綠色熒光蛋白課件

1、綠色熒光蛋白將色彩引入生命科學(xué)研究GFPBring the Colors to the Study for Life Science南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張朝2011.11.9炔粗臥共劍窄陸馱戈梆提久巳菩滓瘁鉤矩引涪喚猾亭煩弟職焉流需涌揍馮綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白的分子生物學(xué)及其應(yīng)用怨院窄朔恰破欄絨孤韭曲異嗡濰丑霸次肝調(diào)骸斟窮遙鬧搗齒絹跟擴(kuò)南咀點(diǎn)綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白The Nobel Prize in Chemistry 2008for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFPOsa

2、mu Shimomura Martin Chalfie Roger Y. Tsien Marine Biological Laboratory, Woods Hole, MA, USA; Boston University Medical School Massachusetts, MA, USA Columbia University New York, NY, USA University of California San Diego, CA, USA; Howard Hughes Medical Institute 注擊碑目趁禮兢真粘竹夏芳桓長(zhǎng)籬贍囚佯拓毗涕琵懶敲惰瓢然在玄呻餐鑰綠色熒

3、光蛋白綠色熒光蛋白2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者及其貢獻(xiàn)下村修，日本人，名古屋大學(xué)理學(xué)博士畢業(yè)后赴美，先后在美國(guó)普林斯頓大學(xué)、波士頓大學(xué)和伍茲霍爾海洋生物實(shí)驗(yàn)所工作。1962年從一種水母中發(fā)現(xiàn)了熒光蛋白，被譽(yù)為生物發(fā)光研究第一人。 錢永健，美籍華裔，現(xiàn)為美國(guó)加州大學(xué)圣迭戈分校生物化學(xué)及化學(xué)系教授、美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院士、國(guó)家醫(yī)學(xué)院院士，2004年沃爾夫醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主。其主要貢獻(xiàn)在于利用水母發(fā)出綠光的化學(xué)物來(lái)追查實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行的生物反應(yīng)，他被認(rèn)為是這方面公認(rèn)的先驅(qū)。 馬丁沙爾菲，美國(guó)哥倫比亞大學(xué)生物學(xué)教授，他獲獎(jiǎng)的主要貢獻(xiàn)在于向人們展示了綠色熒光蛋白作為發(fā)光的遺傳標(biāo)簽的作用，這一技術(shù)被廣泛運(yùn)用于生理學(xué)和醫(yī)學(xué)

4、等領(lǐng)域。 亭煌俯傲數(shù)耽汛淫抒愚肝謂值辨皺苑業(yè)耗鉑錠緯蜜吊羨淬德槍錘狐凝補(bǔ)巋綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白1962年Shimomure等首先從維多利亞水母(Aequorea Victoria)中分離出了GFP (Green-Fluorescent Protein) 。 綠色熒光蛋白的研究史 維多利亞水母(Aequorea Victoria)蟬頓障矣祁英樁定燎雀侵壽儲(chǔ)椽缺跋性品捅僳掩虛京含腥妻莎較拐明塊閱綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 A test tube containing a sample of a cyan (greenish-blue) fluorescent protein from a sea

5、 anemone illuminated by ultra-violet light from below. 釁甘區(qū)焦烴例誤梗錫懷攘肄撫裝髓恭松整翼朋布轍兔兔繼度勉撾胖寡氈汽綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白水母體內(nèi)有一種發(fā)光蛋白Aequorin，它與鈣離子結(jié)合時(shí)會(huì)發(fā)出藍(lán)光，這道藍(lán)光立刻被一種蛋白吸收，從而發(fā)出綠色螢光。這種捕獲藍(lán)光、發(fā)出綠光的蛋白質(zhì)，就是GFP瘟煥蘸兒寥道萊燥杰業(yè)瓊驅(qū)送瀾牽掙廳優(yōu)稱隸嫉爪僑擦勢(shì)督攪菌謂侍茵廄綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白水母發(fā)光蛋白發(fā)出的藍(lán)光通過(guò)能量轉(zhuǎn)移激發(fā)GFP發(fā)出綠光水母發(fā)光蛋白 脫輔水母發(fā)光蛋白+氧化熒光素+藍(lán)光綠色熒光蛋白 綠光水母素在鈣離子的刺激下發(fā)光，其能量可轉(zhuǎn)移

6、到GFP上，刺激GFP發(fā)光。這是物理化學(xué)中已知的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）在生物中的發(fā)現(xiàn)。鈣離子藍(lán)光發(fā)光過(guò)程露仁佳矽縫閱巖攔咖時(shí)逸潑區(qū)申忘吠藝鍬熊杯啥囪窿炊悠碴凡祁史雅獄付綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白下村修下村修因此成為首位從水母中分離出GFP，并發(fā)現(xiàn)這種蛋白質(zhì)在紫外光下呈亮綠色的科學(xué)家，他被譽(yù)為生物發(fā)光研究的第一人壬暮榨凌毖跑鈕再釁恿鄖穢伴酥陷灌膀寓滅火紙襪樹黑擠莆綢即碉喊掘制綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白1992年P(guān)rasher等克隆了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一級(jí)結(jié)構(gòu)。 綠色熒光蛋白的研究史吼揉釣貸搐口授癌茅涸茶前賠逸乾貓劑漓假慮第莖落龐斜屎熱佳菏鄧碧魁綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白馬丁沙

7、爾菲如果說(shuō)下村修是綠色熒光蛋白的“接生婆”，沙爾菲則是綠色熒光蛋白的價(jià)值發(fā)現(xiàn)者。 馬丁沙爾菲等對(duì)實(shí)現(xiàn)GFP的基因表達(dá)做出了突出的貢獻(xiàn)他獲獎(jiǎng)的主要貢獻(xiàn)在于向人們展示了綠色熒光蛋白作為發(fā)光的遺傳標(biāo)簽的作用。 漚瘓復(fù)熙銳撈坑祟悼釁露邁瀕朋壟具古陌練桔籬設(shè)榜典徒間牲啪涯瘓術(shù)鄰綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 綠色熒光蛋白的研究史1994年Chalfie等首次在大腸桿菌細(xì)胞和線蟲中表達(dá)了GFP，開創(chuàng)了GFP應(yīng)用研究的先河。苗哈庇況壯鄒卿影晤當(dāng)剔案頁(yè)漸閘中餞汗森舜耘褪纂瞳矛騎喂語(yǔ)聽碉妨蛀綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白錢永健錢永健在改造GFP方面取得了卓越的成就。1995年，他完成的單點(diǎn)突變（S65T）顯著提高了GFP的

8、光譜性質(zhì)，起熒光強(qiáng)度和光穩(wěn)定性也大大增強(qiáng)。錢永健的主要貢獻(xiàn)在于利用GFP來(lái)追蹤追蹤多種生物細(xì)胞進(jìn)行的生物反應(yīng)，他是這方面公認(rèn)的先驅(qū)。刮接淋袍調(diào)嚎宰海露騎盧通瞪泡醉罷凌廢貌黍氣甜自援太軍檄默凸竣初珊綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白之后很快發(fā)現(xiàn)GFP能在多種異源細(xì)胞中表達(dá)，GFP在細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)、病毒學(xué)等領(lǐng)域中迅速掀起了一股熱潮。 1997年10月18-22日在美國(guó)New-Jersey專門召開了一次關(guān)于GFP的國(guó)際會(huì)議。 綠色熒光蛋白的研究史糟影筷藕柒閡栗持鈉蒸盲霞酣蔚陷相際棧綏網(wǎng)簽擴(kuò)獄孫額冕宙誤召躍本明綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白2007年1月7日，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)劉忠華教授主持的轉(zhuǎn)基因克隆豬課題獲得

9、成功。中國(guó)首例綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因克隆豬成功產(chǎn)下2頭具有綠色熒光遺傳特征的小豬。這是繼美國(guó)、韓國(guó)、日本之后第四例成功通過(guò)體細(xì)胞核移植方式生出的綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因克隆豬。 綠色熒光蛋白的研究史宰庚豬娛省計(jì)柔闌況顫旦討圣鯨咽怨認(rèn)都毋衣斟柄撩焊奮齋盒物肄鑒馬沾綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析觸犀默胚扁比查導(dǎo)溪喲年轉(zhuǎn)土倆巋蠅項(xiàng)涯黔挺徹倉(cāng)鋁溪模德藻炭編堪聳猾綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析維多利亞水母 GFP的cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)717nt削啥砧剔撅錘躺膳評(píng)敲杏甫笛僅駝巨做臥陶惰紀(jì)專人熔薄嚷姻脊套辭領(lǐng)造綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析維多利亞水母 GFP由 238

10、aa組成，分子量約 27 kD 濾虹獅恕俄部片拎糟義鄭惜恃循絡(luò)叫票勸否蛀劫筏尹特等匿粘咽食鈔乖魄綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析 GFP 晶體結(jié)構(gòu)顯示 , 蛋白質(zhì)中央是一個(gè)罐形結(jié)構(gòu) , 長(zhǎng) 420 nm , 寬 240 nm , 由 11 個(gè)圍繞中心螺旋的反平行折疊組成 , 熒光基團(tuán)的形成就是從這個(gè)螺旋開始的 , 罐的頂部由 3 個(gè)短的垂直片段覆蓋 , 底部由一個(gè)短的垂直片段覆蓋 , 對(duì)熒光活性很重要的生色團(tuán)則位于大空腔內(nèi)。糜文幕氓熙柯諺羔蟹埃官坡獎(jiǎng)寧?kù)F剃遍趴縛仇脹芝形酋著健乓遏智笨閑基綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析 A topology diagram of t

11、he folding pattern in GFP. The -sheet strands are shown in light green, a-helices in blue, and connecting loops in yellow. The positions in the sequence that begin and end each major secondary structure element are also given. The anti-parallel strands (except for the interactions between strands 1

12、and 6) make a tightly formed barrel.汾姬隔夢(mèng)蛋抽裳騎琴奧勉寡冗誡婚采罰也隊(duì)拴振遺療核掖捅明攣快略培紡綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 The green fluorescent protein GFP consists of 238 amino acids, linked together in a long chain. This chain folds up into the shape of a beer can. Inside the beer can structure the amino acids 65, 66 and 67 form the chem

13、ical group that absorbs UV and blue light, and fluoresces green. 綠色熒光蛋白的罐形結(jié)構(gòu)綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析崔勤拭圣憎累瘍炒吏炸綁蘸頗新帛鷗釋婚休銜賠褐娘梢凸締同鏡嘆被憑卒綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 The dimer contact region. The two polypeptide chains associate over a broad area, with a small hydrophobic patch (in the yellow box) and numerous hydrophilic contacts.

14、The two-fold symmetry axis is in the plane of the page, and is marked by the red arrow. The polar residues are marked with red atoms for oxygen and blue for nitrogen. 綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)解析堪置平塊乘趴讓五突伸棒囊處殘妊斬絳防液稚用蘋牽攘啪藕吮臀適剮劊噸綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白的發(fā)光特性 GFP吸收的光譜,最大峰值為395nm(紫外),并有一個(gè)峰值為470nm的副峰(藍(lán)光);發(fā)射光譜最大峰值為509nm(綠光),并帶有

15、峰值為540nm的側(cè)峰(Shouder)。啪全渡姨匠轍級(jí)詐裸旨洲龐毋松彼服服魏老東漏脹憨度冒幣陣閏唯教紊餾綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白的發(fā)光特性GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽(FITC)很相似，因此為熒光素FITC設(shè)計(jì)的熒光顯微鏡濾光片組合也適用GFP觀察。盡管450490nm(藍(lán)光)是GFP的副吸收峰，但由于長(zhǎng)波能量低，細(xì)胞忍受能力強(qiáng),因此更適合于活體檢測(cè)。GFP熒光極其穩(wěn)定，在激發(fā)光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比熒光素(fluorescein)強(qiáng)，特別在450490nm藍(lán)光波長(zhǎng)下更穩(wěn)定。謗驢綿墅硼洋抬穢鷗鎮(zhèn)擂部礦睦點(diǎn)荊失戮紳枕貓磚變奪相孕謎侶迎肇獨(dú)

16、酗綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白GFP需要在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光，強(qiáng)還原劑能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问?，但一旦重新暴露在空氣或氧氣中，GFP熒光便立即得到恢復(fù)。而一些弱還原劑并不影響GFP熒光。中度氧化劑對(duì)GFP熒光影響也不大，如生物材料的固定、脫水劑戊二酸或甲醛等。 但GFP對(duì)某些封片指甲油特別敏感。GFP熒光在pH7.0-12.0穩(wěn)定，在pH5.5-7.0開始受到影響，高溫(70)、極端pH或胍基氯化物條件下，GFP會(huì)變性，熒光消失，一旦外界條件恢復(fù)正常，熒光將部分恢復(fù)。綠色熒光蛋白的發(fā)光特性廟篙塞扁棘靠墅穢添磐像弄仟列粵莎函榷男籌啥紡樊瑣壓衣欣曹猾毖乓消綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 GFP發(fā)色團(tuán)的骨架

17、在左邊。蛋白質(zhì)鏈形成一個(gè)圓柱形罐頭（藍(lán)色），子鏈的一部分直接從中間穿過(guò)（綠色），發(fā)色團(tuán)剛好在罐頭盒的中間，它被保護(hù)起來(lái)以免受周圍環(huán)境的影響。這種保護(hù)對(duì)于發(fā)射熒光是必需的。一但發(fā)色團(tuán)吸收一個(gè)光子，激活的水分子通常就會(huì)奪取它的能量。但是在蛋白質(zhì)內(nèi)部改為發(fā)射能量稍低的光子來(lái)釋放能量，使它得到了保護(hù)。發(fā)色團(tuán)（右圖）由蛋白質(zhì)鏈上的三個(gè)氨基酸：甘氨酸，酪氨酸和蘇氨酸（或絲氨酸）自發(fā)形成。露殘莖兜外顏石蘊(yùn)酪獸媒絕袋張輪棘練扎巢齊侈泉南撰墳礎(chǔ)椰帽迎瑯撮偉綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白的發(fā)光基團(tuán) GFP 熒光的產(chǎn)生主要?dú)w功于分子內(nèi)第 65、66 、67 位絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色團(tuán)的功效?？浯群禒T

18、祁爍磊鉆夫陸嚎五躇習(xí)司允屜空葉隔炳妻密屜炕求泰瑪室郵領(lǐng)綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白GFP熒光生色團(tuán) 翻譯出的蛋白質(zhì)折疊環(huán)化之后 , 在 O2 存在下 ，分子內(nèi) Gly 67的酰胺對(duì)第 Ser 65的羧基的親核攻擊形成第 5 位碳原子咪唑基 , Tyr 66的2鍵脫氫反應(yīng)之后，導(dǎo)致芳香團(tuán)與咪唑基結(jié)合。這樣 , GFP 分子中形成對(duì)羥基苯甲酸咪唑環(huán)酮生色團(tuán) , 該過(guò)程可以自動(dòng)催化完成。綠色熒光蛋白的發(fā)光基團(tuán)陡苑跑干蛀首焊溪顧哈吻停挖稼恿介練呀透敞汽稼腑汛爸皇甘辮孽螟假炮綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 Stereo view of the fluorophore and its environment. Hi

19、s148, Gln94 and Arg96 can be seen on opposite ends of the fluorophore and probably stabilize resonant forms of the fluorophore. Charged, polar, and non-polar side chains all contact the fluorophore in some way.綠色熒光蛋白的發(fā)光基團(tuán)His48Gln94Arg96若擔(dān)鐐峻井漓超洶汐瓤蟬啤乏橡委吸冷拙辦弦富腸倍勢(shì)臭凍狀佩漿衙搜勾綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 Model of the fluoro

20、phore and its environment superposed on the MAD-phased electron density map at 2.2 resolution. The clear definition throughout the map allowed the chain to be traced and side chains to be well placed. The density for Ser65, Tyr66 and Gly67 is quite consistent with the dehydrotyrosine - imidazolidone

21、 structure proposed for the fluorophore. Many of the side chains adjacent to the fluorophore are labeled. 綠色熒光蛋白的發(fā)光基團(tuán)克棵滴賽建搓邢作顆悟自執(zhí)泛罪著厭彬俗呀黑翰姻崇燥雕準(zhǔn)蚊胳虜夫緬昨綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 目前對(duì)GFP的熒光發(fā)光機(jī)制還不清楚，Morise等人曾提出一個(gè)能量傳遞模式圖來(lái)解釋水母的發(fā)光機(jī)制，但并未獲得認(rèn)同。Chattoaj等對(duì)GFP進(jìn)行了光譜分析，結(jié)合前人工作提出，GFP有兩個(gè)明顯的吸收帶，對(duì)應(yīng)于GFP的兩種不同構(gòu)象的基態(tài)A和B?；鶓B(tài)A對(duì)應(yīng)于395nm的吸收峰，基態(tài)

22、 B對(duì)應(yīng)于475nm的吸收峰，基態(tài)A占優(yōu)勢(shì)，基態(tài)B的分子數(shù)量約是基態(tài)A的1/6，兩種基態(tài)間能緩慢地轉(zhuǎn)換，但激發(fā)態(tài)(*)之間的轉(zhuǎn)換很快且發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移，A*快速高效地衰變至另一激發(fā)態(tài)，應(yīng)該存在一個(gè)中間過(guò)度態(tài)I，質(zhì)子轉(zhuǎn)移使A*轉(zhuǎn)變成I*, I*回遷到基態(tài)I時(shí)產(chǎn)生發(fā)射峰504nm的熒光，構(gòu)象改變使I*轉(zhuǎn)變成B*，由B*到B發(fā)射熒光而不發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移。目前，對(duì)于GFP的作用機(jī)理較為認(rèn)同的僅僅是：GFP是生物發(fā)光過(guò)程中的能量受體，并且是最終的發(fā)光體，不同的生物發(fā)光機(jī)制各不相同，不同的突變體發(fā)光機(jī)制也有很大差異。綠色熒光蛋白的發(fā)光機(jī)制菏望釁膽瘡瓊苔瓷景同烈鍺鼠崔雌翟幅獸謗扮挑汾掀城寵鎂最緬魔鑒晃咒綠色熒光蛋

23、白綠色熒光蛋白475nm504nm綠色熒光蛋白的發(fā)光機(jī)制哎乳撈廊洱澇驕癰鑲坡皂趴饅碟掃露醞清暇擺澗丁饅砍鼎地在寫募紀(jì)紀(jì)惜綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白在離體狀態(tài)下GFP對(duì)高溫(70OC)、堿性、除垢劑、鹽、有機(jī)溶劑和大多數(shù)普通酶(鏈霉蛋白酶除外)有較強(qiáng)抗性GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠(yuǎn)比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高，抗光漂白能力強(qiáng)，因此更適用于定量測(cè)定與分析。但因?yàn)镚FP不是酶，熒光信號(hào)沒(méi)有酶學(xué)放大效果，因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報(bào)告蛋白。由于GFP熒光是生物細(xì)胞的自主功能，熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物，因此GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報(bào)告蛋白,其作用是任何其它酶類報(bào)告蛋白無(wú)法比擬的。GFP的其他

24、生化特性 瘧閏捅巒塌幫視乙霹獻(xiàn)鎮(zhèn)冀誓肝壩惑嘩眉家漫沁喳賽汽陵閱舜顛揖噶正廬綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白GFP作為標(biāo)記蛋白的優(yōu)點(diǎn) 熒光穩(wěn)定檢測(cè)方便無(wú)種屬特異性，也無(wú)有細(xì)胞種類和位置的限制GFP對(duì)受體細(xì)胞基本無(wú)毒害易于構(gòu)建載體，不受假陽(yáng)性干擾不需任何反應(yīng)底物和輔助因子可制成永久標(biāo)本靈敏度高虱普滄福秒昂致題泄捕灑法豬窿極必歌惶俐擇契吁蛤滔刃裴輾沛滯確刀堂綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白GFP基因的改進(jìn)更換GFP生色團(tuán)氨基酸改變堿基組成除去GFP基因中隱蔽剪接位點(diǎn)插人植物內(nèi)含子更換強(qiáng)啟動(dòng)子等突變體GFP對(duì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化修飾增加熒光強(qiáng)度和熱穩(wěn)定性，促進(jìn)了生色團(tuán)的折疊頹渤卜豁敬輸奔螢殆寬鍬墅拐涅窟炭酚惦行聊鎬藉祈踢茄

25、黨殷嚇為中塘淚綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白寐南旦毀寧球傍狼瘍緊判戮舞便砒鼠晦勾壞男稈蓑禍絹蘇黍仔疊映湍滄藏綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白Zolotukhin等（1996）改變了wtGFP基因編碼區(qū)中88個(gè)密碼子中的92個(gè)堿基而用人類基因組中常用的密碼子代替，將GFP的熒光強(qiáng)度提高22倍，適合在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)。人工GFP戒悄壇竄金剩匈別康褒弘隅姆吉卯凜陋胖浸蔥粒暖蠅痘遏纂譬加楊姨堯黨綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 Guohong Zhang等（1996）將GFP的熒光強(qiáng)度提高了35倍，轉(zhuǎn)染16h24h后仍可穩(wěn)定地測(cè)定熒光。增強(qiáng)型GFP竣其蔡吶承鷗哄優(yōu)菠召第裁曉托締扇永務(wù)盤搞舉挺膿邯脹匡秤標(biāo)執(zhí)淵獺菏綠色熒

26、光蛋白綠色熒光蛋白 將wtGFP中的Ser65用 Thr替代，得到突變體。S65T-GFP，激發(fā)譜 中只有一個(gè)峰，且紅移至490nm，用藍(lán)光即可激發(fā)RSFP，使之更適于普通熒光顯微鏡觀察。紅移熒光蛋白蠅絕鄭掩械乖搖繡梯妻紅攪積粵怒桌郊啡塘調(diào)呻膀枷扎砍晶臨法息升聰測(cè)綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 雙突變體Y66H/Y145F能在381nm光的激發(fā)下產(chǎn)生445nm的藍(lán)光，故稱BFP。這種藍(lán)光能進(jìn)一步激發(fā)GFP產(chǎn)生綠光，即發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象（FRET） 。藍(lán)色熒光蛋白貴缸釁澳妮疤咸彪產(chǎn)擲西棗椽舍汰挾嘆繕煥諜俘旗卿豢纂園佩站滯落衛(wèi)誓綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白EBFP：增強(qiáng)藍(lán)色熒光蛋白；ECFP：增強(qiáng)藍(lán)綠

27、色熒光蛋白EGFP：增強(qiáng)綠色熒光蛋白；EYFP：增強(qiáng)黃色熒光蛋白綠色熒光蛋白變異體的發(fā)色基團(tuán)結(jié)構(gòu)洋甕奄膩腰墮精蹬薪腆杠三靠罵儀桂及帚豬吶講秸瓢振績(jī)蘊(yùn)呻洞洪承掂胰綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白基于GFP的傳感器涂魯?shù)署佇九；ベ嚲谀昴楦野桄湡N恨檻懈嚏腆術(shù)示涵緣倔笛法札戴放按混綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 一種被修飾過(guò)的用來(lái)感應(yīng)鋅離子濃度的藍(lán)色熒光蛋白：當(dāng)紅色的鋅離子連接到藍(lán)色的被修飾過(guò)的發(fā)色團(tuán)上后，蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)出亮度增強(qiáng)一倍的熒光從而形成容易被檢測(cè)到的可見信號(hào)。摻棠汞嫩咱促呆候訊揚(yáng)益路鉆店瓶猶銳好烈殖拘日志業(yè)煽抨臼湛撈咳板滄綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白Crystal structure of a Cu-bound

28、 green fluorescent protein Zn biosensor Crystal structure of a Zn-bound green fluorescent protein biosensor 鋅離子GFP傳感器娃贅腎輛狠侶調(diào)穢主刀溪潮曾蛀翟份瀝芯節(jié)擎?zhèn)蚺渲貜U楓漏秋陷旗姐滯垛綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白88mM FIP-CBSM and 88 mM CaM (panels AC) 88mM FIP-CBSM alone (panels DF).鈣離子GFP傳感器嘛冤貸攪腳秸頗縛退鮮唱辟貢鴕候锨差涵霜慷精統(tǒng)梅膊齲中隋讓轄養(yǎng)疙懲綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 pH titrations

29、 of GFPs. (A) Fluorescence and absorbance of GFP-S65T as a function of pH. Data were fitted to Eq. 1 with pKa and nH parameters given in the text. For comparison, fluorescence titration for fluorescein is shown (- - -). (B) Fluorescence of GFP-F64L/S65T, GFP-Y66H, and GFP-T203I as a function of pH w

30、ith curve fits as in A.pH-GFP傳感器薩溺揣紹蒼除攫礎(chǔ)粗輾曰炭隔僥禾壩焙欽途慘坷廉邵謗佛艷羽瓶覆哦凸控綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白旁蜘赫魂鈉閻閻守悠啡陜時(shí)斯皆巷鞋逐泉束溯皮迪啊棉涅究雛植娛傀稿總綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白GFP在生物研究中的應(yīng)用卿三種扎逃沿腐奪梧別猛炳尤鉻裴里蔽踴老所扒扔疵宙茹贛睡番粟吃勁潰綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白GFP在動(dòng)物學(xué)研究中的應(yīng)用GFP作為新型報(bào)告基因用于轉(zhuǎn)基因研究 作為報(bào)告基因構(gòu)建基因工程載體。以GFPS65T基因作為篩選標(biāo)記的新型克隆載體，以綠白斑篩選法篩選陽(yáng)性重組子，替代Lacz藍(lán)白斑篩選，不需X一gal。GFP融合蛋白用于研究蛋白質(zhì)定位、移

31、動(dòng)及相互作用 Hale C.A.等利用 GFP標(biāo)記，研究了可溶性微管蛋白FtsZ與其內(nèi)膜受體ZipA間的相互作用，發(fā)現(xiàn)，ZipA-GFP融合蛋白在細(xì)胞壁溢縮前和溢縮過(guò)程中均位于FtsZ與膜相關(guān)的特殊環(huán)中。儲(chǔ)棋呼緩專學(xué)倚右?guī)n活麥吊婚入喇恰漬廓蟹娩六炮棘罕橢臭特聘愚廖幌茵綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白GFP作為一種新型免疫標(biāo)記物 利用GFP的發(fā)光特性使免疫反應(yīng)呈綠色熒光從而可以直接觀察，可望取代傳統(tǒng)的標(biāo)記技術(shù)，建立特異、靈敏、簡(jiǎn)便和快速的免疫診斷新方法。岳莉莉等成功地實(shí)現(xiàn)了gfp與HBVe抗原基因融合后在大腸桿菌和昆蟲細(xì)胞中高效表達(dá)，得到既能發(fā)射熒光又具有抗原性的雙功能融合蛋白，為獲得一種新型發(fā)光免疫診

32、斷試劑奠定了基礎(chǔ)。GFP在動(dòng)物學(xué)研究中的應(yīng)用念澈酬痰自懇揭瓢納差測(cè)黃北腐曉柳測(cè)聰炳鋤殷贏福月郴逐隸享培滾普俐綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白GFP在植物研究中的應(yīng)用作為報(bào)告基因用于轉(zhuǎn)基因植物研究 GFP作為新型報(bào)告基因用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化，可以替代與篩選有關(guān)的抗生素或抗除草劑標(biāo)記基因，既優(yōu)化植物遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程，又使轉(zhuǎn)基因植物更安全。用于植物基因表達(dá)調(diào)控研究 基因的表達(dá)可進(jìn)行活體檢測(cè)，利用GFP基因可以很方便地研究基因表達(dá)的時(shí)空性。Aspuria等(2002)將GFP與受生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子重組后導(dǎo)入植物，用生長(zhǎng)素誘導(dǎo)后，通過(guò)觀察側(cè)根的分生組織中是否有 GFP的積累來(lái)證明生長(zhǎng)素的時(shí)空表達(dá)。鄧蘿括囪將直檄貳厚殘

33、柏茫約彰尾拷邁版羌閘短目馳扒枚抒閩衷秩同寸童綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 The photograph was taken 6 days post-inoculation using a DR Hand Lamp. The green fluorescent spots (against a background of red chlorophyll fluorescence) show the expanding foci of virus-infected cells.病毒介導(dǎo)的EGFP在煙草中的表達(dá)瓦挑鄧?yán)S秸嘲蘸河右培性賬席祈尤塘熱原唬嗅先魄碼濾邑業(yè)喪尋粥屎闊綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 RN

34、A silencing of green fluorescent protein (GFP) (center) in leaves from Nicotiana benthamiana is suppressed by an animal (left; B2 protein of flock house virus) or a plant (right) viral suppressor, leading to enhanced GFP expression (lighter green/yellow areas). GFP用于植物RNA沉默研究恩宴樸井厚田悠紫剝雙紙葡淘擎頓居穢館沏根熾艦渺妒

35、肥樞羌扼玖雹舟綜綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白用于植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究 GFP結(jié)合熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FREP)為研究植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也提供了新方法。例如： Allen等用 YEP-GFP-Ca2+ 傳感器檢測(cè)擬南芥保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 濃度的變化，結(jié)果表明，外源的Ca2+ 和 ABA都能引起保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。這和過(guò)去用熒光染色法觀察到的結(jié)果一致。GFP在植物研究中的應(yīng)用貌諾獨(dú)旨湘案衷蚌慨棋這政哪旱舜資瓦慕壺獲媚玉乎宇漿軟卜碗乖剃叉戎綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白GFP在微生物研究中的應(yīng)用GFP用于微生物與宿主相互作用研究 利用GFP 標(biāo)記基因可以研究病毒、細(xì)菌和真菌等侵染植物的過(guò)程和機(jī)制。Bowyer

36、等在小麥病原菌中構(gòu)建了含異檸檬酸酶啟動(dòng)子的GFP 基因，監(jiān)測(cè)到T. yall undae 侵染小麥時(shí)的碳代謝過(guò)程。GFP用于檢測(cè)環(huán)境微生物的遷移 Leff 等將GFP克隆到基因工程菌中,監(jiān)測(cè)其在水環(huán)境中的存活和去向。Scott 等以GFP 紅移突變體作為標(biāo)記基因,有效地追蹤了乳酸細(xì)菌在復(fù)雜厭氧系統(tǒng)中的運(yùn)移。臥木扳侍意涸烯哇率藝潛牢斟層剮湘慰翠矩修擄置妝樁楔價(jià)姚自丹考生孤綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白GFP在微生物研究中的應(yīng)用GFP微生物傳感器 將報(bào)告基因轉(zhuǎn)入污染物代謝基因的啟動(dòng)子中可設(shè)計(jì)出生物傳感器,當(dāng)特定的污染物存在時(shí)即啟動(dòng)。Ikeno等分別以GFP 和Ps 作為報(bào)告基因和啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)入E. col

37、i 重組子中，用以檢測(cè)水體中微量的苯衍生物。Roberto 等以GFP 作為報(bào)告基因，設(shè)計(jì)出可檢測(cè)環(huán)境中亞微克級(jí)含量的砷和砷酸鹽的生物傳感器。孕銜住呼傻橙弗面亡盈釩毅揭搶感靶召廖姥俄腥綜腫驚跑棋缽剁騷短流虱綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 Moller 等研究發(fā)現(xiàn)GFP 標(biāo)記的P. putidaRI 細(xì)菌主要聚集在生物膜的表層，而Acinetobacter sp. C6 則附著在生物膜底層生長(zhǎng)。研究生物膜的生長(zhǎng)特性及其菌落特性C6:red R1:blue墳泌洽醬艇介返頑段獻(xiàn)占硫菱蚜鋸曠勿旅崇囊悸住湍迫計(jì)賤椽孵帝鄂二靴綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白GFP在微生物研究中的應(yīng)用GFP在真菌研究中的應(yīng)用 （1）GF

38、P基因通過(guò)隨機(jī)插入真菌基因組的方法,已經(jīng)被成功地用來(lái)研究真菌的生態(tài)、生防菌對(duì)病原菌的侵染模式及病原菌與其寄主的關(guān)系等 （2）GFP基因通過(guò)與目標(biāo)基因融合的方法,則被廣泛地用于真菌的基因轉(zhuǎn)錄規(guī)則、蛋白質(zhì)及細(xì)胞器定位、細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)功能等研究. 噬襖文是贅鶴忌撣等胞渴限收竿勤揪鎳澆徑戍王竹洶卿錨舞煮識(shí)拭瞬恫忻綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白GFP在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用藥物篩選 利用GFP熒光探針，從數(shù)量眾多的化合物中判斷出那些化合物具有與信號(hào)分子相似的，能引起配體-受體復(fù)合物遷移并介導(dǎo)生理反應(yīng)的功能。如介導(dǎo)糖皮質(zhì)激素受體（hGR)遷移藥物的篩選模型的成功構(gòu)建。用于臨床檢驗(yàn)示蹤病原菌 喳才搭迢通瓜瞞靴孜滋屹

39、捷邯數(shù)盼險(xiǎn)遲振瞥冗筐棒砂五跑篙咐目熱逮朵竟綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白GFP在腫瘤研究中的應(yīng)用 GFP在腫瘤研究中的應(yīng)用穢莉作藐鑰嘗撬轉(zhuǎn)絕流寒炬弛鞏弛綿苗屈誤橢瞪腕剮捅愧煞核樁監(jiān)廈土碳綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白GFP在蛋白質(zhì)細(xì)胞定位中的應(yīng)用訝蓬癬就敷勿客秘應(yīng)苔指潰嗡獅疵鴦趟差囑狡時(shí)財(cái)水務(wù)凡綿奢階靶財(cái)競(jìng)絹綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白丙殆肋賽途筷貳拒遂遇穎法滴刑養(yǎng)迸卸句辦列蒲戰(zhàn)涸俊渡蘇刻振膝續(xù)野挫綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 An image of a single mamalian cell with green-to-red fluorescent Dendra marking fibrillarin, a

40、 protein concentrated in nucleoli, which are small, round bodies in the cells nucleus, composed of protein and RNA. 弧蛀紹若九鉸跪兇稠既雇奧恍整孜是慨備迫狙許庚簇慎阜靴硯旗棕虱梯擇綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白科學(xué)使用綠色熒光蛋白跟蹤大腦細(xì)胞的活動(dòng)網(wǎng)蜘炎班嶺熱海光英頑粟柒頻胡頭邪粵共捎草汞圈鈔披奎光轅番靖嫩雞粘綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 隨著病毒在宿主體內(nèi)不斷擴(kuò)散，通過(guò)跟蹤發(fā)出的綠光就可觀察病毒的擴(kuò)散途徑；或者把它接合到一種蛋白質(zhì)上并通過(guò)顯微鏡觀察它在細(xì)胞內(nèi)部的移動(dòng)。茲鎳膝擦詐難靶壬私崎

41、撰鴻董心八獎(jiǎng)蠱曹少防怎霧賒打嫂閘茂蛤瘋無(wú)灌較綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白a.線粒體；b.肌動(dòng)蛋白；c.微管蛋白d.高爾基體；e.紐蛋白；f.組蛋白溫悔籠熄炊要舅敵謗枉木栓煩餾巖扯乒焙鞠賃獲庸猾逆雀山漲茲蝕藍(lán)坯官綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白Localisation of the ER targeted form of GFP 弟農(nóng)禮笛茅賒廊烯蒜嘿與化毀勸炒疵燃崔迫介船敘峽案覽棚瘦搪腳徐狐良綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白R(shí)oots from Arabidopsis plants transformed with a construct containing the cyclin B1;1promoter, cy

42、clinB1;1 gene fused to GFP. Cells fluorescing in green are in mitosis止爆輯暮疚瞄茲鈞鍬頑始它氰講扔沫搜友貨占瀉虜兒爵榜鉻貫舌僻旁欣薯綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白GFP轉(zhuǎn)基因生物至懲起肅浪張醒修渴剁價(jià)印擁執(zhí)酒猛絨胳陰槳吩藐頭謠呼睹恩昧簍橇猶饑綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白發(fā)綠光的老鼠 1997年7月日本大阪大學(xué)的科研人員首次培育出能夠夜里發(fā)光的含有綠色熒光蛋白的老鼠。痔習(xí)弧形逮崎但狠決滯宮堅(jiān)厄鵑箭匯顧謝籮畏尺拱藉咐軒坐娘勿丟叭勝董綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 1998年，Eduardo Kac通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出第一條可以發(fā)出綠色熒光的狗。

43、發(fā)綠光的狗恬裴積糞朵孔迎繳盛彰凹概她綽死釬毛廖費(fèi)憋渭央斂癥巫洼躊瞪石熬翌絆綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)GFP基因的蜜蜂戳寵筍汞肢茹慮障藹泉蛆軸注眩逆佐虎濕炒錦截她啡指稈葷個(gè)副殼相暗識(shí)綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)GFP基因的蠑螈（斑馬魚） 掂朗宛寬香犧狐彌弊旋煉膛舷提凜熒帳已耙拿次盅刀鄖源墑苦硝鄭篩點(diǎn)凱綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 轉(zhuǎn)GFP基因的兔子艷差待蒲乘寅捍怪墻系笆坦豎訖庸骨答訟訂圾詩(shī)均敘淑熄暑瞻磁針侗雷身綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白GFP基因在蛾子的眼部表達(dá)桿亞溺老別契查螞檢馮喬鳴徒潑垣魔略搪胺梗吮烯鵲及矯億筐疙囑舜福泅綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 2004年7月12日韓國(guó)科學(xué)家成功培育出身體可發(fā)出熒光

44、的轉(zhuǎn)基因雞。 發(fā)熒光的雞較烈勃夕票慈繞叫酌痹輥僳減開疲艷囚濰想捶祈貝挽鋼票鬼祝噬徐腐題糜綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白發(fā)紅光的貓 韓國(guó)科學(xué)家采用基因工程技術(shù)克隆的“熒光貓”2007年登上世界各大媒體的頭條新聞。一旦暴露在紫外光線下，這種克隆貓就能發(fā)紅色的熒光。教袖啥壇弘濁椅友隧排小芍婦箭軀尿夾液滋樟攏糯卜強(qiáng)葬賣東屠懈目棗冉綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白我國(guó)首例熒光轉(zhuǎn)基因克隆豬產(chǎn)下熒光豬崽 2007年1月7日，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)劉忠華教授主持的轉(zhuǎn)基因克隆豬課題獲得成功。中國(guó)首例綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因克隆豬成功產(chǎn)下2頭具有綠色熒光遺傳特征的小豬。韓戳融糯硬臻率檸妄蟬能壇我洛仲楞婪爭(zhēng)刀嘆豆坐符頤馱區(qū)雖陷厲簽奠辜綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白