細(xì)胞膜色譜法及其在中藥篩選研究中的應(yīng)用-藥物分析園地-西安交通

1、細(xì)胞膜色譜法及其在中藥篩選研究中的應(yīng)用賀浪沖，楊廣德，梁明金，王嗣岑（西安交通大學(xué)，西安 710061）賀浪沖等創(chuàng)立了一種新的生物親合色譜方法一細(xì)胞膜色譜法（Cell MembraneChromatography, CMC） 1, 2,多年來(lái)對(duì)其基礎(chǔ)理論、實(shí)驗(yàn)方法和應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了 系統(tǒng)、深入地研究3, 4,并不斷完善和提高。已經(jīng)成為繼經(jīng)典放射性配體方法之 后，又一種新的受體藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究方法， 并成功地用于對(duì)中藥復(fù)雜體系中物質(zhì) 基礎(chǔ)的篩選研究。從1996年起，已將高通量色譜分離制備技術(shù)和受體細(xì)胞膜色 譜篩選技術(shù)用于中藥復(fù)雜體系中藥效物質(zhì)篩選與研究之中。通過(guò)對(duì)123種中藥材、60種陜西秦巴山區(qū)藥

2、用植物進(jìn)行了快速有效的篩選，已發(fā)現(xiàn) 12種中藥材和 8種植物中的36個(gè)有效成分對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞上的鈣通道受體、大腦 細(xì)胞上的B受體、胰島B-細(xì)胞和A細(xì)胞等均具有不同程度的作用活性，并建立起 了部分中藥和藥用植物的樣品庫(kù)和活性庫(kù)。 對(duì)這些活性部位和成分作了進(jìn)一步的 離體和整體藥理實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)藥理結(jié)果與模型篩選結(jié)果有良好的相關(guān)性。 一、細(xì)胞膜色譜法及其特性1.細(xì)胞膜色譜柱的制備2, 31）膜制備 組織塊稱重，加入10倍體積的Tris-HCL緩沖液，冰浴下勻漿、 過(guò)濾，10000g離心10min,沉淀用緩沖液混勻，離心2-3次，用10mmol Tris-HCl 和2mmol LiBr提取4

3、5min, 1000g離心10min ,得均勻的細(xì)胞膜懸液，用Lowrry 法測(cè)蛋白含量。2）色譜柱的制備 制細(xì)胞膜的吸附等溫線，計(jì)算硅膠飽和吸附量 制備相應(yīng) 膜固定相的初始細(xì)胞膜濃度。取活化硅膠 20mg,加入膜制備，在4度搖床上震 蕩60min,平衡后離心分離，沉淀物用0.6mL的Tris-HCl洗滌，用低壓濕法加入 12mmx 50mm ID的不銹鋼色譜柱中，將細(xì)胞膜固定于硅膠載體表面。在柱溫37 C, pH=7.4的磷酸鹽緩沖液平衡一段時(shí)間后準(zhǔn)備進(jìn)樣分析。通過(guò)掃描電鏡和 能譜法研究已證實(shí)細(xì)胞膜能完全覆蓋硅膠表面， 不存在與硅膠的非特異結(jié)合；制 成的細(xì)胞膜固定相（CMSP）在幾天內(nèi)可保持

4、受體蛋白的立體結(jié)構(gòu)和生物活性。為 了保證細(xì)胞膜色譜柱的生物穩(wěn)定性，一般實(shí)驗(yàn)可在1天內(nèi)完成。通過(guò)掃描電鏡和 能譜法研究已證實(shí)細(xì)胞膜能完全覆蓋硅膠表面，不存在與硅膠的非特異結(jié)合。由CMC模型構(gòu)成的色譜系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)證明：經(jīng)掃描電鏡分析和表面能譜分 析，CMSP表面完全被細(xì)胞膜所覆蓋。CMSP表現(xiàn)出普通細(xì)胞膜制劑所具有的 酶活性特性，活性在比液載體內(nèi)穩(wěn)定。由 CMSP構(gòu)成的CMC系統(tǒng)與通常的正 相色譜和反相色譜系統(tǒng)不同，是一種特殊的生物色譜體系。 CMC系統(tǒng)具有生 物活性和色譜分離雙重特性。與經(jīng)典靶體 -配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)（RBA,受體功能分 析法）比較，CMC法具有同樣的生物親和特性180藥物分子與膜受體親

5、和力研究在此色譜系統(tǒng)中，藥物分子與細(xì)胞膜及膜受體的作用是多樣的。自然生物 膜存在有多種活性蛋白，藥物分子可能與多種受體或通道蛋白結(jié)合， 具容量因 子（K）可反映藥物分子與細(xì)胞膜上多種受體的協(xié)同結(jié)合效應(yīng)；用容量因子反 映藥物分子親和力，既包括特異結(jié)合，也包括非特異結(jié)合；保留作用的大小除 了與藥物分子親和力大小有關(guān)外，可能還受其他因素如化合物極性的大小的影 響，因此，必須先用藥物與受體飽和結(jié)合后，才能測(cè)得其特異結(jié)合。與 RBA 技術(shù)相似，CMC技術(shù)也可進(jìn)行配體-受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合研究。CMC模型的技術(shù)特點(diǎn)1）具有特異性、飽和性、可逆性和競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合等特點(diǎn)根據(jù)候選小分子化合物溶液在色譜柱內(nèi)保留特性 ，細(xì)胞

6、膜生物親和色譜實(shí) 質(zhì)反映了小分子化合物分子與膜受體蛋白分子間的相互作用， 因此其結(jié)合特性 均具有特異性、飽和性、可逆性和競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合等特點(diǎn)，并具有手性識(shí)別能力。CMC法與RBA和功能受體動(dòng)力學(xué)的相關(guān)研究證明，三種方法測(cè)得的7種配體 及其異構(gòu)體對(duì)M、a、B受體親和力參數(shù)順序一致，并具有明顯的相關(guān)性。CMC技術(shù)已經(jīng)成功用于鈣阻滯藥的受體-配體結(jié)合反應(yīng)研究和立體異構(gòu)體的 識(shí)別。2）細(xì)胞膜固定相具有細(xì)胞膜活性篩選和色譜分離的雙重功效CMC技術(shù)可對(duì)藥物-受體親和力進(jìn)行定性和定量分析，同時(shí)對(duì)結(jié)合狀態(tài)的 化合物進(jìn)行色譜分離。這種雙重功效為藥物篩選和分離提供了非常有效的實(shí)驗(yàn) 平臺(tái)。特別是在中藥研究中，可有效地分

7、離出中藥有效成分，并進(jìn)行其受體親 和力（匕）測(cè)定。CMC技術(shù)已成功應(yīng)用于中藥有效成分的篩選和色譜分離 1923。4）具有穩(wěn)定、簡(jiǎn)捷、高效特點(diǎn)CMC法與放射配體結(jié)合法比較，細(xì)胞膜受體不是處于溶液中,而是固定于 硅膠載體表面上，因而方法更簡(jiǎn)便；由于色譜柱可重復(fù)使用和膜蛋白消耗量少， 篩選效率高，穩(wěn)定性高，變異性很??；由于不需要特殊的放射性配體，沒有放 射性污染；如果用激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)手段，CMC法的靈敏度可超過(guò) RBS。與功能受體動(dòng)力學(xué)方法相比，CMC法具有更高的靈敏度和精確度。與人工膜親和 色譜法相比，CMC法保持了硅膠載體表面蛋白的生物活性， 因此必須在膜受體 活性期內(nèi)，在37c條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

8、。CMC法具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠、具有生 物活性、色譜柱可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，如果實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化測(cè)定，可發(fā)展為藥物高通 量篩選的新方法。CMC模型的適用范圍由于CMC法用的是自然生物膜，膜受體的密度較小，對(duì)親和力低的藥物 精確度較低，對(duì)于許多紫外光譜范圍外或邊緣的化學(xué)物質(zhì)（如多數(shù)M受體配體） 的檢測(cè)靈敏度還不夠滿意7,此時(shí)應(yīng)該代之以熒光檢測(cè)。CMC不能判斷化合物 在靶體-配體結(jié)合后的內(nèi)在活性和效應(yīng)特征， CMC法必須配合功能靶體動(dòng)力學(xué) 篩選等方法，才能確定某些有效化合物，從而確定目標(biāo)化合物。對(duì)于彌散分布 或重量太小組織（某些神經(jīng)核團(tuán)，內(nèi)分泌組織）尚無(wú)法進(jìn)行常規(guī)CMC研究，此時(shí)常需要進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)或細(xì)胞

9、株的傳代培養(yǎng)，獲得足量的細(xì)胞后才能進(jìn) 行CMC研究。二、細(xì)胞膜色譜法的基本研究方法1.前沿色譜分析24-26CMC法實(shí)質(zhì)上是一種新的具有生物活性的仿生色譜系統(tǒng)，藥物分子與細(xì)胞111=十 M LappKaM lD Ml膜及膜受體（配體-靶體）間的動(dòng)態(tài)相互作用特性，仍然可以用前沿色譜的3方法分析，通過(guò)制作藥物分子的突破曲線，并由以下關(guān)系計(jì)算出配體的Kd值。前沿色譜分析結(jié)果可用Scatchard-Plot或其他方法分析，上式中MLapp為達(dá) 到平均突破點(diǎn)的藥物摩爾數(shù)，D為流動(dòng)相中的藥物濃度，Ka為藥物分子與膜 受體作用的平衡常數(shù)，Ml是柱中受體蛋白結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。如果考慮非特異結(jié)合， 上式變?yōu)椋篲21_

10、 1 DKa（1 DKa）1Vmax -V - VminPKaXVmJPKaX 而式中，V是藥物的洗脫體積，P是柱中受體結(jié)合位點(diǎn)濃度，Vmin是特異結(jié)合 被抑制后，藥物的洗脫體積。Vmin可通過(guò)下式得到，公式中，X是與D作用與同 一位點(diǎn)的添加物濃度，Vmax是D足夠小時(shí)的洗月體積（當(dāng)D1/K a時(shí)，V=Vmax）, V|是存在競(jìng)爭(zhēng)時(shí)的D的洗脫體積。下式回歸可求出 Vmin （當(dāng)兇趨11=D V -Vmin Vmin P Ka VminP進(jìn)于無(wú)窮大時(shí)，V|=Vmin）。.常規(guī)色譜分析將已知濃度的待測(cè)物加于流動(dòng)相中，持續(xù)作用于膜色譜固定相，藥物與受 體蛋白逐漸結(jié)合并達(dá)飽和，此時(shí)從柱上洗脫下來(lái)的溶質(zhì)

11、量迅速增加，形成具有 特征的曲線裂斷。曲線上的平均裂斷位點(diǎn)只和溶質(zhì)濃度、柱中受體數(shù)目、溶質(zhì) 配體平衡解離常數(shù)有關(guān)。在 CMC系統(tǒng)中，藥物分子與細(xì)胞膜及膜受體（配體 - 靶體）間的作用，可以直接用反映其保留特性的容量因子（kO來(lái)表示，k，越 大，則藥物分子與細(xì)胞膜及膜受體的作用強(qiáng)度越大；反之，則藥物分子與細(xì)胞 膜及膜受體的作用強(qiáng)度越小。k可由下式獲得：k，= （t r- t o） / t 0其中t R是藥物分子在色譜系統(tǒng)中的保留時(shí)間，t 0是死時(shí)間。三、細(xì)胞膜色譜法在中藥研究中的應(yīng)用中藥和西藥的本質(zhì)都是物質(zhì)的，但其化學(xué)組成正好構(gòu)成了兩個(gè)極端體系， 中藥是復(fù)雜體系，西藥是簡(jiǎn)單體系。而不同細(xì)胞膜色譜

12、色譜模型可成為中藥與4藥用植物中藥效物質(zhì)篩選的技術(shù)平臺(tái)。目前，我們已對(duì)123種中藥和60多種藥用植物進(jìn)行了快速篩選，確定了其中的活性部位和活性成分，再經(jīng)“組織、 整體”水平的藥理實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，部分有效部位和有效成分可作為“候選藥物”進(jìn) 入新藥開發(fā)程序?！八奈餃蔽镔|(zhì)基礎(chǔ)研究復(fù)方是中藥的精髓和奧妙所在，應(yīng)用多種不同 CMC模型可對(duì)中藥復(fù)方進(jìn) 行“多靶點(diǎn)、多途徑”的研究。并以中藥藥效物質(zhì)為基礎(chǔ)借鑒中醫(yī)理論的宏觀 指導(dǎo)思想，利用西醫(yī)理論的對(duì)證指導(dǎo)原則，研究開發(fā)“成分明確、機(jī)理清楚、 量效相關(guān)、質(zhì)量可控、療效確切”的以部位或成分為單位的現(xiàn)代復(fù)方制劑。（1）動(dòng)物“心、腦、血管細(xì)胞膜色譜篩選模型”建立傳統(tǒng)上，

13、一般用整體動(dòng)物模型篩選研究中藥方劑， 只解決了中藥方劑的有效 性問題，而無(wú)法證明其有效性的物質(zhì)基礎(chǔ)， 以及在分子、細(xì)胞和組織水平上的作 用機(jī)制。本項(xiàng)目利用細(xì)胞膜色譜方法，首次建立了適應(yīng)于研究“四物湯”體系的 動(dòng)物“心、腦、血管細(xì)胞膜色譜篩選模型”，實(shí)現(xiàn)了對(duì)“四物湯”體系中藥效物 質(zhì)的體外仿生學(xué)快速篩選，再結(jié)合離體和整體藥效實(shí)驗(yàn)，構(gòu)成了一個(gè)以“細(xì)胞膜 色譜篩選模型”為特點(diǎn)的有效篩選體系，并成功地用于“四物湯”經(jīng)典方劑的研 究。研究結(jié)果表明：建立在“分子、細(xì)胞、組織、整體”水平上的有效篩選體系， 在發(fā)現(xiàn)中藥方劑藥效物質(zhì)和作用靶位的同時(shí)， 將有助于在一定程度上闡明中藥復(fù) 雜體系“多途徑、多靶點(diǎn)、綜合

14、性”特點(diǎn)，進(jìn)而為中醫(yī)藥現(xiàn)代化提供可應(yīng)用的新 的研究模式和研究方法。（2）四物湯中作用于“心、腦、血管靶細(xì)胞”的主要物質(zhì)基礎(chǔ)1）有效部位篩選 應(yīng)用動(dòng)物“心、腦、血管細(xì)胞膜色譜篩選模型”對(duì)四物 湯中熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川茸進(jìn)行體外快速篩選，結(jié)果：當(dāng)歸、川茸揮發(fā)油 等極性較小的脂溶性部位在“心、腦、血管模型”上顯示出較強(qiáng)的類似于陽(yáng)性藥 （維拉帕米、尼莫地平）的保留特性，是作用于心腦血管靶細(xì)胞的有效部位； 白芍醋酸乙酯部位在“腦、血管模型”上顯示出一定的保留特性，是作用于腦和 血管靶細(xì)胞的有效部位；熟地黃水溶性部位對(duì)離體胸主動(dòng)脈血管收縮和蛙心收 縮均有抑制作用，是作用于血管和心肌靶細(xì)胞的有效部位。2）

15、有效成分分離 用液相色譜/質(zhì)譜（HPLC/MS）、氣相色譜/質(zhì)譜（GC/MS）、 紅外光譜（IR）、紫外光譜（UV）和元素分析等現(xiàn)代分離分析技術(shù)，結(jié)合“心、 腦、血管細(xì)胞膜色譜篩選模型”，對(duì)各有效部位進(jìn)行了系統(tǒng)分離、跟蹤篩選和結(jié) 構(gòu)分析。結(jié)果：當(dāng)歸和川茸有效部位中的藁本內(nèi)酯為作用于心和血管靶細(xì)胞的5主要有效成分；當(dāng)歸和川茸有效部位中的丁烯映內(nèi)酯為作用于心和腦靶細(xì)胞的 主要有效成分；熟地黃和白芍有效部位中作用于心、腦和血管靶細(xì)胞的有效成 分含量甚少，所以分別將熟地黃水溶性有效部位中的梓醇和白芍醋酸乙酯有效部 位中的芍藥音作為指標(biāo)成分，以控制其質(zhì)量。（3）四物湯的有效部位方劑對(duì)“心腦血管系統(tǒng)”有較

16、強(qiáng)的綜合藥效作用在對(duì)四物湯進(jìn)行篩選、分離和分析研究基礎(chǔ)上，組成四物湯的傳統(tǒng)方劑（水 提物方劑和醇提物方劑）、有效部位方劑和有效成分方劑，并進(jìn)行相關(guān)的離體和 整體藥效學(xué)驗(yàn)證。1）四種不同方劑對(duì)去甲腎上腺素（NE,圖1）、氯化鉀（KCl,圖2）和氯化鈣 （CaCl2,圖3）所致的胸主動(dòng)脈血管收縮均有抑制作用，且有效部位方劑明顯強(qiáng)于 傳統(tǒng)方劑，也較強(qiáng)于有效成分方劑；四物湯中有效成分有類似于鈣拮抗劑的作用 特性，并呈非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗作用。87654NE(-log mol/L)100 _80 _) -%60(率，縮 40-收，200-8765NE(-log mol/L)圖1曲線（n=6）四物湯有效部位方劑與

17、維拉帕米對(duì)NE所致兔主動(dòng)脈條收縮反應(yīng)量效對(duì)照0.005 mmol/L0.01 mmol/L0.05 mmol/L120 -10080,100 _80 _-202.52.01.51.00.50.0KCl(-log mol/L)-201111112.52.01.51.00.50.0KCl(-log mol/L)對(duì)照 0.1g/mL0 0.2g/mL0 0.4g/mL圖2四物湯有效部位方劑與維拉帕米對(duì)KCl所致兔主動(dòng)脈條收縮反應(yīng)量效曲線（n=6）圖3四物湯有效部位方劑與維拉帕米對(duì) CaCl2所致兔主動(dòng)脈條收縮反應(yīng)量 效曲線（n=6）2）四種不同方劑對(duì)異內(nèi)腎上腺素所致的離體蛙心收縮和心率增加均有抑制

18、作用（表1）,且有效部位方劑明顯強(qiáng)于傳統(tǒng)方劑和成分方劑。表1四物湯方劑對(duì)離體蛙心心肌收縮力和心率影響（n = 8）樣品濃度/ %/ %空白對(duì)照組任氏液1.00:0.0101.01O010維拉帕米4 一c -10.2 mg?mL0.540.08460.600.184010.1 g?mL10.740.11260.910.079水提物方劑10.3 g?mL10.650.11350.790.132110.9g?mL10.470.12530.470.2353-10.1 g?mL0.780.11220.920.068醇提物方劑10.3 g?mL10.700.11300.820.1518-10.9 g?mL

19、0.630.12270.700.243010.1 g?mL10.690.04310.880.0812有效部位方劑10.3g?mL10.580.06420.710.222910.9 g?mL10.470.09530.440.185610.1 g?mL10.880.06120.900.1010有效成分方劑-10.3g?mL0.760.08240.840.111610.9 g?mL10.62*380.730.16273）用氟化鉀、亞硝酸鈉和常壓生石灰法制備小鼠腦缺氧模型，分別觀察“四物湯”傳統(tǒng)方劑（水提物方劑、醇提物方劑）、有效部位方劑、有效成分方劑對(duì) 小鼠腦缺氧的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，四物湯傳統(tǒng)

20、方劑、有效部位方劑和有效 成分方劑對(duì)小鼠腦缺氧均具有保護(hù)作用，且有效部位方劑明顯強(qiáng)于傳統(tǒng)方劑和成 分方劑。表2四物湯方劑抗氟化鉀中毒致小鼠缺氧實(shí)驗(yàn)結(jié)果（）(min)tp空白對(duì)照組123.6比2尼莫地平125.5222.6870.05醇提物方劑124.3061.8300.05有效部位方劑125.7比73.4610.01有效成分方劑125.4比63.2050.01注：空白對(duì)照組灌胃相同體積的生理鹽水，尼莫地平濃度為40mg/kg,四種方劑以生藥量計(jì)濃度為10g/kg。表3四物次萬(wàn)劑抗常年下小白鼠缺氧實(shí)驗(yàn)結(jié)果組別動(dòng)物數(shù)（只）存活時(shí)間min)t檢驗(yàn)P值空白對(duì)照組1214.4力.0尼莫地平1216.8力

21、.44.8090.01水提物方劑1215.6力.62.1960.05醇提物方劑1215.7力.82.2110.05有效部位方劑1216.5力.93.4390.01有效成分方劑1215.7力.62.4200.05注：空白對(duì)照組灌胃相同體積的生理鹽水，尼莫地平濃度為40mg/kg,四種方劑以生藥量計(jì)濃度為10g/kg。表4四物湯方劑抗常壓下致小白鼠缺氧實(shí)驗(yàn)結(jié)果()()t檢驗(yàn)P空白對(duì)照組1215.7 20一一尼莫地平1222 73.0760.01水提物方劑1219 52.2040.05醇提物方劑1219坨2.140.05有效部位方劑1220 52.7110.05有效成分方劑1219 42.3120.

22、05注：空白對(duì)照組灌胃相同體積的生理鹽水，尼莫地平濃度為40mg/kg,四種方劑以生藥量計(jì)濃度為10g/kg。都梁方劑物質(zhì)基礎(chǔ)研究利用“溶劑萃取、快速自動(dòng)色譜和多通道制備 HPLC”的高通量分離技術(shù), 完成“從植物到樣品”的快速分離制備建立起起了白芷和川茸的不同層次樣品 庫(kù)。用細(xì)胞膜高表達(dá)受體色譜模型，分別對(duì)白芷和川茸樣品庫(kù)和化合物庫(kù)中樣 品進(jìn)行系統(tǒng)篩選，分別發(fā)現(xiàn)了具有心腦血管活性的白芷有效成分歐前胡素和異歐前胡素以及川茸的有效成分藁本內(nèi)酯和丁烯味內(nèi)酯離體藥理實(shí)驗(yàn)表明白紙有效部位及有效成分、川茸有效部位均能顯著對(duì)抗 去甲腎上腺素誘發(fā)的兔離體胸主動(dòng)脈條收縮，量效關(guān)系明顯。通過(guò)篩選分別組 成都梁方

23、劑的不同活性部位和活性成分方，整體藥理實(shí)驗(yàn)表明對(duì)原發(fā)性高血壓 有緩解作用并隨即量增加而增強(qiáng)，在急性降壓實(shí)驗(yàn)中，對(duì)腎性高血壓大鼠有明 顯降壓作用。對(duì)心率影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其他中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究太白花物質(zhì)基礎(chǔ)研究太白花為石蕊科植物雀兒石蕊的枝狀體。為秦巴山區(qū)特有藥用植物。利用細(xì)胞膜色譜法，分別以健康犬的血管、心肌細(xì)胞膜建 立細(xì)胞膜色譜篩選模型，首先對(duì)太白花的各提取部位進(jìn)行系統(tǒng)篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)太白花乙醴提取部位對(duì)血管有作用。 在此基礎(chǔ)上對(duì)該部位進(jìn)行柱色譜分離， 并 利用血管細(xì)胞膜色譜跟蹤篩選，分離出活性成分TBHG8 o并具有較強(qiáng)的量效關(guān)系。采用離體蛙心實(shí)驗(yàn)對(duì)TBHG8進(jìn)行藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)離體蛙心

24、心肌 收縮力具有較強(qiáng)的抑制作用。結(jié)果與細(xì)胞膜色譜法篩選結(jié)果具有顯著的相關(guān) 性。紅毛七物質(zhì)基礎(chǔ)研究紅毛七為小集科植物類葉牡丹的根莖及根。實(shí)驗(yàn)中選用犬血管細(xì)胞膜制備血管細(xì)胞膜色譜模型，對(duì)紅毛七的各藥用部位結(jié)果表 明紅毛七對(duì)血管有作用的活性部位為甲醇提取物。利用薄層色譜、柱色譜分離，并經(jīng)血管細(xì)胞膜色譜篩選，分離出活性成分 HMQ-54和HMQ-52。采用兔離體主動(dòng)脈條實(shí)驗(yàn)，考察了 HMQ-54和HMQ-52對(duì)去甲腎上腺素 所致動(dòng)脈條收縮的拮抗作用，結(jié)果表明HMQ-54對(duì)去甲腎上腺素引起的兔主動(dòng) 脈條收縮呈現(xiàn)劑量依賴性的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗作用，而 HMQ-52作用較弱。四、細(xì)胞膜色譜法生物學(xué)研究進(jìn)展高表達(dá)細(xì)胞

25、原代培養(yǎng)的CMC研究我們成功進(jìn)行了心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì) 胞、血管平滑肌細(xì)胞、肝臟細(xì)胞的原代培養(yǎng)，并制備了這些細(xì)胞的色譜柱。9細(xì)胞株的傳代培養(yǎng)的CMC研究 利用課題所需要的細(xì)胞株（內(nèi)皮細(xì)胞、 月中瘤細(xì)胞等），我們制備了色譜柱，并成功進(jìn)行了細(xì)胞株的CMC研究。02和a i腎上腺素受體亞型細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備成功 27,28為CMC的生物 學(xué)研究開辟了新的研究方向，促進(jìn)了 CMC的研究進(jìn)展。我們成功制備了高 表達(dá)的a id受體亞型色譜柱，進(jìn)行了 9種a腎上腺受體配體對(duì)a id受體的親 和色譜（k）排序，與RBA的受體親和力（Kd）的順序一致，并具有高度正 相關(guān)性。a ia受體和a ib受體亞型的細(xì)胞

26、膜色譜柱已制備成功，并與相應(yīng)的 配體藥物進(jìn)行了 CMC的受體親和力研究29。在CMC的生物學(xué)研究中，通常我們擬采用的研究路線是：受體質(zhì)粒 （cDNA）的獲得與擴(kuò)增 -質(zhì)粒轉(zhuǎn)染-受體或受體亞型高表達(dá)細(xì)胞株建立 -細(xì)胞膜色譜柱制備 -特異性配體的CMC結(jié)合實(shí)驗(yàn)-藥物功能分析。CMC技術(shù)在6項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金和多項(xiàng)其他基金的重點(diǎn)支持下，經(jīng)過(guò)我們課題組的多年的努力，使得 CMC方法在基礎(chǔ)理論、基本技術(shù)、應(yīng)用基礎(chǔ)和 開發(fā)研究等方面取得了一些進(jìn)展， 并通過(guò)多方面的實(shí)踐積累了一定的經(jīng)驗(yàn)， 初 步形成了較為完整的理論、技術(shù)與應(yīng)用體系。尤其是作為研究靶體-配體相互作用的新方法，希望在藥理學(xué)研究領(lǐng)域得到更為廣泛地

27、應(yīng)用，并在實(shí)踐中不斷地改進(jìn)、完善和發(fā)展。部分碩士研究生畢業(yè)論文.楊廣德用細(xì)胞膜色譜法研究阿托品類藥物與M-受體的相互作用1998.趙惠茹 當(dāng)歸有效部位的細(xì)胞膜色譜法篩選和體內(nèi)過(guò)程研究，2000.牛曉峰陜西葉下珠藥用研究，2000.張漢利 太白花活性成分的CMC法篩選和兔體內(nèi)過(guò)程研究，2001.鄧喜玲丹參素及其衍生物的合成與結(jié)構(gòu)分析，2001.高琨用細(xì)胞膜色譜法分析研究紅毛七中的有效成分，2001.李洪玲 心康平原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和體內(nèi)過(guò)程研究，2001.梁明金 現(xiàn)代中藥BC-11質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及兔體內(nèi)代謝研究，200110.趙曉娟 用細(xì)胞膜色譜法篩選淫羊霍根的有效成分,2001.劉 飛 用細(xì)胞膜色譜法分

28、析人參中的有效成分,200211岳瑞天花粉降糖活性部位的CMC法篩選及其藥效學(xué)研究,2002.王樹春天冬與四物湯方劑質(zhì)量分析及其中藥材X射線衍射Fourier指紋圖譜鑒定研究，2002.王茂義降糖靈質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和體內(nèi)過(guò)程研究，2002.馬 瑛 BC-11降壓中藥CMC篩選及作用機(jī)理研究，2002.閆豫君 細(xì)胞膜色譜法篩選丹參中的有效及藥理作用研究，20021賀浪沖，耿信篤.細(xì)胞膜受體色譜法 一研究藥物與受體作用的新方法.生 物醫(yī)藥色譜新進(jìn)展，1996; 3:8Langchong He ,Sicen Wang and Geng Xindu. Coating and fusing cell membr

29、ane onto a silica surface and their chromatographic characteristics， Chromatographia, 2001,54:77He Langchong， Yang Guangde and Geng Xindu. Enzymatic activity and chromatographic characteristics of the cell membrane immobilized on silica surface, Chinese Science Bulletin, 1999,44(9):8264賀浪沖，楊廣德，耿信篤.固

30、定在硅膠表面細(xì)胞膜的酶活性及其色譜特性.科學(xué)通報(bào)，1999,44(6):6325賀浪沖，耿信篤.一些酸性藥物在正相硅膠/反相洗脫色譜中保留機(jī)理研究.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1998,33(1):426賀浪沖，楊廣德，王嗣岑.用細(xì)胞膜色譜法研究鈣拮抗劑與鈣通道受體相互作用.中國(guó)病理生理雜志,1998, 147(7):9597王樹春，賀浪沖.中藥材川考的射線衍射Fourier譜分析.中藥材，2002,25(6):3999趙惠茹，楊廣德，賀浪沖.用細(xì)胞膜色譜法篩選當(dāng)歸中有效成分.中國(guó)藥學(xué) 雜志，2000,35(1):1310梁明金，楊廣德，賀浪沖.白芷中歐前胡素提取方法研究.中成藥， 2000,22(12):82

31、911李洪玲，楊廣德,賀浪沖.心康平原料藥鑒別和含量測(cè)定.藥物分析雜志， 2001,21(5):34812趙曉娟，賀浪沖.用細(xì)胞膜色譜法篩選研究淫羊霍地下部分有效成分.分析化學(xué)，2002,30(2):19513高琨,賀浪沖，楊廣德.用細(xì)胞膜色譜法分析研究紅毛七中的有效成分.中國(guó)藥學(xué)雜志，2003,38(1):1414張漢利，楊廣德,賀浪沖，等.太白花活性成分的篩選與藥理作用相關(guān)性研11究.中國(guó)藥學(xué)雜志,2003,38(2):9215閆豫君，楊廣德，賀浪沖.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定丹參中丹參酮IIa和隱丹參酮的含量.中草藥,2002,33(4):36316劉 飛，賀浪沖.人參質(zhì)量控制的定性與定量

32、方法研究.藥物分析雜志，2002,22(3):160參考文獻(xiàn)賀浪沖，耿信篤.細(xì)胞膜受體色譜法一研究藥物與受體作用的新方法，生物醫(yī)藥色譜新進(jìn)展，1996; 3: 8-9博士論文He LC, Yang GD, Geng XD. Enzymatic activity and chromatographic characteristics of the cell membrane immobilized on silica, Chin Sci Bull 1999; 44(9): 826-31He LC, Wang SC, Geng XD. Coating and fusing cell membran

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38、d interaction. J Biochem1975; 77(1): 261-4Brekkan E, Lundqvist A , Lunaahl P. Immobilized membrane vesicles or proteoliposome affinity chromatography Frontal analysis of interactions of cytochalasin B and D-glucose with the human red cell glucose transporter.12Biochemistry 1996; 35(4): 12141-5Karlss

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