第四章 第2部分肉毒梭菌副溶血性弧菌蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)

1、第四章 第2部分肉毒梭菌副溶血性弧菌蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)2、培養(yǎng)特性最嚴(yán)格的厭氧菌 生長最適溫度：28 37 ：pH為6.87.6，產(chǎn)毒的最適pH。產(chǎn)毒培養(yǎng)溫度：不同菌型產(chǎn)毒的最適培養(yǎng)溫度不完全相同。C、D型溫度高些為宜，35 培養(yǎng)3d即可，而E型菌低溫度長時(shí)間培養(yǎng)效果較好。對(duì)營養(yǎng)要求不高 ：在普通培養(yǎng)基上都能生長。 肉毒梭狀芽孢桿菌菌落 在固體培養(yǎng)基表面上，形成類圓形，邊緣不整齊，約3毫米左右的菌落。菌落半透明，表面一般比較光滑也有的呈顆粒狀，界線不明顯，向外擴(kuò)散。呈絨毛網(wǎng)狀，常常擴(kuò)散成菌苔。肉毒梭菌的生化性狀很不規(guī)律，即使同型，也常見到株間的差異。3、肉毒梭菌的生化特性 表1 各型肉毒梭菌的生

2、化反應(yīng)二、肉毒梭菌的致病性 肉毒梭菌能產(chǎn)生外毒素即肉毒毒素（大分子蛋白），根據(jù)毒素的抗原特異性將其分為A、B、C （1、2） 、D、E、F、G七個(gè)型別。與毒素型別相對(duì)應(yīng)，肉毒梭菌也分為同樣的七個(gè)型別。其中A、B、E、F四型毒素對(duì)人有不同程度的致病性。 A型毒素經(jīng)602分鐘加熱，差不多能被完全破壞，而B、E二型毒素要經(jīng)702分鐘才能被破壞；C、D二型毒素對(duì)熱的抵抗更大些；C型毒素要經(jīng)過902分鐘加熱才能完全破壞，不論如何，只要煮沸1分鐘或75加熱510分鐘，毒素都能被完全破壞。肉毒毒素對(duì)酸性反應(yīng)比較穩(wěn)定，對(duì)堿性反應(yīng)比較敏感。某些型的肉毒毒素在適宜條件下，毒性能被胰酶激活和加強(qiáng)。 肉毒毒素是一種神

3、經(jīng)麻痹毒素，主要抑制神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿，引起肌肉松弛麻痹，特別是呼吸肌麻痹導(dǎo)致死亡。 肉毒毒素的毒性極強(qiáng)，是目前已知在天然毒素和合成毒劑中毒性最強(qiáng)的生物毒素，據(jù)稱，精制毒素1克能殺死400萬噸小白鼠，一個(gè)人的致死量大概1微克左右。 肉毒中毒一年四季均可發(fā)生。美國以罐頭發(fā)生中毒較多，日本以水產(chǎn)品較多；我國以發(fā)酵食品（如：臭豆腐、豆瓣醬、豆豉等）發(fā)生中毒較多。 三、檢驗(yàn)方法1、檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)：2、培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基：庖肉培養(yǎng)基、卵黃瓊脂培養(yǎng)基、明膠磷酸鹽緩沖液。試劑： 肉毒分型抗毒診斷血清、胰酶（活力1:250）、革蘭氏染色液。 另需實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（小白鼠）。3、檢驗(yàn)程序檢 樣毒素檢測增菌、產(chǎn)毒培養(yǎng)30，5

4、 d報(bào)告（一）毒素檢測報(bào)告（二）分離培養(yǎng)培養(yǎng)檢查毒素檢測報(bào)告（三）增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)30，5 d 觀察生長性狀，染色鏡檢觀察菌落性狀染色鏡檢報(bào)告(一)：檢樣中有無肉毒毒素以及有何型肉毒毒素。(如僅為了肉毒中毒診斷，即可結(jié)束檢驗(yàn))報(bào)告(二)：對(duì)增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)物，一方面做生長特性觀察，同時(shí)檢測肉毒毒素。報(bào)告檢樣中有無肉毒梭菌以及有何型肉毒梭菌。（有些樣品如土壤、泥沙等基本上不可能含有毒素，則應(yīng)從培養(yǎng)著手）報(bào)告(三)：欲獲純菌株，可用增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)物進(jìn)行分離培養(yǎng)，對(duì)所得純菌株進(jìn)行形態(tài)、培養(yǎng)特性等觀察及毒素檢測，其結(jié)果可證明所得純菌為何型肉毒梭菌。（一般情況下，沒有必要從檢樣中分離純的菌株，但研究或特殊需要例外

5、）（1）、肉毒毒素檢測注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24 h內(nèi)發(fā)病、死亡。液態(tài)或固體樣品經(jīng)過適當(dāng)處理后離心，取上清液實(shí)驗(yàn) 上清液及其胰酶激活處理液 分別進(jìn)行小白鼠腹腔注射，各3只，每只0.5 mL，觀察4 d 確證試驗(yàn)毒力測定 定型試驗(yàn) 取庖肉培養(yǎng)基五支，煮沸10min15min，做如下處理：第一支：急速冷卻，接種檢樣均質(zhì)液1 mL2 mL；第二支：冷卻至60，接種檢樣，繼續(xù)于60保溫10 min，急速冷卻；第三支：接種檢樣，繼續(xù)煮沸加熱10 min，急速冷卻。第四支：急速冷卻，接種肉毒梭菌菌種。第五支：急速冷卻，作為空白對(duì)照。 以上5支試管于30厭氧培養(yǎng)5d，若無生長，可再培

6、養(yǎng)10d。培養(yǎng)到期，若有生長，取培養(yǎng)液離心，以其上清液進(jìn)行毒素檢測試驗(yàn)，方法同上，陽性結(jié)果證明檢樣中有肉毒梭菌存在。（2）、肉毒梭菌的檢出（增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)試驗(yàn)） 選取證實(shí)含有肉毒毒素的增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)物（必要時(shí)可重復(fù)一次適宜的加熱處理）接種卵黃瓊脂平板，35厭氧培養(yǎng)48 h。肉毒梭菌在卵黃瓊脂平板上生長時(shí)，菌落及周圍培養(yǎng)基表面覆蓋著特有的虹彩樣(或珍珠層樣)薄層，但G型菌無此現(xiàn)象。 根據(jù)菌落形態(tài)及菌體形態(tài)挑取可疑菌落，接種庖肉培養(yǎng)基，于30培養(yǎng)5d，進(jìn)行毒素檢測及培養(yǎng)特性檢查確證試驗(yàn)。（3）、分離培養(yǎng)（1）毒素檢測：試驗(yàn)方法同上。（2）培養(yǎng)特性檢查：接種卵黃瓊脂平板，分成兩份，分別在35的需氧和厭氧

7、條件下培養(yǎng)48 h，觀察生長情況及菌落形態(tài)。肉毒梭菌只在厭氧條件下生長而在需氧條件下不生長。4、結(jié)果報(bào)告報(bào)告(一)：檢樣含有某型肉毒毒素。報(bào)告(二)：檢樣含有某型肉毒梭菌。報(bào)告(三)：由樣品分離的菌株為某型肉毒梭菌。 肉毒梭菌檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)主要是毒素，不論食品中的肉毒毒素檢驗(yàn)還是肉毒梭菌檢驗(yàn)，均以毒素的檢測及定型試驗(yàn)為判定的主要依據(jù)。第五節(jié)、副溶血性弧菌檢驗(yàn)一、生物學(xué)特性1、形態(tài)與染色 革蘭氏陰性無芽胞多形態(tài)桿菌或稍彎曲弧菌 ，有時(shí)呈棒狀、甚至球狀、絲狀等。單端鞭毛。無芽胞、無莢膜。 2、培養(yǎng)特性需氧或兼性厭氧嗜鹽，在2%NaCL培養(yǎng)基中生長最好，無鹽或食鹽10%不能生長。最適溫度36，在固體培養(yǎng)基

8、上菌落呈圓形凸起，混濁不透明，表面光滑，較濕潤，邊緣不整齊。在血平板上可見溶血環(huán)。 3、生化特性分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解乳糖，蔗糖。H2S（）、V-P（）、靛基質(zhì)（+）、精氨酸（）甲基紅（+）、賴氨酸（）、溶血/-O抗原：O1O13 13種。H抗原：K抗原：K1K71 65種。（ 缺編：K2 、 K14 、K17、 K35、 K62）血清分型：所有副溶血性弧菌的H 抗原均相同，但是O 抗原和K 抗原存在差異，以13種O抗原及65種K抗原將其分為13個(gè)群和845個(gè)型。4、抗原結(jié)構(gòu)二、致病性1、致病因素侵襲力：活菌(105107/g)，可使人致病 .產(chǎn)生溶血毒素：耐熱性溶血毒素(THD)和耐熱

9、性溶血毒素相關(guān)的溶血毒素(TRH)，此外有的可產(chǎn)生不耐熱溶血毒素(TLH)。 2、媒介食品 主要是海產(chǎn)品（魚、蝦、蟹、蛤等），含鹽量較高的食物亦可帶菌。3、所致疾病 食物中毒、急性胃腸炎、敗血癥等。 1、檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)：GB/T 4789.7-2008 副溶血性弧菌檢驗(yàn)2、培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基：3氯化鈉堿性蛋白陳水APW) 、 硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂 3氯化鈉胰蛋白胨大豆TSA）瓊脂 3氯化鈉三糖鐵（TSI）瓊脂 嗜鹽性試驗(yàn)培養(yǎng)基 3氯化鈉甘露醇試驗(yàn)培養(yǎng)基 3氯化鈉賴氨酸脫狡酶試驗(yàn)培養(yǎng)基 3氯化鈉MR-VP培養(yǎng)基 我妻氏血瓊脂、弧菌顯色培養(yǎng)基試劑：氧化酶試劑、革蘭氏染色液、O

10、NPG試劑、3%氯化鈉溶液、 V-P試劑、API20E生化鑒定試劑盒等。三、檢驗(yàn)方法3、檢驗(yàn)程序（1）樣品處理及培養(yǎng) 定量測定：樣品用3%氯化鈉蛋白胨水 10倍連續(xù)稀釋后取三個(gè)稀釋度各接3支含有該培養(yǎng)基的試管，培養(yǎng)。 定性檢測：用上述1:10稀釋液增菌培養(yǎng)。（2）分離：有菌生長的試管分別接種TCBS平板或弧菌顯色培養(yǎng)基平板上劃線分離、培養(yǎng)。（3）純培養(yǎng)：挑可疑菌落劃線分離。（4）初步鑒定：生化實(shí)驗(yàn)和鏡檢鑒定。（5）確定鑒定：生化試驗(yàn)鑒定。（6）報(bào)告 定性檢測或定量檢測。（7）血清學(xué)分型：（選做）（8）神奈川試驗(yàn)： 分離：在所有顯示生長的試管或增菌液中用接種環(huán)沾取一環(huán)，劃線分離。副溶血性弧菌在T

11、CBS瓊脂平板上的典型菌落：圓形、半透明、表而光滑、質(zhì)感類似口香糖、直徑2mm3mm的綠色菌落。（培養(yǎng)基中含溴麝香草酚蘭和H2S指示劑 ，因副溶血性弧菌不分解蔗糖、不產(chǎn)H2S，為綠色菌落）副溶血性弧菌混合菌種副溶血性弧菌在弧菌顯色培養(yǎng)基上典型菌落特征：呈圓形、半透明、表面光滑的粉紫色菌落，直徑2mm3mm。初步鑒定：挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，進(jìn)行副溶血性弧菌的初步鑒定：副溶血性弧菌：氧化酶試驗(yàn)：陽性。涂片鏡檢：G-，棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態(tài)，無芽胞，有鞭毛。3氯化鈉三糖鐵斜面 ：底層變黃不變黑，無氣泡，斜面顏色不變或紅色加深，有動(dòng)力。嗜鹽性試驗(yàn)：分別接種于不同氯化鈉濃度的胰胨水中培養(yǎng)，在無氯

12、化鈉和10氯化鈉的胰胨水中不生長或微弱生長，在7氯化鈉的胰胨水中生長旺盛。生化試驗(yàn)：分別接種各類生化培養(yǎng)基，培養(yǎng)后觀察結(jié)果?；駻PI20E生化鑒定試劑盒或VITEK全自動(dòng)微生物檢測系統(tǒng)鑒定。生化性狀符合下表要求時(shí)，為副溶血性弧菌 。確定鑒定:項(xiàng)目 結(jié)果項(xiàng)目 結(jié)果革蘭氏染色鏡檢陰性，無芽孢乳糖 氧化酶 硫化氫動(dòng)力 賴氨酸脫梭酶 蔗糖V-P 葡萄糖 ONPG 甘露醇分解葡萄糖產(chǎn)氣 表 副溶血性弧菌的生化性狀定性檢測：報(bào)告25g（ml）樣品中是否檢出副溶血性弧菌。定量檢測：根據(jù)證實(shí)為副溶血性弧菌陽性的試管管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每克（毫升）副溶血性弧菌的MPN值。報(bào)告：神奈川試驗(yàn)： 測試副溶血性弧

13、菌分離株是否存在特定溶血素（與致病性顯著相關(guān)）。將測試菌點(diǎn)種在我妻氏血瓊脂平板上，培養(yǎng)后觀察是否有溶血現(xiàn)象。陽性結(jié)果為菌落周圍呈半透明環(huán)的溶血。 第六節(jié)、蠟樣芽胞桿菌（一）生物學(xué)特性1、形態(tài)與染色 革蘭氏陽性大桿菌，寬度在1 m或1 m以上，芽孢呈卵圓形，不突出菌體，多位于菌體中央或稍偏于一端。需氧，最適生長溫度3032。在肉湯中混濁生長，有菌膜或壁環(huán)，振搖易乳化。在普通瓊脂平板上，菌落灰白色，不透明，邊緣不整齊，表面粗糙，呈毛玻璃狀或白蠟狀。 在血平板上，菌落呈淺灰色，不透明，似白色毛玻璃狀，有溶血環(huán)。在甘露醇卵黃多粘菌素平板上，菌落呈粉紅色，具有白色混濁環(huán)（不發(fā)酵甘露醇、產(chǎn)生卵磷脂酶）2、

14、培養(yǎng)特性能分解葡萄糖，麥芽糖，蔗糖，水楊苷，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。不分解乳糖，甘露醇，阿拉伯糖，山梨醇，木糖H2S（-），尿素酶試驗(yàn)（-）卵磷脂酶（+）， V-P試驗(yàn)（+），液化明膠。3、生化反應(yīng) 食品蠟樣芽胞桿菌數(shù)量106/g（mL）時(shí)常可導(dǎo)致食物中毒，導(dǎo)致中毒的主要原因是其產(chǎn)生的腸毒素 。腸毒素類型：耐熱性腸毒素：10030min不能被破壞，常在米飯中形成。不耐熱腸毒素：能在各種食物中形成。臨床癥狀：食物中毒，分為嘔吐型和腹瀉型兩類。二、致病性三、檢驗(yàn)方法1、檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)； GB 4789.142003 2、培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基:肉浸液肉湯培養(yǎng)基 酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基動(dòng)力-硝酸鹽培養(yǎng)基 緩沖葡萄糖蛋白胨水血瓊

15、脂培養(yǎng)基 木糖-明膠培養(yǎng)基甘露醇卵黃多粘菌素(MYP)瓊脂培養(yǎng)基、試劑：0.5%堿性復(fù)紅染色液、革蘭氏染色液、3%過氧化氫溶液、甲萘胺-乙酸溶液、對(duì)氨基苯磺酸-乙酸溶液。3、檢驗(yàn)程序361 12 h 20 h37，18 h 24 h361 12 h 20 h檢 樣25 g（mL）加225 mL生理鹽水菌數(shù)計(jì)算做成10-110-5的稀釋液選擇性培養(yǎng)基（分離培養(yǎng)）MYP營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基生長及菌落觀察染色鏡檢生化試驗(yàn)菌株保存報(bào) 告選擇性培養(yǎng)基（菌數(shù)測定）MYP包括四個(gè)步驟：菌數(shù)測定:涂布甘露醇卵黃多粘菌素（MYP） 平板計(jì)數(shù)。分離培養(yǎng):從MYP上 挑可疑菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。 證實(shí)實(shí)驗(yàn):包括形態(tài)觀察、培養(yǎng)特

16、性、生化性狀和生化分型試驗(yàn)。與類似菌的鑒別：主要是與蘇云金芽孢桿菌的鑒別。結(jié)果報(bào)告：報(bào)告每g（mL）檢樣中所含的蠟樣芽孢桿菌數(shù)。 將樣品稀釋液0.1 mL涂布于甘露醇卵黃多粘菌素（MYP）瓊脂平板上培養(yǎng)后，選取適當(dāng)菌落數(shù)的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)后，從中挑取5個(gè)典型菌落做證實(shí)試驗(yàn)。根據(jù)證實(shí)的蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)計(jì)算出該平板上的菌落數(shù)。蠟樣芽孢桿菌數(shù)=可疑菌落數(shù)證實(shí)為陽性菌落數(shù)的比例稀釋倍數(shù)10菌數(shù)測定：MYP培養(yǎng)基中含有卵黃、甘露醇、多粘菌素和pH指示劑酚紅等。多粘菌素可抑制雜菌的生長。蠟樣芽孢桿菌不發(fā)酵甘露醇，菌落為粉紅色（否則為黃色）。該菌產(chǎn)生卵磷脂酶，由于脂肪和卵磷脂被分解，在菌落周圍產(chǎn)生粉紅

17、色的暈。分離培養(yǎng)和證實(shí)試驗(yàn): 分離培養(yǎng)：從MYP平板上挑可疑菌落到營養(yǎng)瓊脂上進(jìn)行純培養(yǎng)。證實(shí)試驗(yàn)：（1）形態(tài)觀察（2）培養(yǎng)特性（3）生化性狀及生化分型生化性狀 本菌有動(dòng)力；能產(chǎn)生卵磷脂酶和酪蛋白酶；過氧化氫酶試驗(yàn)陽性；溶血；不發(fā)酵甘露醇和木糖；常能液化明膠和使硝酸鹽還原；在厭氧條件下能發(fā)酵葡萄糖。生化分型 根據(jù)蠟樣芽孢桿菌對(duì)檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、淀粉水解、V-P反應(yīng)、明膠液化性狀的試驗(yàn)，分成不同的型別。型 別生 化 試 驗(yàn)檸檬酸鹽利用硝酸鹽還原淀粉水解V-P反應(yīng)明膠液化123456789101112131415表1 蠟樣芽孢桿菌生化分型表2 蠟樣芽孢桿菌與其他類似菌的鑒別項(xiàng) 目巨大芽孢桿菌

18、蠟樣芽孢桿菌蘇云金芽孢桿菌蕈狀芽孢桿菌炭疽芽孢桿菌過氧化氫酶動(dòng)力硝酸鹽還原酪蛋白分解卵黃反應(yīng)葡萄糖利用（厭氧）甘露醇木糖溶血已知致病菌特性/產(chǎn)生腸毒素/對(duì)昆蟲致病的內(nèi)毒素結(jié)晶/假根樣生長/對(duì)動(dòng)物和人致病 注： 90%100%的菌株陽性； 90%100%的菌株陰性；/ 大多數(shù)菌株陽性；/ 大多 數(shù)菌株陰性。與類似菌鑒別：鑒別： 蠟樣芽孢桿菌在形態(tài)以及生化性狀上與蘇云金芽孢桿菌極為相似 ，要進(jìn)行鑒別。主要是通過觀察伴孢晶體來判斷，蘇云金芽孢桿菌有伴孢晶體，蠟樣芽孢桿菌無。蘇云金芽孢桿菌及其伴孢晶體蠟樣芽孢桿菌第七節(jié)、其它致病菌的檢驗(yàn)一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)GB 4789.30-2010 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)二、致瀉性大腸埃希氏菌檢驗(yàn)GB/T 4789.6-2003 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)三、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)GB/T 4789.8-2008 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)四、空腸彎曲菌檢驗(yàn)GB/T 4789.9-200