菌體濃度對發(fā)酵的影響

1、一、菌體濃度對發(fā)酵的影響及控制菌體(細(xì)胞)濃度(cellconcentration)是指單位體積培養(yǎng)液中菌體的含量。無論在科學(xué)研究上，還是在工業(yè)發(fā)酵控制上，它都是一個重要的參數(shù)。菌濃的大小，在一定條件下，不僅反映菌體細(xì)胞的多少，而且反映菌體細(xì)胞生理特性不完全相同的分化階段。在發(fā)酵動力學(xué)研究中，需要利用菌濃參數(shù)來算出菌體的比生長速率和產(chǎn)物的比生成速率等有關(guān)動力學(xué)參數(shù)，以研究它們之間的相互關(guān)系，探明其動力學(xué)規(guī)律，所以菌濃仍是一個基本參數(shù)。菌濃的大小與菌體生長速率有密切關(guān)系。比生長速率心大的菌體，菌濃增長也迅速，反之就緩慢。而菌體的生長速率與微生物的種類和自身的遺傳特性有關(guān)，不同種類的微生物的生長速

2、率是不一樣的。它的大小取決于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和生長機(jī)制，細(xì)胞結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，分裂所需的時間就越長。典型的細(xì)菌、酵母、霉菌和原生動物的倍增時間分別為45min、90min、3h和6h左右，這說明各類微生物增殖速率的差異。菌體的增長還與營養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境條件有密切關(guān)系。營養(yǎng)物質(zhì)包括各種碳源和氮源等成分和它們的濃度。按照Monod方程式來看，生長速率取決于基質(zhì)的濃度(各種碳源的基質(zhì)飽和系數(shù)Ks在110mg/L之間)，當(dāng)基質(zhì)濃度c(S)10Ks時，比生長速率就接近最大值。所以營養(yǎng)物質(zhì)均存在一個上限濃度，在此限度以內(nèi)，菌體比生長速率則隨基質(zhì)濃度增加而增加，但超過此上限，基質(zhì)濃度繼續(xù)增加，反而會引起生長速率下降。

3、這種效應(yīng)通常稱為基質(zhì)抑制作用。這可能是由于高濃度基質(zhì)形成高滲透壓，引起細(xì)胞脫水而抑制生長。這種作用還包括某些化合物(如甲醇、苯酚等)對一些關(guān)鍵酶的抑制，或使細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分發(fā)生變化。一些營養(yǎng)物質(zhì)的上限濃度(g/L)如下：葡萄糖100、NH4+5、PO43-10。在實際生產(chǎn)中，常用豐富培養(yǎng)基，促使菌體迅速繁殖，菌濃增大，引起溶氧下降。所以，在微生物發(fā)酵的研究和控制中，營養(yǎng)條件(含溶氧)的控制至關(guān)重要。影響菌體生長的環(huán)境條件有溫度、pH值、滲透壓和水分活度等因素。菌濃的大小，對發(fā)酵產(chǎn)物的得率有著重要的影響。在適當(dāng)?shù)谋壬L速率下，發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率與菌濃成正比關(guān)系，即P=QPmc(X)式中P發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率(

4、產(chǎn)物最大生成速率或生產(chǎn)率)，g/(Lh);QPm產(chǎn)物最大比生成速率，h-1；c(X)菌體濃度，gL。菌濃愈大，產(chǎn)物的產(chǎn)量也愈大，如氨基酸、維生素這類初級代謝產(chǎn)物的發(fā)酵就是如此。而對抗生素這類次級代謝產(chǎn)物來說，控制菌體的比生長速率心比心臨略高一點的水平，達(dá)到最適菌濃即c(X)臨,菌體的生產(chǎn)率最高。但是菌濃過高，則會產(chǎn)生其他的影響，營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，培養(yǎng)液的營養(yǎng)成分發(fā)生明顯的改變，有毒物質(zhì)的積累，就可能改變菌體的代謝途徑，特別是對培養(yǎng)液中的溶氧，影響尤為明顯。菌濃增加而引起的溶氧下降，會對發(fā)酵產(chǎn)生各種影響。早期酵母發(fā)酵，會出現(xiàn)代謝途徑改變、酵母生長停滯、產(chǎn)生乙醇的現(xiàn)象；抗生素發(fā)酵中，也受溶氧限制，

5、使產(chǎn)量降低。如圖7-7，為了獲得最高的生產(chǎn)率，需要采用攝氧速率OUR與傳氧速率OTR相平衡時的菌體濃度，也就是傳氧速率隨菌濃變化的曲線和攝氧速率隨菌濃變化的曲線的交點所對應(yīng)的菌體濃度，即臨界菌體濃度c(X)臨。菌體超過此濃度，抗生素的比生成速率和體積產(chǎn)率都會迅速下降。圖7-7攝氧速率OUR曲線與傳氧速率OTR曲線關(guān)系示意圖發(fā)酵過程中除要有合適的菌濃外，還需要設(shè)法控制菌濃在合適的范圍內(nèi)。菌體的生長速率，在一定的培養(yǎng)條件下，主要受營養(yǎng)基質(zhì)濃度的影響，所以要依靠調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的濃度來控制菌濃。首先要確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方中有適當(dāng)?shù)呐浔?，避免產(chǎn)生過濃(或過稀)的菌體量。然后通過中間補(bǔ)料來控制，如當(dāng)菌體生長緩慢

6、、菌濃太稀時，則可補(bǔ)加一部分磷酸鹽，促進(jìn)生長，提高菌濃；但補(bǔ)加過多，則會使菌體過分生長，超過c(X)臨，對產(chǎn)物合成產(chǎn)生抑制作用。在生產(chǎn)上，還可利用菌體代謝產(chǎn)生的CO2量來控制生產(chǎn)過程的補(bǔ)糖量，以控制菌體的生長和濃度。總之，可根據(jù)不同的菌種和產(chǎn)品，采用不同的方法來達(dá)到最適的菌濃?；|(zhì)對發(fā)酵影響及其控制基質(zhì)即培養(yǎng)微生物的營養(yǎng)物質(zhì)。對于發(fā)酵控制來說，基質(zhì)是生產(chǎn)菌代謝的物質(zhì)基礎(chǔ)，既涉及菌體的生長繁殖，又涉及代謝產(chǎn)物的形成。因此基質(zhì)的種類和濃度與發(fā)酵代謝有著密切的關(guān)系。所以選擇適當(dāng)?shù)幕|(zhì)和控制適當(dāng)?shù)臐舛?，是提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的重要方法。據(jù)Monod方程，在分批發(fā)酵中菌體比生長速度是基質(zhì)濃度的函數(shù)。在c（S

7、）1.1,糖經(jīng)EMP生成乙醇。不同基質(zhì)，菌的RQ不同。E.coli以延胡索酸為基質(zhì)，RQ=1.44;以丙酮酸為基質(zhì)，RQ=1.26;以琥珀酸為基質(zhì)，RQ=1.12;以乳酸、葡萄糖為基質(zhì)，RQ分別為1.02和1.00。在抗生素發(fā)酵中，由于存在菌體生長、維持及產(chǎn)物形成的不同階段，其RQ值也不一樣。青霉素發(fā)酵的理論呼吸商：菌體生長0.909,菌體維持1,青霉素合成4。從上述情況看，發(fā)酵早期，主要是菌生長，RQ1;過渡期菌體維持其生命活動，產(chǎn)物逐漸形成，基質(zhì)葡萄糖的代謝不僅僅用于菌體生長，RQ比生長期略有增加。產(chǎn)物形成對RQ的影響較為明顯，如產(chǎn)物還原性比基質(zhì)大，RQ增加；產(chǎn)物氧化性比基質(zhì)大，RQ就減少

8、。其偏離程度決定于每單位菌體利用基質(zhì)所形成的產(chǎn)物量。實際生產(chǎn)中測定的RQ值明顯低于理論值，說明發(fā)酵過程中存在著不完全氧化的中間代謝物和除葡萄糖以外的其他碳源。如發(fā)酵過程中加入消泡劑，由于它具有不飽和性和還原性，使RQ值低于葡萄糖為惟一碳源時RQ值。如試驗結(jié)果表明，青霉素發(fā)酵中，RQ為0.50.7之間，且隨葡萄糖與消泡劑加入量之比而波動。RQ是碳-能源代謝情況的指示值。在碳-能源限制及供氧充分的情況下，碳-能源趨向于完全氧化，RQ應(yīng)達(dá)到完全氧化的理論值，見表7-1o如果碳-能源過量及供氧不足，可能出現(xiàn)碳-能源不完全氧化的情況，從而造成RQ異常。表7-1一些碳-能源基質(zhì)的理論呼吸商四、CO2濃度的

9、控制CO2在發(fā)酵液中的濃度變化不像溶氧那樣，沒有一定的規(guī)律。它的大小受到許多因素的影響，如菌體的呼吸強(qiáng)度、發(fā)酵液流變學(xué)特性、通氣攪拌程度和外界壓力大小等因素。設(shè)備規(guī)模大小也有影響，由于CO2的溶解度隨壓力增加而增大，大發(fā)酵罐中的發(fā)酵液的靜壓可達(dá)0.1MPa以上，又處在正壓發(fā)酵，致使罐底部壓強(qiáng)可達(dá)0.15MPa。因此CO2濃度增大，如不提高攪拌轉(zhuǎn)數(shù)，CO2就不易排出，在罐底形成碳酸，進(jìn)而影響菌體的呼吸和產(chǎn)物的合成。為了控制CO2的不良影響，必須考慮CO2在培養(yǎng)液中的溶解度、溫度和通氣情況。在發(fā)酵過程中，如遇到泡沫上升而引起“逃液”時，采用增加罐壓的方法來消泡。但這樣會增加CO2的溶解度，對菌體生

10、長是不利的。CO2濃度的控制應(yīng)隨它對發(fā)酵的影響而定。如果CO2對產(chǎn)物合成有抑制作用，則應(yīng)設(shè)法降低其濃度；若有促進(jìn)作用，則應(yīng)提高其濃度。通氣和攪拌速率的大小，不但能調(diào)節(jié)發(fā)酵液中的溶解氧，還能調(diào)節(jié)CO2的溶解度，在發(fā)酵罐中不斷通入空氣，既可保持溶氧在臨界點以上，又可隨廢氣排出所產(chǎn)生的CO2，使之低于能產(chǎn)生抑制作用的濃度。因而通氣攪拌也是控制CO2濃度的一種方法，降低通氣量和攪拌速率，有利于增加CO2在發(fā)酵液中的濃度；反之就會減小CO2濃度。在3m3發(fā)酵罐中進(jìn)行四環(huán)素發(fā)酵試驗，發(fā)酵40h以前，通氣量減小到75m3/h,攪拌為80r/min,以此來提高CO2的濃度；40h以后，通氣量和攪拌分別提高到1

11、10m3/h和140r/min,以降低CO2濃度，使四環(huán)素產(chǎn)量提高25%30%。CO2形成的碳酸，還可用堿來中和，但不能用CaCO3。罐壓的調(diào)節(jié)，也影響CO2的濃度，對菌體代謝和其他參數(shù)也產(chǎn)生影響。CO2的產(chǎn)生與補(bǔ)料工藝控制密切相關(guān)，如在青霉素發(fā)酵中，補(bǔ)糖會增加CO2的濃度和降低培養(yǎng)液的pH值。因為補(bǔ)加的糖用于菌體生長、菌體維持和青霉素合成三方面，它們都產(chǎn)生CO2，使CO2量增加。溶解的CO2和代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸，又使培養(yǎng)液pH值下降。因此，補(bǔ)糖、CO2、pH值三者具有相關(guān)性，被用于青霉素補(bǔ)料工藝的控制參數(shù)，其中排氣中的CO2量的變化比pH值變化更為敏感，所以，采用測定CRR作為控制補(bǔ)糖速率參數(shù)

12、。第七節(jié)補(bǔ)料的控制補(bǔ)料分批發(fā)酵（fed-batchculture，簡稱FBC），又稱半連續(xù)培養(yǎng)或半連續(xù)發(fā)酵，是指在分批發(fā)酵過程中，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加一種或多種成分的新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法，是分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間的一種過渡培養(yǎng)方式，是一種控制發(fā)酵的好方法，現(xiàn)已廣泛用于發(fā)酵工業(yè)。同傳統(tǒng)的分批發(fā)酵相比，F(xiàn)BC具有以下的優(yōu)點：可以解除底物抑制、產(chǎn)物反饋抑制和分解代謝物的阻遏；可以避免在分批發(fā)酵中因一次投料過多造成細(xì)胞大量生長所引起的一切影響，改善發(fā)酵液流變學(xué)的性質(zhì)；可用作為控制細(xì)胞質(zhì)量的手段，以提高發(fā)芽抱子的比例；可作為理論研究的手段，為自動控制和最優(yōu)控制提供實驗基礎(chǔ)。同連續(xù)發(fā)酵相比，F(xiàn)BC不需要嚴(yán)格的

13、無菌條件，產(chǎn)生菌也不會產(chǎn)生老化和變異等問題，適用范圍也比連續(xù)發(fā)酵廣泛。由于FBC有這些優(yōu)點，現(xiàn)已被廣泛地用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)和研究中。如已應(yīng)用于酶類、抗生素類、激素藥物類、氨基酸和維生素等十余類幾十種工業(yè)產(chǎn)品中。一、FBC的作用FBC的操作比較簡單，效果也是比較明顯的。但是這種控制方法是建立在什么理論基礎(chǔ)上，對微生物的生理和產(chǎn)物的合成又能產(chǎn)生什么作用，我們應(yīng)該有個基本了解。已有研究結(jié)果表明，F(xiàn)BC對微生物發(fā)酵有下列幾個基本作用。.可以控制抑制性底物的濃度在許多發(fā)酵過程中，微生物的生長是受到基質(zhì)濃度的影響。要想得到高密度的生物量，需要投入幾倍的基質(zhì)。按monod方程，當(dāng)營養(yǎng)底物濃度增加到一定量時，

14、生長就顯示飽和型動力學(xué)，再增加底物濃度，就可能產(chǎn)生一種基質(zhì)抑制區(qū)，停滯期延長，菌體比生長速率減小，菌濃下降等。所以高濃度營養(yǎng)物對大多數(shù)微生物生長是不利的。抑制微生物生長有多種原因：有的基質(zhì)過濃使?jié)B透壓過高，細(xì)胞因脫水而死亡；高濃度基質(zhì)能使微生物細(xì)胞熱致死（themaldeath）,如乙醇濃度達(dá)10%時，就可使酵母細(xì)胞熱致死；有的是因某種或某些基質(zhì)對代謝關(guān)鍵酶或細(xì)胞組分產(chǎn)生抑制作用，如高濃度苯酚（3%5%）可凝固蛋白；高濃度基質(zhì)還會改變菌體的生化代謝而影響生長等。在微生物發(fā)酵中，有的基質(zhì)又是合成產(chǎn)物必需的前體物質(zhì)，濃度過高，就會影響菌體代謝或產(chǎn)生毒性，使產(chǎn)物產(chǎn)量降低。如苯乙酸、丙醇（或丙酸）分別

15、是青霉素、紅霉素的前體物質(zhì)，濃度過大，就會產(chǎn)生毒性，使抗生素產(chǎn)量減少。有的是受底物溶解度小的限制，達(dá)不到應(yīng)有的濃度而影響轉(zhuǎn)化率。如甾類化合物轉(zhuǎn)化中，因它們的溶解度小，使基質(zhì)的濃度低，造成轉(zhuǎn)化率不高。為了在分批發(fā)酵中，獲得高濃度菌體或產(chǎn)物，必須在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中防止有過高濃度的基質(zhì)或抑制性底物，采用FBC方式，就可以控制適當(dāng)?shù)幕|(zhì)濃度，解除其抑制作用，又可得到高濃度的產(chǎn)物。.可以解除或減弱分解代謝物的阻遏在微生物合成初級或次級代謝產(chǎn)物中，有些合成酶受到迅速利用的碳源或氮源的阻遏，特別是葡萄糖，它能夠阻抑多種酶或產(chǎn)物的合成，如纖維素酶、赤霉素、青霉素等。已知這種阻遏作用不是葡萄糖的直接作用，而是由葡萄

16、糖的分解代謝產(chǎn)物所引起的。通過補(bǔ)料來限制基質(zhì)葡萄糖的濃度，就可解除酶或其產(chǎn)物的阻遏，提高產(chǎn)物產(chǎn)量。如緩慢流加葡萄糖，纖維素酶的產(chǎn)量幾乎增加200倍；將葡萄糖濃度控制在0.02水平，赤霉素濃度可達(dá)905mgL；采用滴加葡萄糖的技術(shù)，可明顯提高青霉素的發(fā)酵單位等。這都是利用發(fā)酵技術(shù)解決分解代謝物阻遏的實際應(yīng)用。在植物細(xì)胞培養(yǎng)中，也采用該技術(shù)來提高產(chǎn)量。.可以使發(fā)酵過程最佳化分批發(fā)酵動力學(xué)的研究，闡明了各個參數(shù)之間的相互關(guān)系。利用FBC技術(shù)，就可以使菌種保持在最大生產(chǎn)力的狀態(tài)。隨著FBC補(bǔ)料方式的不斷改進(jìn)，為發(fā)酵過程的優(yōu)化和反饋控制奠定了基礎(chǔ)。隨著計算機(jī)、傳感器等的發(fā)展和應(yīng)用，已有可能用離線方式計算

17、或用模擬復(fù)雜的數(shù)學(xué)模型在線方式實現(xiàn)最優(yōu)化控制。二、補(bǔ)料的方式及控制補(bǔ)料方式有很多種情況，有連續(xù)流加、不連續(xù)流加或多周期流加。每次流加又可分為快速流加、恒速流加、指數(shù)速率流加和變速流加。從補(bǔ)加培養(yǎng)基的成分來分，又可分為單組分補(bǔ)料和多組分補(bǔ)料。流加操作控制系統(tǒng)又分為有反饋控制和無反饋控制兩類。這兩類的數(shù)學(xué)模型在理論上沒有什么差別。反饋控制系統(tǒng)是由傳感器、控制器和驅(qū)動器三個單元所組成。根據(jù)控制依據(jù)的指標(biāo)不同，又分為直接方法和間接方法。間接方法是以溶氧、pH值、呼吸商、排氣中CO2分壓及代謝產(chǎn)物濃度等作為控制參數(shù)。對間接方法來說，選擇與過程直接相關(guān)的可檢參數(shù)作為控制指標(biāo)，是研究的關(guān)鍵。這就需要詳盡考查

18、分批發(fā)酵的代謝曲線和動力學(xué)特性，獲得各個參數(shù)之間的有意義的相互關(guān)系，來確定控制參數(shù)。對于通氣發(fā)酵，利用排氣中CO2含量作為FBC反饋控制參數(shù)是較為常用的間接方法。如控制青霉素生產(chǎn)所用的葡萄糖流加的質(zhì)量平衡法，就是利用CO2的反饋控制。它是依靠精確測量CO2的釋放率CRR和葡萄糖的流動速度，達(dá)到控制菌體的比生長速率和菌濃。pH值也已用作糖的流加控制的參數(shù)。由于長期缺乏可靠的適時測定手段，無法控制適時補(bǔ)料，所以直接法一直沒有用于發(fā)酵控制。目前出現(xiàn)了各種類型生物傳感器，可供底物和產(chǎn)物的在線分析。但其應(yīng)用仍然存在一些問題（如耐熱性差），尚待解決。隨著一系列技術(shù)障礙的克服，該法將會得到迅速普及。反饋控制

19、的FBC，常常是依據(jù)個別指標(biāo)來進(jìn)行，在許多情況下，并不能奏效，尚需進(jìn)行多因子分析。為了改善發(fā)酵培養(yǎng)基的營養(yǎng)條件和去除部分發(fā)酵產(chǎn)物，F(xiàn)BC還可采用“放料和補(bǔ)料”（withdrawandfill）方法，也就是說，發(fā)酵一定時間，產(chǎn)生了代謝產(chǎn)物后，定時放出一部分發(fā)酵液（可供提煉），同時補(bǔ)充一部分新鮮營養(yǎng)液，并重復(fù)進(jìn)行。這樣就可以維持一定的菌體生長速率，延長發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)期，有利于提高產(chǎn)物產(chǎn)量，又可降低成本。所以這也是另一個提高產(chǎn)量的FBC方法，但要注意染菌等問題。第八節(jié)泡沫對發(fā)酵的影響及其控制一、泡沫的形成及其對發(fā)酵的影響在大多數(shù)微生物發(fā)酵過程中，由于培養(yǎng)基中有蛋白類表面活性劑（具有較高的表面張力）存在

20、，在通氣條件下，培養(yǎng)液中就形成了泡沫。泡沫是氣體被分散在少量液體中的膠體體系，氣液之間被一層液膜隔開，彼此不相連通。形成的泡沫有兩種類型：一種是發(fā)酵液液面上的泡沫，氣相所占的比例特別大，與液體有較明顯的界限，如發(fā)酵前期的泡沫；另一種是發(fā)酵液中的泡沫，又稱流態(tài)泡沫（fluidfoam），分散在發(fā)酵液中，比較穩(wěn)定，與液體之間無明顯的界限。發(fā)酵過程產(chǎn)生少量的泡沫是正常的。泡沫的多少一方面與發(fā)酵罐攪拌、通風(fēng)有關(guān)；另一方面，與培養(yǎng)基性質(zhì)有關(guān)。蛋白質(zhì)原料如蛋白胨、玉米漿、黃豆粉、酵母粉等是主要的發(fā)泡劑。糊精含量多也引起泡沫的形成。發(fā)酵過程中，泡沫的形成有一定的規(guī)律性。發(fā)酵時起泡的方式被認(rèn)為有五種：整個發(fā)酵

21、過程中，泡沫保持恒定的水平；發(fā)酵早期，起泡后穩(wěn)定地下降，以后保持恒定；發(fā)酵前期，泡沫稍微降低后又開始回升；發(fā)酵開始起泡能力低，以后上升；以上類型的綜合方式。這些方式的出現(xiàn)是與基質(zhì)的種類、通氣攪拌強(qiáng)度和滅菌條件等因素有關(guān)，其中基質(zhì)中的有機(jī)氮源（如黃豆餅粉等）是起泡的主要因素。當(dāng)發(fā)酵感染雜菌和噬菌體時，泡沫異常多。起泡會帶來許多不利因素，如發(fā)酵罐的裝料系數(shù)減少、液相體積氧傳遞系數(shù)減小等。泡沫過多時，影響更為嚴(yán)重，造成大量逃液，發(fā)酵液從排氣管路或軸封逃出而增加染菌機(jī)會等，嚴(yán)重時通氣攪拌也無法進(jìn)行，菌體呼吸受到阻礙，導(dǎo)致代謝異常或菌體自溶。所以，控制泡沫乃是保證正常發(fā)酵的基本條件。二、泡沫的消除泡沫的

22、控制，可以采用三種途徑：調(diào)整培養(yǎng)基中的成分（如少加或緩加易起泡的原材料）或改變某些物理化學(xué)參數(shù)（如pH值、溫度、通氣和攪拌）或者改變發(fā)酵工藝（如采用分次投料）來控制，以減少泡沫形成的機(jī)會。但這些方法的效果有一定的限度；采用機(jī)械消泡或消泡劑消泡這兩種方法來消除已形成的泡沫；還可以采用菌種選育的方法，篩選不產(chǎn)生流態(tài)泡沫的菌種，來消除起泡的內(nèi)在因素，如用雜交方法選育出不產(chǎn)生流態(tài)泡沫的土霉素生產(chǎn)菌株。對于已形成的泡沫，工業(yè)上可以采用機(jī)械消泡和化學(xué)消泡劑消泡或兩者同時使用消泡。.機(jī)械消泡這是一種物理消泡的方法，利用機(jī)械強(qiáng)烈振動或壓力變化而使泡沫破裂。有罐內(nèi)消泡和罐外消泡兩種方法。前者是靠罐內(nèi)消泡漿轉(zhuǎn)動打

23、碎泡沫；后者是將泡沫引到罐外，通過噴嘴的加速作用或利用離心力來消除泡沫。該法的優(yōu)點是：節(jié)省輔料，減少染菌機(jī)會。但消泡效果不理想，僅可作為消泡的輔助方法。.消泡齊J消泡這是利用外界加入消泡劑，使泡沫破裂的方法。消泡劑都是表面活性劑，具有較低的表面張力，或者是降低泡沫液膜的機(jī)械強(qiáng)度，或者是降低液膜的表面黏度，或者兼有兩者的作用，達(dá)到破裂泡沫的目的。如聚氧乙烯氧丙烯甘油（GPE）的表面張力僅為3.3X10-2N/m,而青霉素發(fā)酵液的表面張力為（6.06.8）X10-2N/m。作為生物工業(yè)理想的消泡劑，應(yīng)具備下列條件：應(yīng)該在氣-液界面上具有足夠大的鋪展系數(shù)，才能迅速發(fā)揮消泡作用。這就要求消泡劑有一定的

24、親水性；應(yīng)該在低濃度時具有消泡活性；應(yīng)該具有持久的消泡或抑泡性能，以防止形成新的泡沫；應(yīng)該對微生物、人類和動物無毒性；應(yīng)該對產(chǎn)物的提取不產(chǎn)生任何影響；不會在使用、運輸中引起任何危害；來源方便，成本低；應(yīng)該對氧傳遞不產(chǎn)生影響；能耐高溫滅菌。常用的消泡劑主要有天然油脂類，高碳醇、脂肪酸和酯類，聚醚類及硅酮類等4大類。其中以天然油酯類和聚醚類在生物發(fā)酵中最為常用。天然油脂類中有豆油、玉米油、棉籽油、菜籽油和豬油等。此類油不僅用作消泡劑，還可作為碳源和發(fā)酵控制的手段，它們的消泡能力和對產(chǎn)物合成的影響各不相同。例如：土霉素發(fā)酵，豆油、玉米油較好，而亞麻油則會產(chǎn)生不良的作用。此類油的質(zhì)量還會影響消泡效果，

25、碘價（表示油分子結(jié)構(gòu)中含有不飽和鍵的多少）或酸價高的油脂，消泡能力差并產(chǎn)生不良的影響。所以，要控制此類油的質(zhì)量，并要進(jìn)行發(fā)酵試驗檢驗。此類油的新鮮程度也有影響，油越新鮮，所含的天然抗氧化劑越多，形成過氧化物的機(jī)會少，酸價也低，消泡能力強(qiáng)，副作用也小。植物油與鐵離子接觸能與氧形成過氧化物，對四環(huán)素、卡那霉素的合成不利，故要注意此類油的貯存保管。聚醚類消泡劑的品種很多。它們是氧化丙烯或氧化丙烯和環(huán)氧乙烷與甘油聚合而成的聚合物。氧化丙烯與甘油聚合而成的，叫聚氧丙烯甘油（簡稱GP型）；氧化丙烯、環(huán)氧乙烷與甘油聚合而成的叫做聚氧乙烯氧丙烯甘油（簡稱GPE型），又稱泡敵。它們的分子結(jié)構(gòu)式如下：GP的親水性

26、差，在發(fā)泡介質(zhì)中的溶解度小，所以，用于稀薄發(fā)酵液中要比用于黏稠發(fā)酵液中的效果好。其抑泡性能比消泡性能好，適宜用于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以抑制泡沫的產(chǎn)生。如用于鏈霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，抑泡效果明顯，可全部代替食用油，也未發(fā)現(xiàn)不良影響，消泡效力一般相當(dāng)于豆油的6080倍。GPE的親水性好，在發(fā)泡介質(zhì)中易鋪展，消泡能力強(qiáng)，作用又快，而溶解度相應(yīng)也大，所以消泡活性維持時間短，因此，用于黏稠發(fā)酵液的效果比用于稀薄的好。GPE用于四環(huán)類抗生素發(fā)酵中，消泡效果很好，用量為0.03%0.035%,消泡能力一般相當(dāng)于豆油的1020倍。其他的消泡劑，如：聚乙二醇等高碳醇消泡劑多適用于霉菌發(fā)酵，硅酮類較適用于微堿性的細(xì)菌發(fā)酵

27、。所以，應(yīng)結(jié)合具體產(chǎn)品發(fā)酵，試驗上述各種消泡劑的消泡效果，以獲得良好的消泡作用。消泡劑多數(shù)是溶解度小、分散性不十分好的高（大）分子化合物，所以在使用時，要考慮如何降低它的黏度和提高它的分散性，來增強(qiáng)它們的消泡效果。使用的增效方法有：加載體增效，即用惰性載體（如礦物油、植物油等）使消泡劑溶解分散，達(dá)到增效的目的；消泡劑并用增效，取各種消泡劑的優(yōu)點進(jìn)行互補(bǔ)，達(dá)到增效，如GP和GPE以1:1混合使用于土霉素發(fā)酵，結(jié)果比單獨使用GP的效力提高2倍；乳化消泡劑增效，用乳化劑（或分散劑）將消泡劑制成乳劑，以提高分散能力，增強(qiáng)消泡效力，一般只適用于親水性差的消泡劑。如用吐溫80制成的乳劑，用于慶大霉素發(fā)酵，

28、效力提高12倍。在生產(chǎn)過程中，消泡的效果除了與消泡劑種類、性質(zhì)、分子量大小、消泡劑親油親水基等密切關(guān)系外，還和消泡劑使用時加入方法、使用濃度、溫度等有很大的關(guān)系。消泡劑的選擇和實際使用還有許多問題，應(yīng)結(jié)合生產(chǎn)實際加以注意和解決。第九節(jié)發(fā)酵終點的判斷微生物發(fā)酵終點的判斷，對提高產(chǎn)物的生產(chǎn)能力和經(jīng)濟(jì)效益是很重要的。生產(chǎn)能力（或稱生產(chǎn)率、產(chǎn)率）是指單位時間內(nèi)單位罐體積發(fā)酵液的產(chǎn)物積累量而言。式中，生產(chǎn)率單位一般為g/（Lh）或kg/（m3h）,產(chǎn)物濃度單位為g/L或kg/m3,發(fā)酵時間單位為h。生產(chǎn)過程不能只單純追求高生產(chǎn)率，而不顧及產(chǎn)品的成本，必須把二者結(jié)合起來，既要有高產(chǎn)量，又要降低成本。發(fā)酵過

29、程中的產(chǎn)物形成，有的是隨菌體的生長而生產(chǎn)，如初級代謝產(chǎn)物氨基酸等；有的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生與菌體生長無明顯的關(guān)系，生長階段不產(chǎn)生產(chǎn)物，直到穩(wěn)定期，才進(jìn)入產(chǎn)物生產(chǎn)期，如抗生素的合成就是如此。但是無論是初級代謝產(chǎn)物還是次級代謝產(chǎn)物發(fā)酵，到了衰亡期，菌體的產(chǎn)物分泌能力都要下降，產(chǎn)物的生產(chǎn)率相應(yīng)下降或停止。有的產(chǎn)生菌在衰亡期，營養(yǎng)耗盡，菌體衰老而進(jìn)入自溶，釋放出體內(nèi)的分解酶會破壞已形成的產(chǎn)物。要確定一個合理的放罐時間，需要考慮下列幾個因素：一、經(jīng)濟(jì)因素發(fā)酵時間需要考慮經(jīng)濟(jì)因素，也就是，要以最低的成本來獲得最大生產(chǎn)率的時間為最適發(fā)酵時間。在實際生產(chǎn)中，發(fā)酵周期縮短，設(shè)備的利用率提高。但在生產(chǎn)率較小（或停止）的

30、情況下，單位體積發(fā)酵液的產(chǎn)物產(chǎn)量增長就有限，如果繼續(xù)延長時間，使平均生產(chǎn)率下降，而動力消耗、管理費用支出、設(shè)備消耗等費用仍在增加，因而產(chǎn)物成本增加。所以，需要從經(jīng)濟(jì)學(xué)觀點確定一個合理時間。二、產(chǎn)品質(zhì)量因素發(fā)酵時間長短對后續(xù)工藝和產(chǎn)品質(zhì)量有很大的影響。如果發(fā)酵時間太短，勢必有過多的尚未代謝的營養(yǎng)物質(zhì)（如可溶性蛋白、脂肪等）殘留在發(fā)酵液中。這些物質(zhì)對下游操作提取、分離等工序都不利。如果發(fā)酵時間太長，菌體會自溶，釋放出菌體蛋白或體內(nèi)的酶，又會顯著改變發(fā)酵液的性質(zhì)，增加過濾工序的難度，這不僅使過濾時間延長，甚至使一些不穩(wěn)定的產(chǎn)物遭到破壞。所有這些影響，都可能使產(chǎn)物的質(zhì)量下降，產(chǎn)物中雜質(zhì)含量增加，故要考

31、慮發(fā)酵周期長短對提取工序的影響。三、特殊因素在個別特殊發(fā)酵情況下，還要考慮個別因素。對老品種的發(fā)酵來說，放罐時間都已掌握，在正常情況下，可根據(jù)作業(yè)計劃，按時放罐。但在異常情況下，如染菌、代謝異常（糖耗緩慢等），就應(yīng)根據(jù)不同情況，進(jìn)行適當(dāng)處理。為了能夠得到盡量多的產(chǎn)物，應(yīng)該及時采取措施（如改變溫度或補(bǔ)充營養(yǎng)等），并適當(dāng)提前或拖后放罐時間。合理的放罐時間是由實驗來確定的，即根據(jù)不同的發(fā)酵時間所得的產(chǎn)物產(chǎn)量計算出發(fā)酵罐的生產(chǎn)率和產(chǎn)品成本，采用生產(chǎn)率高而成本又低的時間，作為放罐時間。不同的發(fā)酵類型，要求達(dá)到的目標(biāo)不同，因而對發(fā)酵終點的判斷標(biāo)準(zhǔn)也應(yīng)有所不同。一般對發(fā)酵和原材料成本占整個生產(chǎn)成本主要部分的

32、發(fā)酵產(chǎn)品，主要追求提高生產(chǎn)率、得率（kg產(chǎn)物kg基質(zhì)）和發(fā)酵系數(shù)kg產(chǎn)物（罐容m3發(fā)酵周期h）o下游技術(shù)成本占的比重較大、產(chǎn)品價格較貴，除了高的生產(chǎn)率和發(fā)酵系數(shù)外，還要求高的產(chǎn)物濃度。因此，考慮放罐時間時，還應(yīng)考慮總生產(chǎn)率（放罐時產(chǎn)物濃度除以總發(fā)酵生產(chǎn)時間）。這里總發(fā)酵生產(chǎn)時間包括發(fā)酵周期和輔助操作時間，因此要提高總生產(chǎn)率，則有必要縮短發(fā)酵周期，這就是要在產(chǎn)物生成速率較低時放罐。延長發(fā)酵雖然略能提高產(chǎn)物濃度，但生產(chǎn)率下降，且耗電大，成本提高，每噸冷卻水所得到的產(chǎn)物產(chǎn)量下跌。另外，放罐時間對下游工序有很大影響。放罐過早，會殘留過多的養(yǎng)分（如糖、脂肪、可溶性蛋白）對提取不利（這些物質(zhì)能增加乳化作用

33、，干擾樹脂的交換）；放罐過晚，菌體自溶，會延長過濾時間，還會使產(chǎn)物產(chǎn)量降低（有些抗生素單位下跌），擾亂提取作業(yè)計劃。放罐臨近時，加糖、補(bǔ)料或消泡劑都要慎重，因殘留物對提取有影響。補(bǔ)料可根據(jù)糖耗速率計算到放罐時允許的殘留量來控制。一般判斷放罐的主要指標(biāo)有：產(chǎn)物濃度、氨基氮濃度、菌體形態(tài)、pH值、培養(yǎng)液的外觀、黏度等確定。染菌罐一般過濾速度較慢。放罐時間可根據(jù)作業(yè)計劃進(jìn)行，但在異常發(fā)酵時，就應(yīng)當(dāng)機(jī)立斷，以免倒罐。新品種發(fā)酵，更需摸索合理的放罐時間。不同發(fā)酵產(chǎn)品，發(fā)酵終點的判斷指標(biāo)略有出入?？傊?，發(fā)酵終點的判斷需綜合多方面的因素統(tǒng)籌考慮。第十節(jié)發(fā)酵過程檢測與自控發(fā)酵過程的基本任務(wù)是要對菌株所具有的內(nèi)

34、在生產(chǎn)能力實現(xiàn)高效表達(dá)，從而以較低的能量和物料消耗生產(chǎn)更多的發(fā)酵產(chǎn)品。發(fā)酵動力學(xué)為這種表達(dá)提供了部分理論依據(jù)，但要在實際發(fā)酵過程中實現(xiàn)，還必須解決一些工程學(xué)方面的問題，即發(fā)酵參數(shù)等的檢測與自控問題。檢測和自控技術(shù)在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用相當(dāng)晚，但這種應(yīng)用一經(jīng)確立，就形成了迅速發(fā)展的勢頭，并且在某種程度上超過了其他產(chǎn)業(yè)。電子計算機(jī)的使用，為這一發(fā)展注入了巨大的活力，使發(fā)酵工業(yè)面臨一場新的變革。然而，由于發(fā)酵過程的反應(yīng)異常復(fù)雜，描述這一反應(yīng)的數(shù)學(xué)模型尚欠完善，并且由于在線檢測過程關(guān)鍵變量傳感器的缺乏，使自控技術(shù)在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用目前仍受到很大的局限，需要各學(xué)科的專家共同作出進(jìn)一步的努力。發(fā)酵過程檢測是為

35、了取得所給定發(fā)酵過程及其菌株的生理生化特征數(shù)據(jù)，以便對過程實施有效的控制。檢測的具體目的包括：了解過程變量的變化是否與預(yù)期的目標(biāo)值相符；決定種子罐移種和發(fā)酵罐放罐的時間；對不可測變量進(jìn)行間接估計；對過程變量按給定值進(jìn)行手動控制或自動控制；通過過程模型實施計算機(jī)控制；收集認(rèn)識和發(fā)展過程（包括建立數(shù)學(xué)模型）所必需的數(shù)據(jù)。檢測的方法有物理測量（如溫度、壓力、體積、流量等），物理化學(xué)測量（pH值、溶O2、溶CO2、氧化還原電位、氣相成分等），化學(xué)測量（基質(zhì)、前體、產(chǎn)物等的濃度），以及生物學(xué)和生物化學(xué)測量（生物量、細(xì)胞形態(tài)、酶活性、胞內(nèi)成分等）。這些測量可提供反映環(huán)境變化和細(xì)胞代謝生理變化的許多重要信息

36、，作為研究和控制發(fā)酵過程的基礎(chǔ)。它們的測量原理簡述于表7-2中。表7-2發(fā)酵過程變量檢測系統(tǒng)一、發(fā)酵過程對傳感器的特殊要求為了適應(yīng)自控的需要，發(fā)酵過程變量變化的信息，應(yīng)盡可能通過安裝在發(fā)酵罐內(nèi)的傳感器檢知，然后由變送器把非電信號轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)電信號，讓儀表顯示、記錄或傳送給電子計算機(jī)處理。用于發(fā)酵過程的傳感器，由于所面臨的過程及其檢測對象的特殊性，故除了滿足常規(guī)要求，諸如：可靠性、準(zhǔn)確性、精確度、響應(yīng)時間、分辨能力、靈敏度、測量范圍、特異性、可維修性等，還應(yīng)當(dāng)滿足一些特殊要求。傳感器與發(fā)酵液直接接觸，因而首先面臨一個滅菌問題。一般要求傳感器能與發(fā)酵液同時進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，這對于大部分物理和物理化學(xué)

37、傳感器來說都沒有問題，但有的（如pH值和溶氧）傳感器在滅菌后需要重新校準(zhǔn)。不能耐受蒸汽滅菌的傳感器可在罐外用其他方法滅菌后無菌裝入。其次是在發(fā)酵過程中保持無菌的問題，這就要求與外界大氣隔絕，采用的方法有蒸汽汽封、“O”形環(huán)密封、套管隔斷等。還有一個問題是傳感器易被培養(yǎng)基和細(xì)胞沾污，這可以通過設(shè)計時選用不易沾污的材料（如聚四氟乙烯或拋光的不銹鋼），與發(fā)酵液的接觸面不存在容易包藏污垢的死角，便于清洗的形狀和結(jié)構(gòu)等來克服。二、發(fā)酵過程的主要在線傳感器在線傳感器的缺乏，一直是制約發(fā)酵過程自控的主要因素。經(jīng)過各學(xué)科學(xué)者的共同努力，近十多年來在這方面已有很大的發(fā)展。現(xiàn)選擇一些常見的傳感器作一簡介。.pH值一般采用可原位蒸汽滅菌的復(fù)合pH傳感器，其中包括一只玻璃電極和一只通過側(cè)面多孔塞與培養(yǎng)基連通的參比電極。這種pH傳感器裝在加壓護(hù)套內(nèi)，能維持電極內(nèi)部壓力高于發(fā)酵液壓力，使電極內(nèi)的電解液通過多孔塞保持向外的正向流動。這種護(hù)套還可以在帶壓狀態(tài)下使傳感器自由插入或退出發(fā)酵罐，便于在罐外滅菌，以延長其壽命。pH傳感器的一個主要急性故障來源于玻璃電極電纜接頭的受潮，故應(yīng)當(dāng)使接頭密封，并在密封盒中加入干燥劑以保持干燥。慢性故障通常是多孔塞的沾污以致堵塞，故應(yīng)當(dāng)經(jīng)常清洗以保持清潔。.溶氧一般使用覆膜溶氧探頭，有由置于堿性電解