淀 因此，蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性是有條件的，相對的。假若改變環(huán)境條件，水膜和電荷一旦被除去時，蛋白質(zhì)就會聚集在一起而形成較大的蛋白質(zhì)團(tuán)，最后從溶液中沉淀出來。 通過向蛋白質(zhì)溶液中加電解質(zhì)中和電荷，加脫水劑破壞水化層，或調(diào)節(jié)溶液pH值到蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，都可以引起蛋白質(zhì)的沉淀。蛋白質(zhì)在溶液中靠水化層和雙電層保持其穩(wěn)定性。在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱膒H或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。在沉淀過程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變

43、化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀?？赡娉恋硎欠蛛x和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等?？赡娉恋碓趶?qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。如加熱沉淀、強(qiáng)酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。不可逆沉淀1.鹽析 向蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽如NaCl、KCl、Na2SO4等時，可產(chǎn)生兩種現(xiàn)象：鹽溶：在鹽濃度很低的范圍內(nèi)，隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)的溶解度也隨之增加，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。 機(jī)理：蛋白質(zhì)表面電荷吸附鹽離子后，增加了蛋白質(zhì)和水的親和力，促進(jìn)了蛋白質(zhì)的溶解。鹽析：與鹽溶作用相反，當(dāng)溶液中鹽濃度提高到一定的飽和度時，蛋白質(zhì)溶