新生大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞的體外培養(yǎng)

1、新生大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞的體外培養(yǎng)謝裕華易春智項曉偉劉建仁【摘要】目的建立新生大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞體外培養(yǎng)的方法。方法選用出生后24h內(nèi)的SD大鼠，別離大鼠大腦皮質(zhì)細胞，參加含體積分數(shù)10%胎牛血清的高糖DE培養(yǎng)基培養(yǎng)，于倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長形態(tài);取傳代培養(yǎng)的第3代細胞，采用計數(shù)板計數(shù)法和四甲基偶氮唑鹽(TT)法檢測細胞生長情況。結(jié)果從新生大鼠大腦皮質(zhì)別離的細胞生長旺盛，星形膠質(zhì)細胞形態(tài)典型，未見其他種類細胞生長。結(jié)論建立了一種簡單易行的大鼠星形膠質(zhì)細胞體外培養(yǎng)方法。【關(guān)鍵詞】星形膠質(zhì)細胞/病理學(xué)細胞培養(yǎng)體外的大鼠星形膠質(zhì)細胞功能廣泛，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、突觸傳遞、神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的

2、穩(wěn)定和新陳代謝等中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種正常生理活動，以及神經(jīng)疾病的病理機制中都起著非常重要的作用1,神經(jīng)膠質(zhì)細胞是構(gòu)成神經(jīng)組織的兩大類細胞之一，也是神經(jīng)組織內(nèi)的一種支持成分，其生物學(xué)作用受到重視。近年來發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞除參與神經(jīng)元與毛細血管間的物質(zhì)運輸以及神經(jīng)組織損傷時分裂增殖膠質(zhì)疤痕的形成外，也有營養(yǎng)神經(jīng)及抑制神經(jīng)生長的功能2-3。本實驗建立了一種培養(yǎng)新生大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞的方法,以期為神經(jīng)膠質(zhì)細胞膜功能蛋白質(zhì)組學(xué)的研究建立基?，F(xiàn)報道如下。1材料與方法1.1動物新生24h的SD大鼠2只，由廣東省實驗動物中心提供，合格證號：SXK(粵)20220001。1.4傳代培養(yǎng)細胞生長了810d后,在

3、顯微鏡下可見細胞長滿瓶底90%。向每個培養(yǎng)瓶中參加1.25g/L的胰蛋白酶1L消化34in，消化時在顯微鏡下親密觀察,防止消化過度導(dǎo)致細胞死亡。待細胞脫壁后,用含體積分數(shù)10%胎牛血清的高糖DE培養(yǎng)基終止消化。將細胞懸液移入10L離心管中,以1000r/in離心10in去上清后重新參加含血清培養(yǎng)基，吹打均勻，將細胞懸液接種至底壁面積為252的培養(yǎng)瓶中，接種密度為1106個/2，置培養(yǎng)箱中，37、體積分數(shù)5%2飽和濕度條件下培養(yǎng),每23d換液1次，待細胞長滿瓶底90%以上時再次進展傳代培養(yǎng)。1.5細胞生長情況1.5.1計數(shù)板計數(shù)將血球計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。吸出少許細胞懸液，

4、滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間，靜置3in。鏡下觀察，計算計數(shù)板4大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側(cè)和上方的。然后按公式計算：n細胞(個L-1)=n細胞總數(shù)/410000。鏡下偶見由2個以上細胞組成的細胞團，應(yīng)按單個細胞計算，假設(shè)細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。1.5.2四甲基偶氮唑鹽(TT)比色法取培養(yǎng)第3代細胞，制成單細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，103104/孔，每塊板接種10孔，一共接種6塊96孔培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)基總量200L，37、體積分數(shù)5%2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);分別于第1、2、3、5、7天參加2g/L的TT液(50L/孔),繼續(xù)培養(yǎng)3h，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，參

5、加二甲基亞砜(DS)液150L/孔，將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振蕩10in，使結(jié)晶物溶解，酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度(D)值(檢測波長490n)。記錄結(jié)果，繪制細胞生長曲線。2結(jié)果2.1細胞形態(tài)倒置相差顯微鏡下活體觀察見星形膠質(zhì)細胞的別離純化過程中細胞生長情況與國外文獻報道一致4-5，星形膠質(zhì)細胞生長良好，細胞貼壁后開場生長繁殖，胞體不斷增大，突觸不斷增多，并且細胞之間形成廣泛的聯(lián)絡(luò)。原代別離的大鼠大腦皮層細胞在種植24h后，所有細胞均已貼壁，光暈明顯。培養(yǎng)34d后，細胞數(shù)量增多。隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)物中的星形膠質(zhì)細胞的比例越來越大，而神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞的比例越來越少。傳代后的細胞貼壁更快，一

6、般6h左右大局部貼壁，第2天可以看到細胞開場鋪開生長(圖1-a)，第3天細胞突起明顯，第5天細胞突觸互相接觸，細胞生長呈倍數(shù)增長，細胞數(shù)量和體積增大，細胞之間有廣泛的接觸(圖1-b、)，第78天細胞生長到達頂峰(圖-d)，以后細胞生長在形態(tài)和數(shù)量上變化不大。3討論星形膠質(zhì)細胞是神經(jīng)組織內(nèi)數(shù)量最多、分布最廣的膠質(zhì)細胞。由于星形膠質(zhì)細胞的分裂頂峰發(fā)生在動物胚胎晚期及出生以后，故純化星形膠質(zhì)細胞的材料來源一般選擇出生以后的新生動物6。在原代別離的腦神經(jīng)細胞懸液中，不可防止有神經(jīng)膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元、成纖維細胞以及少量血細胞等。對于培養(yǎng)物中的神經(jīng)元，一方面由于實驗動物取自新生大鼠，神經(jīng)元不再分裂;另一方面

7、由于神經(jīng)元在體外不易存活，需要膠原、多聚賴氨酸等黏附底物，更難以傳代，所以通過傳代即可除去神經(jīng)元。其他如成纖維細胞、少量血細胞等由于所占比例少，隨著傳代而逐漸被淘汰。本實驗采用簡單易行的方法培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞。參考既往文獻發(fā)現(xiàn)，許多研究在培養(yǎng)細胞時參加特定的試劑如多種血清、神經(jīng)生長因子等物質(zhì)，對培養(yǎng)瓶也進展多種處理，這樣一方面使實驗過程復(fù)雜化，另一方面過多的物質(zhì)對于培養(yǎng)的細胞會產(chǎn)生相關(guān)的影響，從而會對以后的實驗造成影響。許多文獻在提取大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細胞過程中使用濾網(wǎng)，其目的是盡量減少雜質(zhì)混入細胞懸液中。但是，使用濾網(wǎng)一方面在細胞濾過時必定使用較大的推力，容易造成細胞的變形和死亡，另一方面容易造成污染。本研究結(jié)果說明培養(yǎng)過程中最重要的是無菌操作，培養(yǎng)液選用高糖DE參加體積分數(shù)10%胎牛血清，在這種條件下細胞生長良好，到達體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞的目的，根本上與體內(nèi)形態(tài)一致，與張蕓等7所得到的結(jié)果相似。對于細胞的形態(tài)學(xué)觀察和記錄可采用一種簡單易行的方法，在倒置顯微鏡下得到較好的觀察圖片后，可以用數(shù)碼相機的鏡頭對準(zhǔn)目鏡，通過拍攝而得到相關(guān)相片資料，其效果良好。目前已經(jīng)發(fā)如今體腦內(nèi)星形膠質(zhì)細胞間存在大量縫隙連接，允許小分子物質(zhì)和多種離子等在細胞間的轉(zhuǎn)運，膠質(zhì)網(wǎng)絡(luò)-胞外活性分子-神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)三者之間分子程度和