Bcl2、Bax和Caspase3在酒精性肝病大鼠肝組織中的表達和五田保肝液的干預(yù)作用

1、Bcl-2、Bax和Caspase-3在酒精性肝病大鼠肝組織中的表達和五田保肝液的干預(yù)作用 作者：畢業(yè)東，蘇金玲，安先鳳，宋星星，范英昌【摘要】 目的研究Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA在酒精性肝病大鼠肝組織中的表達變化及五田保肝液對其表達的干預(yù)作用。方法選用健康清潔級雄性Wistar大鼠64只，隨機分為對照組10只;模型組、中藥治療組、陽性對照組各18只。采用62度白酒(10 mlkg-1d-1)、玉米油(2 mlkg-1d-1)、吡唑(25 mgkg-1d-1)混合物灌胃的方法建立大鼠酒精性肝病模型。12周末處死大鼠，取肝組織采用熒光實時定量RT-PCR法檢測Bcl-2、B

2、ax和Caspase-3 mRNA的表達。結(jié)果模型組Bcl-2基因表達較之對照組和中藥治療組顯著性降低(P0.05);模型組Bax 、Caspase-3基因表達較之其它各組均明顯升高(P0.05);中藥治療組和陽性對照組Bcl-2、 Bax 、Caspase-3基因表達差異亦不具有顯著性(P0.05)。結(jié)論大量飲酒可通過下調(diào)Bcl-2基因的表達，上調(diào)Bax 、Caspase-3基因的表達促進肝細胞的凋亡，導(dǎo)致肝損傷。而五田保肝液可通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的表達，抑制肝細胞的凋亡，起到保肝護肝作用。 【關(guān)鍵詞】 五田保肝液;Bcl-2;Bax;Caspase-3;

3、酒精性肝病;大鼠酒精性肝病(Alcoholic Liver Disease，ALD)的發(fā)生與多種因素關(guān)系密切。其中，長期大量飲酒通過各種機制誘導(dǎo)的肝細胞凋亡是ALD發(fā)生發(fā)展的重要原因。在長期的臨床實踐中證明五田保肝液(專利號：ZL021581703)對ALD有預(yù)防和治療作用，但是其具體發(fā)揮作用的靶點和機制不清。本文擬探討五田保肝液是否對酒精性肝病大鼠肝細胞的凋亡具有干預(yù)作用。1材料與儀器1.1動物清潔級健康Wistar大鼠64只，雄性，6周齡，體質(zhì)量(20020) g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物所提供。1.2材料和儀器實驗用酒為62度牛欄山二鍋頭，由北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。五田保肝液由深圳

4、市三九現(xiàn)代中藥有限公司提供;陽性對照藥物易善復(fù)(多烯磷脂酰膽堿膠囊)生產(chǎn)單位為賽諾菲安萬特(北京)制藥有限公司，批號/BN：D8099，規(guī)格228 mg。RNA提取試劑盒RNA-Solv Reagent購自O(shè)mega公司;SYBR PrimeScript TM RT-PCR Kit試劑盒購自TaKaRa公司。ABI7300熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，2700型PCR System擴增儀為Applied Biosystems公司產(chǎn)品。2方法2.1實驗分組和動物模型制備適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，64只大鼠隨機分為4組：對照組10只，模型組、中藥治療組、陽性對照組各18只。造模方法1：模型組、中藥治

5、療組和陽性對照組大鼠均以62度牛欄山二鍋頭酒(10 mlkg-1d-1)、玉米油(2 mlkg-1d-1)、吡唑(25 mgkg-1d-1)混合物灌胃,2次/d,早晚各1次。中藥治療組、陽性對照組、模型組大鼠于兩次灌胃之間分別給予相當于成人等劑量的五田保肝液(1 020 mgkg-1d-1)、易善復(fù)(123.12 mgkg-1d-1)和相應(yīng)劑量的生理鹽水灌胃，對照組則每日3次以生理鹽水灌胃。各組大鼠實驗期間均予全價營養(yǎng)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由進食飲水。造模時間為12周。2.2熒光實時定量RT-PCR檢測凋亡相關(guān)的基因表達2.2.1引物的設(shè)計及合成Bcl-2引物序列：forward：5-TGAACCG

6、GCATCTGCACAC-3; revese：5-CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG-3;Bax引物序列：forward：5-CGGCGAATTGGAGATGAACTG-3;revese：5-AGCAAAGTAGAAGAGGGCAACC-3;Caspase-3引物序列：forward：5- CAGACAGTGGAACTGACGAT -3;revese：5- TTTCAGCATGGCGCAAAGTG -3。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司使用美國PE公司391型DNA自動合成儀合成引物。2.2.2標本的留取和處理造模12周末頸椎脫臼處死大鼠，大鼠處死前12 h禁食水。處死大鼠后迅速剖

7、腹取出肝臟，冰生理鹽水沖洗，取肝右葉部分組織置于凍存管后迅速投入液氮中冷凍保存，以備檢測分子生物學(xué)指標。所有手術(shù)器械均經(jīng)DEPC水浸泡和高壓滅菌消毒處理。2.2.3總RNA的提取和檢測按RNA-Solv Reagent的操作說明書提取大鼠肝組織總RNA，紫外分析及瓊脂糖電泳檢測總RNA的純度、濃度及完整性。2.2.4逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反應(yīng)條件如下:反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)85，15 min，反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)95，30 s。2.2.5熒光實時定量PCR檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達反應(yīng)條件如下:第1步是預(yù)變性, 95, 30 s(1個循環(huán))。第2步是PCR反應(yīng), 95, 5 s; 60, 3

8、1 s(40個循環(huán))。反應(yīng)結(jié)束后,使用7300 system SDS software軟件分析PCR過程中樣本的CT(Threshold cycle)值，每個標本設(shè)3個復(fù)孔，計算平均CT值，每一次反應(yīng)均設(shè)定陰性對照。采用2-CT計算各目的基因相對反應(yīng)起始拷貝數(shù)，以GAPDH為內(nèi)參。2.3統(tǒng)計方法用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以s表示，各組數(shù)據(jù)比較采用one-way ANOVA方法檢驗。3結(jié)果3.1各組大鼠一般情況比較對照組大鼠健康狀況良好，整個實驗過程無一只死亡。模型組大鼠精神萎靡，毛發(fā)干枯蓬亂，部分大鼠出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象，食量減少，大便稀，小便黃。至造模結(jié)束，體質(zhì)量增長不明顯。至

9、12周末，因酒精誤入氣管死亡3只，因急慢性酒精中毒死亡7只。中藥治療組和陽性對照組大鼠情況好于模型組，精神較活躍，體質(zhì)量增加較模型組快，均因酒精誤入氣管死亡5只，因急慢性酒精中毒死亡4只。3.2PCR產(chǎn)物鑒定各產(chǎn)物的熔解曲線僅有1個峰,說明為單一片段擴增,熔解溫度分別為GAPDH 85.3,Bax 86.4,Bcl-2為84.6，Caspase-3為83.9。3.3各組大鼠肝臟組織Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的表達模型組Bcl-2基因表達較之對照組和中藥治療組顯著性降低(P0.05);模型組Bax 、Caspase-3基因表達較之其它各組均明顯升高(P0.05);中藥治療組

10、和陽性對照組Bcl-2、 Bax 、Caspase-3基因表達差異亦不具有顯著性(P0.05)。結(jié)果見表1。表1各組大鼠肝組織Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的表達情況4討論目前，酒精濫用和依賴已成為日益嚴重的公共衛(wèi)生問題。大量長期飲酒可導(dǎo)致ALD，在病理組織學(xué)上ALD可分為酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化、酒精性肝硬化幾種常見類型 2。近年來國內(nèi)外對ALD的發(fā)病機制進行了大量研究，認為乙醇和其代謝產(chǎn)物的直接毒性作用以及造成機體的代謝紊亂，自身抗體形成、過氧化反應(yīng)、線粒體損傷、自由基的形成和氧利用障礙等均可引起肝損傷3。新近研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡在ALD的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮

11、重要的促進作用4。凋亡是不同于壞死的一種細胞死亡形式，是細胞在生理或病理信號刺激下啟動自身凋亡基因發(fā)生的主動自殺行為。凋亡目前被認為是保持組織自穩(wěn)態(tài)的一個基本過程,但是過度凋亡則會引起組織損傷，進而導(dǎo)致功能障礙。細胞凋亡受促進凋亡因子和抑制凋亡因子的共同調(diào)節(jié)，其中發(fā)揮最主要作用的是Bcl-2家族和Caspase家族。Bcl-2家族和凋亡關(guān)系最密切的是Bcl-2和Bax。Bcl-2蛋白發(fā)揮抗凋亡作用，而Bax蛋白發(fā)揮促凋亡作用，二者作用的整合決定細胞的生死。單體的Bax不能誘導(dǎo)細胞凋亡，其誘導(dǎo)細胞凋亡的方式一種是與Bcl-2結(jié)合成異源二聚體而抑制Bcl-2的抗凋亡作用，一種是Bax表達過量，形成

12、同源二聚體，直接啟動或誘導(dǎo)細胞凋亡。如果Bcl-2過量表達，則形成Bcl-2同源二聚體，抑制細胞的凋亡5。綜上所述，細胞內(nèi)兩類蛋白的含量和功能狀態(tài)之間的平衡是細胞調(diào)控凋亡的重要機制，當Bcl-2的含量高于Bax時，抑制了細胞的凋亡;而當Bax的含量高從而形成Bax同源二聚體時，則細胞趨于凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠Bcl-2的表達水平比對照組顯著降低，而Bax的表達水平卻明顯升高，這時形成Bax同源二聚體，加速肝細胞的凋亡，促進肝臟的損傷。而中藥治療組和陽性對照組的Bcl-2、Bax水平和對照組相比差別不具有顯著性，提示五田保肝液主要是通過提高Bcl-2的表達，降低Bax的表達來抑制肝細胞的凋

13、亡，起到保肝作用。Caspase家族成員到目前為止已區(qū)分了14種，根據(jù)它們假定的功能和同源順序，Caspase通常被分為3組：凋亡啟動因子、凋亡執(zhí)行因子和炎性介導(dǎo)因子。凋亡執(zhí)行因子包括Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7。尤其是Caspase-3在介導(dǎo)細胞凋亡的過程中發(fā)揮重要作用6。本研究另外發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠Caspase-3的表達顯著高于對照組，因此可得出結(jié)論Caspase-3的表達升高也是酒精造成大鼠肝細胞凋亡的另外一個分子機制。而中藥治療組和陽性對照組Caspase-3的表達與對照組無明顯差別，說明五田保肝液可以通過抑制Caspase-3的上調(diào)而起到抑制肝細胞凋亡的

14、效果。但是，凋亡的調(diào)節(jié)是極其復(fù)雜的。新近研究證明，Bcl-2可通過阻止Caspase-3的激活而降低細胞凋亡的發(fā)生，一旦Caspase-3被激活，Bcl-2蛋白將被Caspase-3酶解成較短的22kDa的片段，其功能發(fā)生了根本轉(zhuǎn)變，抑制凋亡轉(zhuǎn)換為觸發(fā)凋亡7。由此可發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族和Caspase家族在調(diào)節(jié)凋亡上的作用是密切相關(guān)的。長期臨床應(yīng)用顯示了五田保肝液有良好的降酶、降脂等治療作用，觀察各類脂肪肝128例，4周后結(jié)果顯示其中64例為觀察組總有效率為95.31%(P0.01)，肝功能、血脂等血生化指標明顯改善(P0.05,0.01),臨床癥狀如肝區(qū)隱痛、乏力、腹脹等改善率好于對照組(P0

15、.05)。通過“清肝化濕、分化通經(jīng)、解毒祛瘀”來實現(xiàn)保肝作用8。經(jīng)過我們的研究結(jié)果表明，五田保肝液對酒精誘導(dǎo)的大鼠肝細胞凋亡的干預(yù)作用機制是復(fù)雜的，對Bcl-2家族和Caspase-3的表達均發(fā)揮了一定作用，一方面通過促進Bcl-2的表達和下調(diào)Bax的表達，提高Bcl-2/Bax的比率而發(fā)揮抗凋亡，進而保肝的功效，另一方面，Bcl-2的表達提高也阻止了Caspase-3的進一步激活，而Caspase-3的激活減少也反過來使Bcl-2的降解減少，這樣一個級聯(lián)反應(yīng)最終使五田保肝液更有效地發(fā)揮抗肝細胞凋亡和保肝的功效。【參考文獻】 1陳宏輝,張明亮,陽學(xué)風(fēng),等.骨調(diào)素對巨噬細胞在酒精性肝纖維化肝組織

16、局部浸潤的影響J.肝臟, 2004, 9(4): 244.2吳曉楓,呂東霞.酒精性肝病的中西醫(yī)治療現(xiàn)狀J.中國現(xiàn)代醫(yī)生,2008, 46 (12):41.3Lieber CS. Microsomalethanol-oxidizing system(MEOX):the first 30years(1968-1998)-an eviewJ. Aleohol ClinExp Res，1999，23:991.4Setwart S, Jones D, Day CP. Alcoholic liver disease: mechanisms and preventative StrategiesJ. Tre

17、nds Mol MED,2001,7(9):408.5Klemm K, Eipel C, Cantr D,et al. Multiple doses of erythropoietin impair liver regeneration by increasing TNF-alpha, the Bax to Bcl-xL ratio and apoptotic cell deathJ.PLoS One,2008;3(12):e3924.6Watanabe M, Kitano T, Kondo T, et al. Increase of nuclear ceramide through casp