RNA轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后加工教學(xué)文案

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。RNA轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后加工-第7章RNA轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后加工1本章主要內(nèi)容轉(zhuǎn)錄的基本概念大腸桿菌RNA聚合酶及其轉(zhuǎn)錄真核生物的RNA聚合酶及其轉(zhuǎn)錄RNA的轉(zhuǎn)錄后加工和反轉(zhuǎn)錄2教學(xué)目的和要求通過(guò)本章學(xué)習(xí)，掌握轉(zhuǎn)錄的基本概念，原核轉(zhuǎn)錄的主要參與者（RNA聚合酶和啟動(dòng)子）以及原核轉(zhuǎn)錄的過(guò)程（起始、延伸和終止）。掌握真核轉(zhuǎn)錄的三種主要RNA聚合酶、所轉(zhuǎn)錄的基因類型和參與轉(zhuǎn)錄過(guò)程各種因子等。了解不同前體RNA的加工機(jī)制。了解反轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)3重點(diǎn)難點(diǎn)1)轉(zhuǎn)錄2)大腸桿菌RNA聚合酶、原核轉(zhuǎn)錄的過(guò)程3)真核生物的RNA聚合酶、

2、真核轉(zhuǎn)錄過(guò)程、轉(zhuǎn)錄因子4)RNA的轉(zhuǎn)錄后加工、反轉(zhuǎn)錄4教學(xué)方法與手段講授與交流互動(dòng)相結(jié)合，采用多媒體教學(xué)。5授課內(nèi)容1)RNA轉(zhuǎn)錄概述2)細(xì)菌基因的轉(zhuǎn)錄3)真核生物的轉(zhuǎn)錄4)RNA的轉(zhuǎn)錄后加工5)RNA的反轉(zhuǎn)錄第一節(jié)RNA轉(zhuǎn)錄概述一、信使的發(fā)現(xiàn)1955年Brachet用洋蔥根尖和變形蟲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：若加入RNA酶，則蛋白質(zhì)合成就停止；若再加入來(lái)自酵母的RNA，又可合成蛋白質(zhì)。這表明什么？同年Goldstein和Plaut用同位素標(biāo)記變形蟲RNA前體發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的RNA在核內(nèi)。標(biāo)記追蹤實(shí)驗(yàn)：經(jīng)過(guò)一段時(shí)間又發(fā)現(xiàn)被標(biāo)記的RNA在細(xì)胞質(zhì)中，這表明什么？1956年E.Volkin和L.Astrachan：用同位

3、素脈沖一追蹤標(biāo)記表明T2噬菌體新合成的RNA的堿基比和自身的DNA堿基比相似，而和細(xì)菌的堿基比不同。T2感染細(xì)菌時(shí)注入的是DNA，而在細(xì)胞里合成的是RNA。這表明什么？最令人信服的證據(jù)是Hall.B.D和Spiegeman,S的DNA-RNA的雜交實(shí)驗(yàn)：將T2噬菌體感染E.coli后產(chǎn)生的RNA分離出來(lái)，分別與T2和E.coli的DNA進(jìn)行分子雜交。結(jié)果這種RNA只能和T2的DNA形“雜種”鏈，而不能和E.coli的DNA進(jìn)行雜交。Jacob和Monod預(yù)言:（1）這種“信使”應(yīng)是一個(gè)多核苷酸；（2）其分子平均不小于5105bp,足以攜帶一個(gè)基因的遺傳信息；（3）它們至少是暫時(shí)連在核糖體上；（

4、4）其堿基組成反映了DNA的序列；（5）它們能高速更新。Jacob和Monod將它定名為:信使RNA(MessengerRNA)或mRNA。二、幾個(gè)基本概念轉(zhuǎn)錄(transcription):是指以DNA為模板，在依賴于DNA的RNA聚和酶催化下，以4種rNTP（ATP、CTP、GTP和UTP）為原料，合成RNA的過(guò)程。在有些病毒中，RNA也可以指導(dǎo)合成RNA。轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的第一步，也是最關(guān)鍵的一步。三、RNA合成的基本特點(diǎn)1960年Weiss,S,B等發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶(RNAPol)。其特點(diǎn)是：（1）以核糖核苷三磷酸（rNTR）為底物；（2）以DNA為模板；（3）按5-3方向合成；（4）無(wú)

5、需引物的存在能單獨(dú)起始鏈的合成；（5）第一個(gè)引入的rNTP是以三磷酸形式存在；（6）在體內(nèi)DNA雙鏈中僅一條鏈作為模板；（7）RNA的序列和模板是互補(bǔ)的。確定有義鏈1963J.Marmur和DotySpiegelnan區(qū)分有義鏈。采用枯草桿菌的SP8噬菌體為材料，SP8DNA雙鏈有“輕”、“重”差異明顯?，F(xiàn)在將作為轉(zhuǎn)錄模板的DNA單鏈稱為模板鏈或反義鏈（antisenstrand），非模板鏈稱為有義鏈（sensestrand）或編碼鏈。在體外DNA的兩條鏈都可作為RNA合成的模板。怎樣用實(shí)驗(yàn)證實(shí)mRNA的合成總是延著5-3方向進(jìn)行的？E.coli在0C時(shí)需13秒鐘才能加上一個(gè)核苷酸，但在37C

6、每秒就可加上40個(gè)核苷酸;利用這個(gè)差別以14C來(lái)標(biāo)記U,在0C培養(yǎng)E.coli，。提取這種正在伸長(zhǎng)的mRNA分子,發(fā)現(xiàn)14C標(biāo)記首先出現(xiàn)在伸長(zhǎng)的3端，因此可以證明合成是延著5-3方向進(jìn)行的。四、RNA合成和DNA復(fù)制的區(qū)別(1)轉(zhuǎn)錄時(shí)只有一條DNA鏈為模板，而復(fù)制時(shí)兩條鏈都可作為模板；(2)DNA-RNA雜合雙鏈不穩(wěn)定，RNA合成后釋放，而DNA復(fù)制叉形成后一直打開，新鏈和母成子鏈；(3)RNA合成不需引物,而DNA復(fù)制需引物；(4)轉(zhuǎn)錄的底物是rNTP，復(fù)制的底物是dNTP；(5)聚合酶系不同。第二節(jié)細(xì)菌基因的轉(zhuǎn)錄一、細(xì)菌的RNA聚合酶1.全酶(HoloEnzyme)和核心酶(CoreEnz

7、yme)(1)全酶（HoloEnzyme）用于轉(zhuǎn)錄的依靠空間結(jié)構(gòu)與DNA模板結(jié)合(與核心酶結(jié)合后引起的構(gòu)象變化)專一性地與DNA序列(啟動(dòng)子)結(jié)合結(jié)合常數(shù)：1014mol半衰期：數(shù)小時(shí)（107mol1秒以下）轉(zhuǎn)錄效率低，速度緩慢（的結(jié)合）（2）核心酶（CoreEnzyme）作用于轉(zhuǎn)錄的延伸過(guò)程（終止）依靠靜電引力與DNA模板結(jié)合（蛋白質(zhì)中堿性基團(tuán)與DNA的磷酸根之間）非專一性的結(jié)合（與DNA的序列無(wú)關(guān)）結(jié)合常數(shù)：1011mol半衰期：60秒E.ColiRNApol的亞基組成coreenzyme（3）全酶的組裝過(guò)程此外，新發(fā)現(xiàn)的一種亞基的功能尚不清楚。2.各亞基的特點(diǎn)和功能（1）因子因子可重復(fù)使

8、用修飾RNApol構(gòu)型使HoloEnzyme識(shí)別啟動(dòng)子的SextamaBox(35區(qū)),并通過(guò)與模板鏈結(jié)合E.coli中不同的因子可識(shí)別不同的啟動(dòng)子（2）因子核心酶的組建因子促使RNApol與DNA模板鏈結(jié)合前端因子使模板DNA雙鏈解鏈為單鏈尾端因子使解鏈的單鏈DNA重新聚合為雙鏈（3）因子完成NMP之間的磷酸酯鍵的連接;Editing功能(排斥與模板鏈不互補(bǔ)的堿基);與Rho（）因子競(jìng)爭(zhēng)RNA3end;構(gòu)成Holoenzyme后,因子含有兩個(gè)位點(diǎn);Isite(initiationsite.Rifs):該位點(diǎn)專一性地結(jié)合;ATP或者GTP(需要高濃度的ATP或GTP);Esite(elonga

9、tionsiteRifR):對(duì)NTP非專一性地結(jié)合（催化作用和Editing功能）.（4）因子參與RNA非模板鏈（sensestrand）的結(jié)合（充當(dāng)SSB）有義DNA鏈結(jié)合位點(diǎn)（亞基提供）DNA/RNA雜交鏈結(jié)合位點(diǎn)（亞基提供）雙鏈DNA解鏈位點(diǎn)（前端亞基提供）單鏈DNA重旋位點(diǎn)（后端亞基提供）因子作用位點(diǎn)原核生物RNApol(Core)的結(jié)構(gòu)與功能RNApol執(zhí)行多種功能(1)識(shí)別DNA雙鏈上的啟動(dòng)子；(2)使DNA變性在啟動(dòng)子處解旋成單鏈；(3)通過(guò)閱讀啟動(dòng)子序列，RNApol確定它自己的轉(zhuǎn)錄方向和模板鏈；(4)最后當(dāng)它達(dá)到終止子時(shí)，通過(guò)識(shí)別停止轉(zhuǎn)錄。二、原核生物轉(zhuǎn)錄的起始延伸1啟動(dòng)子（

10、promoter）的結(jié)構(gòu)和功能啟動(dòng)子(promoter)：是指DNA分子上被RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合形成起始轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的區(qū)域，它還包括一些調(diào)節(jié)蛋白因子的結(jié)合位點(diǎn)。啟動(dòng)子由兩個(gè)部分組成上游部分CAP-cAMP結(jié)合位點(diǎn)：（基因表達(dá)調(diào)控的正控制位點(diǎn)）CAP（catabolitegeneActivatorProtein）降解物基因活化蛋白，環(huán)腺苷酸（cAMP）的受體蛋白下游部分RNApol的進(jìn)入（結(jié)合）位點(diǎn)3510包括識(shí)別位點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)（RB位點(diǎn)）2RNA聚合酶的進(jìn)入位點(diǎn)（1）Sextama框（SextamaBox）-35序列，RNA聚合酶的松弛（初始）結(jié)合位點(diǎn)RNA聚合酶依靠其亞基識(shí)別該位點(diǎn)，為轉(zhuǎn)錄選

11、擇模板識(shí)別位點(diǎn)（R位點(diǎn)）大多數(shù)啟動(dòng)子中共有序列為T82T84G78A65C54A45重要性:很大程度上決定了啟動(dòng)子的強(qiáng)度（RNApol的因子）（2）Pribonow框（PribonowBox）-10序列是由Pribnow和Schaller（1975）發(fā)現(xiàn)，故也稱為Pribnow框盒（Pribnowbox）。-10序列，RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)（B位點(diǎn)）一致序列：T80A95T45A60A50T9（TATPUAT），因此又稱TATABox位置范圍4到13（3）轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（I）1位點(diǎn)RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄開始時(shí)模板上的第一個(gè)堿基在原核中常為A或G而且位置固定典型啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)3起

12、始過(guò)程(1)全酶與模板DNA接觸，生成非專一的,不穩(wěn)定的復(fù)合物在模板上移動(dòng)；(2)起始識(shí)別：全酶與35序列結(jié)合，產(chǎn)生封閉的酶-啟動(dòng)子二元復(fù)合物（closedbinarycomplex）；(3)全酶緊密地結(jié)合在-10序列處，模板DNA局部變性，形成開放的啟動(dòng)子二元復(fù)合體；(4)酶移動(dòng)到I，第一個(gè)rNTP轉(zhuǎn)錄開始,因子釋放,形成酶-啟動(dòng)子-rNTP三元復(fù)合體（ternarycomplex）。圖起始過(guò)程圖RNA核心酶和全酶在DNA上的分布:=1*GB3和1/3的RNApol結(jié)合成全酶，或在非特異位點(diǎn)的松散復(fù)合體中，或在啟動(dòng)子中的二元復(fù)合體中；=2*GB3其中半數(shù)的核心酶從事轉(zhuǎn)錄；=3*GB3余下的核

13、心酶大量存在于閉合松散復(fù)合體中；=4*GB3估計(jì)數(shù)量很少的全酶是游離的。4RNA鏈延伸三原核生物轉(zhuǎn)錄的終止1終止子的種類（1）不依賴因子的終止子(內(nèi)在終止子)：體外實(shí)驗(yàn)中，只有核心酶和終止子就足以使轉(zhuǎn)錄終止（2）依賴因子的終止子：蛋白質(zhì)輔助因子因子存在時(shí)，核心酶終止轉(zhuǎn)錄兩者有共同的結(jié)構(gòu)特征（序列差異）=1*GB3不依賴因子的終止子(強(qiáng)終止子)結(jié)構(gòu)特征:一是形成一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)莖.720bp的IR序列形成（富含G/C）環(huán).中間不重復(fù)序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的突變可阻止轉(zhuǎn)錄的終止二是68個(gè)連續(xù)的U串(發(fā)夾結(jié)構(gòu)末端)=2*GB3、依賴因子的終止子=1*alphabetica結(jié)構(gòu)IR序列中的GC對(duì)含量較少發(fā)夾結(jié)構(gòu)

14、末端沒(méi)有固定特征=2*alphabeticb靠與的共同作用而實(shí)現(xiàn)終止2原核生物轉(zhuǎn)錄的終止（1）不依賴因子的終止子終止轉(zhuǎn)錄=1*GB3新生RNA鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成造成高度延宕（典型的有60秒左右）=2*GB3RNApol暫停為終止提供了機(jī)會(huì)，68個(gè)連續(xù)的U串可能為RNApol與模板的解離提供了信號(hào)RNADNA之間的rUdA結(jié)合力較弱于是：RNADNA解離三元復(fù)合體解體RNApol解離轉(zhuǎn)錄終止=3*GB3真正的終止點(diǎn)不固定，在U串中的任何一處=4*GB3IR序列和U串同等重要IR中的GC對(duì)含量的減少U串的縮短或缺失=5*GB3DNA上與U串對(duì)應(yīng)的為富含AT的區(qū)域說(shuō)明：AT富含區(qū)在轉(zhuǎn)錄的終止和起始中均起

15、重要的作用（2）依賴因子的終止子終止轉(zhuǎn)錄=1*GB3通讀（readthrough）：因子的轉(zhuǎn)錄終止過(guò)程中，RNApol轉(zhuǎn)錄了IR序列之后，雖發(fā)生一定時(shí)間的延宕，但如果沒(méi)有因子存在，則RNApol會(huì)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄=2*GB3因子a、活性形式為六聚體促進(jìn)轉(zhuǎn)錄終止的活性，NTPase活性b、RNA長(zhǎng)度大于50nt時(shí)，依賴RNA的NTPase活性最大說(shuō)明：因子識(shí)別和結(jié)合的是RNA=3*GB3因子對(duì)終止子的作用a、因子與RNA結(jié)合（終止子上游的某一處，RNA的5端）b、因子沿RNA從53移動(dòng)（NTP水解供能）（終止子處的較長(zhǎng)時(shí)間的延宕給因子追趕的機(jī)會(huì)）c、因子與RNApol相互作用而造成轉(zhuǎn)錄的終止RNAPol

16、轉(zhuǎn)錄DNA因子附著到RNA識(shí)別位點(diǎn)上因子跟在RNAPol后沿RNA移動(dòng)RNAPol在終止位點(diǎn)停下，并被因子追上在轉(zhuǎn)錄泡中因子使DNA-RNA雜種雙鏈解開轉(zhuǎn)錄終止,釋放出RNAPol,子和RNA=4*GB3終止反應(yīng)還需要RNA與DNA的相互作用即：需要一定的RNA序列因?yàn)椋浩渑c模板的結(jié)合力必須弱到一定數(shù)值，才能配合因子與RNApol的作用（發(fā)夾結(jié)構(gòu)下游的AU序列）序列不同的終止子不同的終止程度基因表達(dá)調(diào)控的途徑之一要點(diǎn)回顧幾個(gè)基本概念5-GCAGTACATGTC-3編碼鏈DNA3-CGTCATGTACAG-5模板鏈5-GCAGUACAUGUC-3mRNAN-Ala-Val-His-Val-C蛋白

17、質(zhì)不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄1.DNA雙鏈上，一股鏈可轉(zhuǎn)錄，另一股不轉(zhuǎn)錄。2.有意義鏈與反意義鏈并非固定不變。3.轉(zhuǎn)錄方向都是53原核生物的RNA轉(zhuǎn)錄原核生物RNA聚合酶大腸埃希菌RNA聚合酶的組成（1）全酶(holoenzyme)由4種(5個(gè))亞基2組成（2）核心酶(coreenzyme)2，參與轉(zhuǎn)錄的全過(guò)程（3）亞基亦稱因子（factor)轉(zhuǎn)錄輔助因子識(shí)別啟動(dòng)子，不參與轉(zhuǎn)錄過(guò)程轉(zhuǎn)錄過(guò)程(起始、延長(zhǎng)、終止)DNA模板啟動(dòng)子（promoter）1)概念:轉(zhuǎn)錄開始時(shí)能與RNA全酶結(jié)合的DNA順序（雙鏈）2)原核生物啟動(dòng)子的特點(diǎn):DNA序列在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的5端區(qū)(上游區(qū))-10bp處-TATAAT-(Pribnow

18、box)-35bp處-TTGACA-(SextamaBox)起始過(guò)程封閉的酶-啟動(dòng)子二元復(fù)合物（closedbinarycomplex）；開放的啟動(dòng)子二元復(fù)合體（openedbinarycomplex）；酶-啟動(dòng)子-rNTP三元復(fù)合體（ternarycomplex）。終止終止的方式-因子的作用與新生RNA結(jié)合ATP供能-因子沿新生的RNA單鏈推進(jìn)新生的RNA單鏈從DNA模板上分離下來(lái)第3節(jié)真核生物的轉(zhuǎn)錄一真核生物的RNApol1真核生物的RNApol2位置和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNApol核仁活性所占比例最大轉(zhuǎn)錄rRNA（7.8S、18S、28S）RNApol核質(zhì)主要負(fù)責(zé)hnRNA、snRNA的轉(zhuǎn)錄hnR

19、NA（mRNA前體，核不均一RNAheterogeneousnuclearRNA）snRNA（核內(nèi)小分子RNA，smallnulearRNA)表6-2真核生物的三種RNA聚合酶的特點(diǎn)RNAPol位置產(chǎn)物相對(duì)活性%對(duì)-鵝膏蕈敏感Pol核仁28S,18S,7.8SrRNAs5070不敏感Pol核質(zhì)hnRNA,mRNA,某些SnRNA2040高度敏感Pol核質(zhì)tRNA,5SrRNA,某些SnRNAs10片段特異,中等敏感3亞基組成：RNA聚合酶、都由多個(gè)亞基組成。有些亞基是三種酶所共有。mRNA是各種RNA中壽命最短、最不穩(wěn)定的，需經(jīng)常重新合成。因此RNA聚合酶是三種酶中最活躍的。表6-3真核生物聚

20、合酶的成分及功能4RNApol亞基組成：分子量500KDa,含兩個(gè)大亞基和712個(gè)小亞基大亞基中有C末端結(jié)構(gòu)域(carboxyterminaldomain，CTD)CTD中含一保守氨基酸序列的多個(gè)重復(fù)TyrSerProThrSerProSerC端重復(fù)七肽，不同生物中重復(fù)數(shù)目不一樣（酶活性）二真核生物的啟動(dòng)子三種RNApol三種轉(zhuǎn)錄方式三種啟動(dòng)子三類基因，類類類1、RNApol的啟動(dòng)子型啟動(dòng)子2、RNApol的啟動(dòng)子型啟動(dòng)子3、RNApol的啟動(dòng)子型啟動(dòng)子1RNApol的啟動(dòng)子即型啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)最復(fù)雜位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游,由多個(gè)短序列元件組成通用型啟動(dòng)子（無(wú)組織特異性）（1）帽子位點(diǎn)（capsite

21、）：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（2）TATA框（Hogness框或Goldberg-Hogness框）位于30處一致序列為T82A97T93A85A63（T37）A83A50（T37）定位轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的功能（類似原核的Pribnow框）TATA是絕大多數(shù)真核基因的正確表達(dá)所必需的。（3）CAAT框（CAATbox）（4）增強(qiáng)子（enhancer）（5）GC框（GCbox）位于90附近，較常見(jiàn)的成分核心序列為GGGCGG可有多個(gè)拷貝，也可以正反兩方向排列（6）其他元件：八聚核苷酸元件（octamerelementOCT元件）一致序列為ATTTGCATB元件一致序列為GGGACTTTCCATF元件一致序列為GTG

22、ACGT還有一些位于起始點(diǎn)下游的相關(guān)元件（7）不同元件的組合情況不同元件的數(shù)目、位置、和排列方向均有差異，例如：SV40的早期啟動(dòng)子中有6個(gè)GC框。真核生物啟動(dòng)子示意圖RNApol的啟動(dòng)子小結(jié)：不同啟動(dòng)子中每種元件與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的距離不同不同啟動(dòng)子中的相應(yīng)元件互相交換,形成的雜交啟動(dòng)子功能沒(méi)有變化各種元件將相應(yīng)的蛋白因子結(jié)合到啟動(dòng)子上，組成起始復(fù)合物，蛋白因子間的相互作用決定了轉(zhuǎn)錄的起始2RNApol啟動(dòng)子即型啟動(dòng)子，由2部分保守序列組成：核心啟動(dòng)子（corepromoter）或核心元件（coreelement），位于-45到+20，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的起始。上游控制元件（upstreamcontrole

23、lement,UCE），從-180延伸到-107，可增加核心元件的轉(zhuǎn)錄起始的效率。3.RNApol啟動(dòng)子（1）分為二類，每種識(shí)別方式不同a、下游啟動(dòng)子（內(nèi)部啟動(dòng)子）位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的下游5SRNA和tRNA基因可分為兩類b、上游啟動(dòng)子snRNA（2）內(nèi)部啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)最早發(fā)現(xiàn)于非洲爪蟾的5SrRNA基因試驗(yàn)設(shè)置：非洲爪蟾的卵母細(xì)胞提取液作為體外轉(zhuǎn)錄體系，進(jìn)行缺失試驗(yàn)以不同長(zhǎng)度的5SrRNA基因?yàn)槟０暹M(jìn)行轉(zhuǎn)錄。結(jié)果：缺失55以前和缺失80以后的序列都能正常轉(zhuǎn)錄，缺失55到80序列不能轉(zhuǎn)錄。結(jié)論：5SrRNA基因的啟動(dòng)子位于基因內(nèi)部該啟動(dòng)子可使RNApol在其上游的55bp處起始轉(zhuǎn)錄（3）內(nèi)部啟動(dòng)子分

24、為兩類均含兩個(gè)短序列元件，中間由其他序列隔開第一類：含A框和C框（5SrRNA基因）第二類：含A框和B框（tRNA基因、VARNA基因）間隔序列長(zhǎng)短差異很大其中內(nèi)部啟動(dòng)子起被RNApol識(shí)別的作用圖6-23真核RNAPol的基因內(nèi)啟動(dòng)子和基因外啟動(dòng)子三真核生物轉(zhuǎn)錄的起始三種RNApol均沒(méi)有對(duì)啟動(dòng)子特異序列的識(shí)別能力轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程需要很多的輔助因子(轉(zhuǎn)錄因子)參與,并且按一定順序與DNA形成復(fù)合物，協(xié)助RNApol定位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。RNA聚合酶催化的轉(zhuǎn)錄起始RNA聚合酶催化各種前體mRNA的合成需要多種TF參與：TFA-J真核生物的轉(zhuǎn)錄起始是在轉(zhuǎn)錄因子(TF)的協(xié)助下，RNA聚合酶辨認(rèn)結(jié)合轉(zhuǎn)錄起

25、始點(diǎn)上游的DNA序列(啟動(dòng)子)，生成起始前復(fù)合物。RNApol的轉(zhuǎn)錄起始RNApol的轉(zhuǎn)錄起始需要二種輔助因子：UBF1、SL1RNApol的轉(zhuǎn)錄起始表6-6RNApol啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能因子結(jié)構(gòu)功能TFA38Kda,有9個(gè)鋅指結(jié)合于1型內(nèi)部啟動(dòng)子(5sRNA基因)的C框,使C結(jié)合在C框下游，輔助B定位結(jié)合TFB含TBP和另外二種蛋白定位因子，使Pol結(jié)合在起始位點(diǎn)上TFC含A和B,有5個(gè)亞基B結(jié)合型內(nèi)部啟動(dòng)子(tRNA基因)的B框，起增強(qiáng)子的作用。A結(jié)合A框，起啟動(dòng)子的作用；輔助B定位結(jié)合TBP是B,D,SL1的亞基和特異DNA序列及RNAPol結(jié)合，使Pol結(jié)合，在正確的位點(diǎn)上T

26、FD含TBP亞基結(jié)合TATA框，確定選擇PolPBP次近端結(jié)合蛋白可能和D一道輔助B定位結(jié)合的另一途徑TBP的作用所有RNApol的轉(zhuǎn)錄起始都需要TBP在RNApol的轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程中,TBP是SL1的組份，起定位RNApol的作用RNApol的轉(zhuǎn)錄起始由TBP識(shí)別TATA框在RNApol的轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程中,TBP起定位RNApol的作用TBP起定位作用,所以又稱定位因子（positioningfactor）四轉(zhuǎn)錄延伸TranscriptionElongation1.起始到延伸的轉(zhuǎn)變始于第一個(gè)磷酸二酯鍵的形成伴隨著DNA分子和酶分子構(gòu)象的變化（1）Prok.起始時(shí)，因子有利于和亞基具有與DNA專一

27、性結(jié)合所要求的構(gòu)象起始后,因子解離,和亞基構(gòu)象發(fā)生變化（2）Euk.多種輔助因子的共同作用來(lái)保證這一轉(zhuǎn)變2延伸過(guò)程Prok.酶與產(chǎn)物RNA不解離底物NTP不斷加到RNA鏈的3-OH端形成一個(gè)磷酸二酯鍵后，核心酶向前滑動(dòng)延伸位點(diǎn)不斷地接受新的NTP，RNA鏈不斷延伸始終保持三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)=1*GB3轉(zhuǎn)錄泡RNApol結(jié)合和轉(zhuǎn)錄的DNA模板區(qū)域，有17bp左右DNA形成解鏈區(qū)轉(zhuǎn)錄泡處雜交雙鏈很短胰臟RNAase其長(zhǎng)度10bp（不準(zhǔn)確）推測(cè)也就兩個(gè)核苷酸左右=2*GB3拓?fù)鋵W(xué)問(wèn)題RNA合成過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄泡兩端要發(fā)生拓?fù)滢D(zhuǎn)變RNApol的前沿.解螺旋作用RNApol后端.DNA的螺旋化（保持解鏈區(qū)長(zhǎng)度

28、約17核苷酸左右）超纏問(wèn)題的解決靠DNA旋轉(zhuǎn)酶RNA-DNA雜交鏈也要求作旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)=3*GB3轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的延宕=1*alphabeticaRNA的合成速度大約3050個(gè)核苷酸秒,與蛋白質(zhì)的合成速度相近（15個(gè)AAsec）=2*alphabeticb模板DNA中GC的存在（GC后的810個(gè)核苷酸）延宕作用在RNA鏈的終止和釋放中起重要作用五轉(zhuǎn)錄的終止Transcriptiontermination終止過(guò)程：酶停止添加底物釋放RNA鏈酶解離終止反應(yīng)雜合雙鏈的氫鍵斷裂，重新形成雙螺旋，酶的解離。終止子（terminator）：在轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中，提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的RNA序列真正起終止作用的是RNA序列，

29、與啟動(dòng)子不同Prok.和Euk.都具有一種基因表達(dá)調(diào)控的手段復(fù)習(xí)原核生物的轉(zhuǎn)錄終止真核生物的終止子及轉(zhuǎn)錄終止了解很少（3末端）1、RNApol的終止子類似Prok.不依賴因子終止子，終止可能靠RNApol本身完成SV40的終止子:發(fā)夾結(jié)構(gòu)U串2、RNApol的終止子類似原核生物（發(fā)夾結(jié)構(gòu)U串）U串位于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的頂端且保守性很強(qiáng)（酵母人）環(huán)和柄對(duì)轉(zhuǎn)錄的終止同等重要小結(jié)1、真核生物RNApol：種類及各自轉(zhuǎn)錄的基因亞基組成2、RNApol的啟動(dòng)子3、RNApolI的啟動(dòng)子4、RNApol的啟動(dòng)子5、轉(zhuǎn)錄的起始三類啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子6、轉(zhuǎn)錄的延伸7、轉(zhuǎn)錄的終止第4節(jié)RNA的轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)錄后的加工(po

30、sttranscriptionalmodification)是指將各種前體RNA分子加工成成熟的各種RNA。加工（processing）有三種形式：（1）減少部分片段：如切除5端前導(dǎo)序列，3端拖尾序列和中部的內(nèi)含子；（2）增加部分片段：5加帽，3加poly(A),歸巢和通過(guò)編輯加入一些堿基；（3）修飾：對(duì)某些堿基進(jìn)行甲基化等。表6-10RNA加工反應(yīng)的分類一tRNA和rRNA的加工1原核的tRNA和rRNA的加工參與蛋白質(zhì)合成的tRNA和rRNA都不是最初的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(1)它們的5端都是單磷酸，而原始的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5應(yīng)是三磷酸；(2)分子比初始轉(zhuǎn)錄物小；(3)tRNA含有特殊的堿基，這些堿基只有通過(guò)

31、一些化學(xué)修飾才可以得到。(一)tRNA的加工原核的tRNA初始轉(zhuǎn)錄本多為多順?lè)醋樱╬olycistron），也就是幾個(gè)tRNA分子串連在一起。這有三種不同的情況：串聯(lián)的tRNA分子都是相同的，如在27的tRNATyr-tRNATyr；串聯(lián)的tRNA分子是不同的，如71的tRNAIle-tRNAAla-tRNAThr；由tRNA和rRNA串聯(lián)組成。少數(shù)的tRNA前體為單順?lè)醋樱╩onocistron）圖6-三種tRNA前體分子tRNA的加工分成4個(gè)階段：(1)“斬頭”，形成5末端；RNaseP內(nèi)切酶(2)去尾，形成3-OH末端；RNaseF，RNaseD(3)缺-CCA的tRNA要用tRNA核苷

32、酰轉(zhuǎn)移酶加-CCA。(4)修飾：通過(guò)甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等進(jìn)行修飾，如氨基酸臂的4-硫尿苷(4tu),D臂的2甲基鳥苷(2mG)，TC臂的假尿苷()和反密碼子環(huán)上的2異戊腺苷(2ipA)圖6-三種tRNA前體的剪切圖6-tRNA前體特殊堿基修飾(二)rRNA的加工在E.coli中rRNA有7個(gè)轉(zhuǎn)錄單位,名為rrnA-G.rRNA序列是保守的,每個(gè)轉(zhuǎn)錄單位都含有等比例的16S、23S、5SRNA及一個(gè)或幾個(gè)tRNA。每個(gè)轉(zhuǎn)錄單位轉(zhuǎn)錄成單個(gè)的RNA前體分子，經(jīng)剪切后變成為成熟的RNA的分子。rRNA前體的加工是由RNase負(fù)責(zé)的。2真核的tRNA和rRNA的加工(一)tRNA的加工真

33、核tRNA的基因和原核不同：(1)真核的前體分子tRNA是單順?lè)醋樱纱嘏帕?，基因間有間隔區(qū)；(2)真核tRNA基因一般都比原核tRNA基因多得多，如酵母約有400個(gè)tRNA基因；(3)5端單磷酸核苷酸，表明已被加工過(guò)；(4)tRNA的前體分子中含有內(nèi)含子。真核tRNA內(nèi)含子的特點(diǎn)：位置相同，都在反密碼子環(huán)的下游；不同tRNA的內(nèi)含子長(zhǎng)度和序列各異；外顯子和內(nèi)含子交界處無(wú)保守序列；內(nèi)含子的剪切是依靠RNase異體催化；內(nèi)含子和反密碼子配對(duì)形成莖環(huán)，有何意義？酵母tRNAPhe內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)真核tRNA的加工和原核的區(qū)別：真核tRNA前體中無(wú)二聚體和多聚體；增加了剪接內(nèi)含子的過(guò)程；)都要加CCA

34、。真核tRNA的加工多以酵母為材料進(jìn)行研究。同樣通過(guò)誘變可以獲得tRNA加工的溫度敏突變型，來(lái)獲得未加工的tRNA前體，然后在體外加入野生型酵母細(xì)胞的抽提物和ATP來(lái)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酵母tRNA的加工主要分成二步：切除內(nèi)含子；連接外顯子1.內(nèi)含子的切除酵母tRNA在未處理前先進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果只顯示一條帶，且跑得較慢，表明此為tRNA的前體分子；當(dāng)加入核酸內(nèi)切酶后無(wú)需加入ATP，反應(yīng)后再走電泳，結(jié)果出現(xiàn)二條帶，一條是剪切后游離出的內(nèi)含子，另一條是互補(bǔ)的外顯子，稱為tRNA的半分子（tRNAhalf-molecules）。圖6-酵母tRNA在體外的剪切真核tRNA內(nèi)含子切除的特點(diǎn)：(1)沒(méi)有交界序

35、列，也沒(méi)有內(nèi)部引導(dǎo)序列；(2)剪切反應(yīng)的信號(hào)是二級(jí)結(jié)構(gòu)，而不是一級(jí)結(jié)構(gòu)；(3)是依賴于蛋白質(zhì)性的RNase，而不是核糖擬酶或snRNP；(4)反應(yīng)的本質(zhì)不是轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。酵母tRNA前體內(nèi)含子3和5端的剪切是由內(nèi)切酶的不同亞基催化的。亞基Sen34,Sen15剪切3端，Sen54可能通過(guò)量度成熟結(jié)構(gòu)的距離來(lái)決定5端剪切位點(diǎn)的位置。2.連接外顯子切除tRNA內(nèi)含子的核酸酶很特殊，不是形成3-OH和5-P，而是產(chǎn)生了2-3環(huán)磷酸和5-OH，因此不能直接連接。必須通過(guò)環(huán)磷酸二酯酶（phosphodiesterase）將2-3環(huán)磷酸打開，形成3-OH，2-P。此步反應(yīng)無(wú)須ATP。5端須在激酶作用下將5-O

36、H磷酸化，再通過(guò)連接酶將兩個(gè)半分子連接起來(lái)。5磷酸化需要ATP的參加。酵母tRNA前體的體外剪切真核tRNA的加工和原核的區(qū)別(1)真核tRNA前體中無(wú)二聚體和多聚體；(2)增加了剪接內(nèi)含子的過(guò)程；(3)都要加CCA。(二)真核rRNA的加工真核生物的18S，5.8S和28SrRNA基因是串聯(lián)在一起形成一個(gè)轉(zhuǎn)錄本，初始轉(zhuǎn)錄本為45S前體，5SRNA是和它們分開轉(zhuǎn)錄的，這和原核的rRNA基因不同。在真核的rRNA加工中rRNA和其他的真核基因也不同，它沒(méi)有內(nèi)含子，因此加工時(shí)，無(wú)需剪切內(nèi)含子這一步。真核細(xì)胞中rRNA的加工途徑：(1)切除5端的前導(dǎo)序列,即外部的轉(zhuǎn)錄間隔序列（ETS）；(2)從41

37、S的中間產(chǎn)物中先切下18S的片段。Hela(人類)細(xì)胞的切點(diǎn)在18S和5.8S之間的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔序列（ITS），產(chǎn)物分別為20S（含18SrRNA片段）和32S。(3)部分退火，32S中間產(chǎn)物（含5.8S和28SrRNA）中的5.8S和28S之間進(jìn)行退火，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；(4)最后修正：通過(guò)外切酶等將20S中和已退火的32S中殘余的ITS切除掉。酵母rRNA前體的剪切二前體mRNA的加工1原核生物mRNA的加工原核生物的mRNA很少經(jīng)過(guò)加工，由于轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)，一般情況下一邊轉(zhuǎn)錄一邊就進(jìn)行翻譯，中間沒(méi)有可加工的間歇時(shí)間。但在少數(shù)情況下多順?lè)醋觤RNA先被內(nèi)切酶切成較小的單位再成為翻譯的模板。例如

38、E.coli基因組上89-90處有一個(gè)操縱子含有4個(gè)基因：rplj(L10)，rplL(L7/L12)(核糖體大亞基蛋白)和rpoB(RNA聚合酶b亞基)，rpoC（RNA聚合酶的b亞基）。它先轉(zhuǎn)錄一個(gè)單個(gè)的多順?lè)醋觤RNA，然后經(jīng)RNase將其切開，四個(gè)基因兩兩分開，最后再各自進(jìn)行翻譯。T7噬菌體早期轉(zhuǎn)錄區(qū)中含有6個(gè)基因，它們同在一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位中，轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生一個(gè)大的多順?lè)醋觤RNA，每個(gè)mRNA之間存在著莖環(huán)結(jié)構(gòu)。由RNase在莖環(huán)處切開前體RNA分子，形成單個(gè)的mRNA進(jìn)行翻譯。Rnase對(duì)T7的切割和rRNA前體的切割有所不同。切點(diǎn)在不配對(duì)的“泡”上，而不在莖上。T7噬菌體早期區(qū)轉(zhuǎn)錄單條前

39、體RNA，經(jīng)RNase剪切成5條成熟的mRNARNase在T7莖環(huán)上的典型切割位點(diǎn)(GENESVIFig12.47)2真核mRNA前體的加工mRNA前體分子的加工主要是真核mRNA。(一)核內(nèi)不均一RNA（heterogenousnuclearRNA,hnRNA）在真核細(xì)胞核內(nèi)可以分離到一類含量很高，分子量很大但不穩(wěn)定的RNA，稱為核內(nèi)不均一RNA平均分子長(zhǎng)度為8-10Kb(2Kb14Kb)左右.比mRNA的平均長(zhǎng)度(1.8-2Kb)要大4-5倍。hnRNA僅有總量的1/2轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，其余的都在核內(nèi)被降解掉。hnRNA是mRNA前體的證據(jù)是：(1)hnRNA和mRNA有相同的序列；(2)h

40、nRNA在體外能作為模板翻譯蛋白；(3)兩者5端都有帽子結(jié)構(gòu)；(4)二者為相同的聚合酶所合成；(5)兩者的3端都有多聚腺苷尾巴。hnRNA的結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)(1)5端有帽結(jié)構(gòu)；(2)3端有poly（A）尾巴；(3)帽結(jié)構(gòu)后有3個(gè)寡聚U區(qū)，每個(gè)長(zhǎng)約30nt；(4)有重復(fù)序列，位于寡聚U區(qū)后面；(5)有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，可能分布于編碼區(qū)（非重復(fù)序列）的兩側(cè)；(6)非重復(fù)序列中有內(nèi)含子區(qū)。hnRNA的結(jié)構(gòu)模型(二)真核mRNA的前體加工真核mRNA的加工一般要經(jīng)過(guò)四步：1、5加帽；2、3加尾；3、切除內(nèi)含子；4、修飾：對(duì)某些堿基進(jìn)行甲基化。RNA的剪接圖真核mRNA的加工1.加帽mRNA的5端的修飾是在細(xì)胞核中進(jìn)

41、行的。5端的一個(gè)核苷酸總是7-甲基鳥核苷三磷酸（m7Gppp）。mRNA5端的這種結(jié)構(gòu)稱為帽子（cap）。帽子結(jié)構(gòu)功能：有助于mRNA越過(guò)核膜，進(jìn)入胞質(zhì)；保護(hù)5不被酶降解；m7Gppp結(jié)構(gòu)能有效地封閉mRNA5末端，以保護(hù)mRNA免受5核酸外切酶的降解，增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定。翻譯時(shí)供IF（起始因子）和核糖體識(shí)別。(1)剪接前加帽如呼腸病毒，牛豆病毒(2)剪切后加帽如皰疹病毒和口炎病毒真核生物剪切前加帽的生化反應(yīng)過(guò)程真核生物剪切后加帽的生化反應(yīng)過(guò)程帽子的類型在末端鳥苷的第7位上存在單個(gè)甲基化位點(diǎn)的稱O型帽子（capO）；在次末端核苷酸的核糖上的2-0位點(diǎn)上還有一個(gè)甲基位點(diǎn)的稱1型帽子(cap1)；

42、此外，在第三個(gè)核苷酸的核糖上（2-0）有甲基化位點(diǎn)的稱2型帽子（cap2）。這三種帽子都有特殊面對(duì)面核苷酸結(jié)構(gòu)（confrontdenucleotidestructure）。三種5帽結(jié)構(gòu)形式圖mRNA5端的帽子位置和可被甲基化的位點(diǎn)2、加尾3端-約長(zhǎng)200bp(大多數(shù)Euk.的mRNA)（poly(A)+poly(A)-）最近研究發(fā)現(xiàn)，原核生物的RNA轉(zhuǎn)錄后也有3添加poly(A)的現(xiàn)象E.coli的poly(A)+聚合酶早在1962年就已發(fā)現(xiàn)poly(A)的功能1）可能與核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)2）與mRNA的壽命有關(guān)3）與翻譯有關(guān)，增強(qiáng)翻譯效率a、缺失可抑制體外翻譯的起始b、胚胎發(fā)育中，poly(A)

43、對(duì)其mRNA的翻譯有影響（非poly(A)化的為儲(chǔ)藏形式）c、對(duì)含poly(A)的mRNA失去poly(A)可減弱其翻譯加尾過(guò)程(1)特殊組分(CPSF)識(shí)別AAUAAA并指導(dǎo)其它的活性(2)剪切因子(CF)在加尾位點(diǎn)AAUAAA下游1130nt處剪切RNA；(3)末端腺苷轉(zhuǎn)移酶poly(A)聚合酶合成poly(A)尾巴；(4)PBP與poly(A)結(jié)合，反應(yīng)停止。3，端加尾三內(nèi)含子的剪接1概述(1)RNA拼接（RNAsplicing）一個(gè)基因的外元和內(nèi)元共同轉(zhuǎn)錄在一條轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，將內(nèi)元去除而把外元連接起來(lái)形成成熟RNA分子的過(guò)程。拼接點(diǎn)：5拼接點(diǎn)或左拼接點(diǎn)（內(nèi)元上游）3拼接點(diǎn)或右拼接點(diǎn)（下游

44、）(2)內(nèi)元的分類1982Davies等人中部核心結(jié)構(gòu)（centralcorestructure）:在有些內(nèi)元中，含有4個(gè)重復(fù)的保守序列，長(zhǎng)度為1020bp，4個(gè)保守序列構(gòu)成一種二級(jí)結(jié)構(gòu)，在拼接中起重要作用由于并非所有的內(nèi)元都有中部核心結(jié)構(gòu)，所以有了內(nèi)元的分類：類內(nèi)元（group）:含有中部核心結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器基因核基因類內(nèi)元（group）:不含有中部核心結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器線粒體基因核基因類內(nèi)元（group）:具有GUAG特征的邊界序列，核基因mRNA前體tRNA基因的內(nèi)元均位于tRNA的反密碼環(huán)上(3)拼接方式方式一：由拼接裝置完成（核mRNA內(nèi)元）可供識(shí)別的特異序列，拼接裝置由多種蛋白質(zhì)和核蛋白組成

45、方式二：自我拼接(兩類內(nèi)元、)形成特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，RNA具有催化拼接的能力方式三：需要蛋白質(zhì)酶參與的拼接（酵母tRNA）前兩種拼接都屬于轉(zhuǎn)酯反應(yīng)(4)核酶(Ribozyme)1981年T.Cech和S.Atman等在研究四膜蟲rRNA時(shí)發(fā)現(xiàn)的；T.Cech由核糖核酸（ribonucleicacid）和酶（enzyme）這兩個(gè)詞“重組”成一個(gè)新的詞：“Ribozyme”；是指本質(zhì)為RNA或以RNA為主含有蛋白質(zhì)輔基的一類具有催化功能的物質(zhì)。核酶和傳統(tǒng)酶的區(qū)別：=1*GB3一般的酶是純的蛋白質(zhì)，而核酶是RNA或帶有蛋白的RNA；=2*GB3核酶既是催化劑又是底物。而酶僅催化反應(yīng)。核酶發(fā)現(xiàn)的意義=1

46、*GB3突破了酶的概念.是一種自體催化；=2*GB3揭示了內(nèi)含子自我剪接的奧秘；促進(jìn)了RNA的研究。=3*GB3為生命的起源和分子進(jìn)化提供了新的依據(jù)。遺傳信息的進(jìn)化路線可能是：RNA(DNA表達(dá))(DNADNA)(DNA表達(dá))RNARNA表達(dá)|RNA病毒反轉(zhuǎn)錄病毒EB,HBVDNA病毒酶組成的進(jìn)化路線可能是：純RNARNA為主RNA和蛋白為主純蛋白蛋白為輔蛋白并重RNA為輔核酶RNAaseP？端粒酶一般酶類核酶-真核生物rRNA的自身剪切四膜蟲26SrRNA核酶（ribozyme）應(yīng)用前體7.4kb414bp內(nèi)含子5.986kb無(wú)酶催化，自身剪接具有催化功能的RNA切割特異性RNA序列具特定的

47、二級(jí)結(jié)構(gòu)-槌頭結(jié)構(gòu)人工合成核酶的槌頭結(jié)構(gòu)破壞HIV病毒核酶催化的反應(yīng)分為自體催化和半自體催化兩類自體催化包括類內(nèi)含子的自我剪接；型內(nèi)含子的自我剪接；植物類病毒和擬病毒的自我剪切。半自體催化包括：核mRNA內(nèi)含子的剪接；錐蟲SLRNA的反式拼接；tRNA5加工，此項(xiàng)不屬于轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，但也是核酶的活性之一。2I型內(nèi)含子的剪接型自我剪接內(nèi)含子在線粒體基因組中發(fā)現(xiàn)，也存在于極少數(shù)單細(xì)胞真核生物(如嗜熱四膜蟲的rRNA)的核基因組中。原核體系中少數(shù)內(nèi)含子也是型內(nèi)含子（如T4噬菌體胸苷酸合成酶基因）。型自我剪接內(nèi)含子的發(fā)現(xiàn)Cech等1981年用四膜蟲（Tetrahymenothermophila）為材料來(lái)研

48、究真核生物染色體的結(jié)構(gòu)對(duì)基因表達(dá)的影響，他們進(jìn)一步分離得到了35S的前體rRNA，它含有一個(gè)長(zhǎng)413bp的內(nèi)含子。這個(gè)35SrRNA無(wú)論是否加入核的抽取物，只要加入一價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子及GTP，就可以在體外釋放出413b的線性內(nèi)含子，若繼續(xù)保溫，那么線形內(nèi)含子又可形成環(huán)狀的RNA（圖）。四膜蟲35SRNA保溫前后的電泳結(jié)果型自我剪接內(nèi)含子的發(fā)現(xiàn)這就意味著35SRNA在GTP的作用下可以自我剪接。為了弄清這個(gè)問(wèn)題，防止少量酶含在其中造成假象，他們又用了大量的SDS-酚來(lái)抽提，以較徹底地脫蛋白，或用蛋白酶來(lái)處理，但結(jié)果仍然可以自主剪接（self-splicingorautosplicing）。型自我剪

49、接內(nèi)含子的發(fā)現(xiàn)1986年女科學(xué)家Grabowski,P.J.發(fā)現(xiàn)L-19可以催化5聚胞苷（5XpC）聚合為多聚胞苷（圖）更加無(wú)可辯駁地證實(shí)了四膜蟲rRNA內(nèi)含子確實(shí)具有酶的催化功能，建立一種嶄新的概念“核酶”。L-19內(nèi)含子可以催化5聚胞苷(5XpC)聚合為多聚胞苷。(一)I類內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是(1)其邊界序列為5U-G3；(2)具有中部核心結(jié)構(gòu)（Centralcorestrucature）(3)內(nèi)部引導(dǎo)順序（internalguideseguenceIGS）圖類內(nèi)含子中含有的共同的二級(jí)結(jié)構(gòu)內(nèi)含子活性的檢測(cè)圖表示構(gòu)建一個(gè)重組DNA，轉(zhuǎn)化到在E.coli中表達(dá)。將自我剪接的內(nèi)含子插到-半乳糖苷酶

50、的第10個(gè)密碼中，再轉(zhuǎn)化-gal-E.coli，若此內(nèi)含子不被剪接的話，-半乳糖苷酶基因受到破壞不能表達(dá)，菌株為白色，若能自我剪切，則-半乳糖苷酶基因可以翻譯成完整的酶，能使底物X-gal發(fā)酵變蘭。用此方法可以檢測(cè)內(nèi)含子是否具有自我剪接的活性。(二)I類內(nèi)含子的剪切機(jī)制轉(zhuǎn)酯反應(yīng)(transesterification):酯鍵從一個(gè)位置轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位置。具體的拼接過(guò)程：第一步：游離G發(fā)動(dòng)的轉(zhuǎn)酯反應(yīng),G的3-OH攻擊內(nèi)元的5拼接點(diǎn)；第二步：游離外元（左）發(fā)動(dòng)的轉(zhuǎn)酯反應(yīng),左外元的3-OH攻擊3拼接點(diǎn)，同時(shí)釋放線狀的內(nèi)元，形成成熟RNA分子。3類內(nèi)含子的剪接型內(nèi)含子在植物和低等真核生物的細(xì)胞器基因組中

51、發(fā)現(xiàn)。類內(nèi)含子的剪接和I類內(nèi)含子不同，而和核mRNA內(nèi)含子的剪切有些相似。但也有不同之處。(一)類內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)邊界序列為5GUGCGYnAG；有6個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)；有分支點(diǎn)順序（branch-pointseguence）(二)類內(nèi)含子的剪接機(jī)制無(wú)需鳥苷的輔助，但需鎂離子的存在。第一步：分枝點(diǎn)A的2-OH對(duì)5端交界處的磷酸二酯鍵發(fā)動(dòng)親核進(jìn)攻，切下外顯子1，內(nèi)含子5的邊界序列上的G與5磷酸和分枝點(diǎn)A的2-OH形成磷酸二酯鍵，產(chǎn)生了套索（lariat）結(jié)構(gòu)（圖）；第二步：切下的外顯子1其3-OH繼續(xù)對(duì)內(nèi)含子3端的交界序列進(jìn)行親核進(jìn)攻，同時(shí)釋放出套索狀的內(nèi)含子。圖類內(nèi)含子剪接的模式4核mRNA剪接體的剪

52、接真核生物基因組中的大多數(shù)內(nèi)含子都不能自身催化剪接，稱為核pre-mRNA內(nèi)含子(nuclearpre-mRNAintrons)。這些內(nèi)含子的左端(5端)均為GT，右端(3端)均為AG，稱為GT-AG規(guī)則，對(duì)應(yīng)于RNA為GU-AG。這些位點(diǎn)決定了內(nèi)含子的邊界，其改變或缺失的突變將影響正確剪接。(一)核mRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(1)邊界順序:符合GU-AG法則。(2)分枝點(diǎn)順序：為Py80NPy87Pu75APy95其中A為百分之百的保守，且具有2-OH。(3)內(nèi)含子5端有一保守序列可以和U1snRNA的5端的保守順序互補(bǔ)。(二)剪接機(jī)制(1)相關(guān)概念多數(shù)真核細(xì)胞核內(nèi)存在許多種類的小分子RNA，其大小

53、在100-300nt左右，稱為核內(nèi)小RNA(smallnuclearRNA,snRNA)。snRNA序列中含有較多的尿嘧啶，因而又被稱為U-RNA，又稱U-系列。snRNA能與幾個(gè)或幾十個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合，形成核糖核蛋白(RNP)，稱為snRNP。U1,U2,U5和U4/U6snRNP參與hnRNA的剪接；U3snRNP與rRNA前體的加工有關(guān)。核pre-mRNA內(nèi)含子的剪接過(guò)程與型內(nèi)含子RNA的剪接相似，區(qū)別在于前者由剪接體完成，后者由內(nèi)含子自我催化完成。(1)拼接機(jī)制拼接體（spliceosome）組裝第一次轉(zhuǎn)酯：左外元、內(nèi)元剪切套索第二次轉(zhuǎn)酯：exons連接、套索狀內(nèi)元釋放拼接體(spliceosome)解體與lariat降解同步圖拼接體（spliceosome）組裝圖核mRNA的剪接反應(yīng)四、RNA編輯1編輯的發(fā)現(xiàn)編輯（editing）是指轉(zhuǎn)錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基的加入，丟失或轉(zhuǎn)換等現(xiàn)象。1987.R.Benne在研究錐蟲線粒體mRNA轉(zhuǎn)錄加工時(shí)發(fā)現(xiàn)mRNA的多個(gè)編碼位置上加入或丟失尿苷酸，1990年在高等動(dòng)物和病毒中也發(fā)現(xiàn)了編輯現(xiàn)象。RNA編輯:（1）是一種與RNA加帽、加尾、剪接不同的RNA加工形式。（2）轉(zhuǎn)錄后改變RNA的序列，使熟RNA的序列與基因組DNA序列不同。（3）生物學(xué)中心法則的補(bǔ)充，擴(kuò)大了mR