酶組織化學(xué)精品課件

1、酶組織化學(xué)第1頁，共79頁。掌握內(nèi)容酶組織化學(xué)的基本原理光鏡酶組織化學(xué)的基本方法幾種重要的酶組織化學(xué)方法第2頁，共79頁。概 述酶的組織化學(xué) 利用細(xì)胞內(nèi)的酶具有催化底物的特性，并通過顯色反應(yīng)在切片或涂片上顯示組織或細(xì)胞中內(nèi)源性酶的活性及其定位的方法 特點： 在原位檢測 檢測酶的活性而不是酶分子本身第3頁，共79頁。酶組織化學(xué)發(fā)展歷史1939年以前：主要研究細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，未出現(xiàn)酶組織化學(xué)方法 （如Klebs和Stuve 指出愈創(chuàng)木酯酊同膿作用能產(chǎn)生藍(lán)色過氧化物酶） 1939年：酶組織化學(xué)真正開始 高松英雄和Gomori堿性磷酸酶（硫化鈷反應(yīng)、銀反應(yīng)） 同年，酸性磷酸酶組織化學(xué)方法也發(fā)表第

2、4頁，共79頁。酶組織化學(xué)發(fā)展歷史1940-1950年：酶組織化學(xué)發(fā)展的黃金時期 創(chuàng)立了金屬鹽法、偶聯(lián)偶氮色素法50年代后：電鏡酶組織化學(xué) 將超薄切片法和電鏡技術(shù)應(yīng)用到酶組織化學(xué)上，獲得了酶的更精確的定位60年代后期：免疫組織化學(xué) 利用抗原抗體特異性反應(yīng)來定位酶蛋白 電鏡免疫組化第5頁，共79頁。酶的種類 1. 氧化還原酶 2. 轉(zhuǎn)移酶 3. 水解酶 4. 裂合酶（裂解酶） 5. 異構(gòu)酶 6. 合成酶（連接酶） 目前，能用酶組織化學(xué)方法顯示出來，并可進(jìn)行定性、定位和定量的酶較少，僅200余種，因此潛力巨大。第6頁，共79頁。（一）酶的特性水溶性，易擴(kuò)散，難溶或不溶于有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑不同程度降低

3、酶的活性易受溫度影響，對熱耐受性弱對干燥耐受性強(qiáng)酶組織化學(xué)反應(yīng)的基本知識第7頁，共79頁。（二）酶的定位 酶在細(xì)胞內(nèi)或超微結(jié)構(gòu)中存在的特定部位 如：5-核苷酸酶漿膜 ATPase肌球蛋白 細(xì)胞膜 線粒體第8頁，共79頁。（三）酶組化的基本條件 同時保存結(jié)構(gòu)和酶的活性 保存酶的定位，防止酶的擴(kuò)散或移位 保證反應(yīng)產(chǎn)物的特異性* 影響酶活性的因素： 溫度 PH值 抑制劑 激活劑第9頁，共79頁?；驹?細(xì)胞內(nèi)的酶催化分解合適的底物，生成中間產(chǎn)物（即初級反應(yīng)產(chǎn)物），然后其中之一再與輔助物（或捕捉劑）反應(yīng)，生成有色不溶性的終反應(yīng)產(chǎn)物，該反應(yīng)產(chǎn)物沉積在原位，以顯示酶的存在（四）原理及一般原則第10頁，共

4、79頁。第一反應(yīng)：酶促反應(yīng) 底物 初級反應(yīng)產(chǎn)物（PRP） 不可見 第二反應(yīng)：捕捉反應(yīng) PRP + 捕捉劑 終反應(yīng)產(chǎn)物（FRP） 酶第11頁，共79頁。* PRP彌散： 1. 底物在酶催化下反應(yīng)的速度 2. PRP在緩沖液中的彌散系數(shù) 3. PRP與輔助物反應(yīng)的速度 應(yīng)選擇合適的底物和輔助物, 減少彌散第12頁，共79頁。一般原則對組織處理,制片過程不能影響酶活性及分布所選底物和輔助物必須迅速、同步穿透入組織和細(xì)胞中所選底物最好只能被一種酶催化分解 (一個底物可能同時發(fā)生幾種酶反應(yīng)，為獲得特異酶反應(yīng)，必須使用酶抑制劑或酶激活劑進(jìn)行鑒別。 )第13頁，共79頁。一般原則4.所選輔助物不影響細(xì)胞內(nèi)酶

5、的活性, 不影響其他反應(yīng)試劑的穿透性5.PRP必須迅速與輔助物反應(yīng),FRP為水不溶性的有色穩(wěn)定產(chǎn)物6.所有參與反應(yīng)的試劑均不能與其他成分吸附或結(jié)合第14頁，共79頁。(五) 酶組織化學(xué)的主要步驟1、固定或不固定的標(biāo)本2、切片(冷凍或不冷凍)3、孵育4、顯色5、顯微鏡下觀察第15頁，共79頁。第16頁，共79頁。（六）各步驟注意問題檢測方法的選擇酶的保存與固定 一般新鮮組織快速冷凍, 冰凍切片(-70長期保存；可用丙酮氯仿=114，510分鐘稍固定) 固定劑:抑制酶活性和細(xì)胞化學(xué)成分活性的重金屬鹽Hg、Cr、Pb等不能用做固定劑；慎用醛類固定方法: 浸泡固定 灌流固定固定溫度: 04第17頁，共

6、79頁。3. 切片制作: 切片厚度40um，一般812um4. 緩沖液選擇 緩沖液用于 A. 配置固定液 B. 漂洗液 C. 配置酶反應(yīng)孵育液 選擇緩沖液應(yīng)注意 A.不能減弱目標(biāo)酶的活性 B.不能含有與捕捉機(jī)制相同的物質(zhì) C. 注意漂洗用緩沖液的滲透壓 D. 漂洗用緩沖液原則上與固定液配置的緩沖液相同第18頁，共79頁。5. 孵育反應(yīng) A. 孵育液配置: 底物濃度量要足夠120(V/ V); 孵育液只能用一次，配制時要適量第19頁，共79頁。配制孵育液的要求 清洗器具，過酸沖洗。 現(xiàn)用現(xiàn)配，保持新鮮。 嚴(yán)格配比，保持平衡。 防止污染，過濾為佳。 優(yōu)選試劑，注意純度。第20頁，共79頁。5. 孵

7、育反應(yīng) B. 孵育的溫度和時間: 37 15-30min C. 切片孵育法 -切片孵育 -漂浮孵育第21頁，共79頁。6. 酶特異性對照實驗 用酶活性抑制劑 采用無底物的孵育液 過固定或加熱 用針對目標(biāo)酶的激活劑 改變孵育液底物 選擇PH 酶細(xì)胞內(nèi)的定位差異第22頁，共79頁。對結(jié)果的分析應(yīng)考慮的問題1、經(jīng)過凍結(jié)和固定后，酶究竟能保存多少？2、酶是否在原位？3、反應(yīng)中酶起了多少作用？4、酶的活性是否代表了細(xì)胞生活時的狀態(tài)？5、沉淀的產(chǎn)物是否能代表酶本身，時間延長，會不會改變？有沒有擴(kuò)散移位？第23頁，共79頁。顯示酶的組織化學(xué)方法一、金屬離子沉淀法 （金屬金屬鹽法） 金、銀、銅、鐵、鋁、鈷等金

8、屬 利用某些金屬本身具有顏色或其化合物具有顏色（硫化鈷，黑色；硫化鉛，棕黑色等）原理：以酶作用于底物時，分解產(chǎn)物與底物混合液中的某種物質(zhì)結(jié)合，沉著在作用的局部，接著用金屬置換結(jié)合物質(zhì)，通過金屬顯色來證明酶的反應(yīng)。 第24頁，共79頁。優(yōu)點：反應(yīng)迅速，沉著顆粒微細(xì)，色調(diào)美麗，且由于金屬離子的高電子密度而可用于電鏡組織化學(xué)研究。缺點：金屬鹽的移動、擴(kuò)散和吸附現(xiàn)象 一般用于顯示磷酸酶。 如：AKP，ACP，G-6-Pase、ATPase、TPPase、ACase 第25頁，共79頁。堿性磷酸酶（AKP）堿性條件下（pH9.0-9.6）催化各種醇和酚的磷酸酯水解激活劑：Mg2+、Mn2+、Zn2+、C

9、o2+抑制劑：半胱氨酸、氰化物、砷酸鹽定位：轉(zhuǎn)運(yùn)功能活躍的細(xì)胞膜，廣泛存在于腎小管、小腸絨毛、膀胱、腎上腺、肝、脾、乳腺及卵巢。第26頁，共79頁。堿性磷酸酶（AKP）鈣鈷法原理以天然存在的甘油磷酸鈉為底物，經(jīng)酶水解釋放出磷酸，立即被鈣離子沉淀為磷酸鈣，再依次被置換為磷酸鈷和硫化鈷，最終產(chǎn)物為黑色的硫化鈷沉淀。第27頁，共79頁。堿性磷酸酶（硫化鈷法或鈣鈷法） 若將磷酸鈣浸漬于硝酸銀溶液，則置換成磷酸銀然后用其還原劑使其產(chǎn)生銀反應(yīng)，稱為硝酸銀法或銀反應(yīng)法第28頁，共79頁。7/29/20221、上述方法有兩個階段：酶作用產(chǎn)物沉著階段，金屬置換的第二階段，稱為二步顯示法（孵育后偶聯(lián)法）優(yōu)點：是可

10、以充分滿足這兩種反應(yīng)的最適PH；有時酶促底物的水解反應(yīng)要求較長的孵育時間，而有些各自要求的輔助物在這段時間中已開始分解，用二步顯示法可避免此不足。局限性：是要求PRP停留原位不發(fā)生彌散。第29頁，共79頁。方法標(biāo)本：大白鼠腎、小腸恒冷溫箱切片，厚8微米。固定：丙酮氯仿（11）混合液。4 25切片標(biāo)本入下列孵育液中，37，時間摸索 孵育液：3甘油磷酸鈉 底物 2巴比妥鈉 調(diào)PH 2氯化鈣（無水，或硝酸鈣）沉淀劑 2硫酸鎂 激活劑 蒸餾水 將孵育液混勻，若渾濁可過濾，調(diào)PH至9.4第30頁，共79頁。 流水流水洗2分鐘后入蒸餾水 入2硝酸鈷，5分鐘（小腸可3分鐘） 流水洗5分鐘，入蒸餾水。 入0.

11、5硫化胺，2分鐘。 流水洗10分鐘，入蒸餾水。 入Mayer氏蘇木精染液(復(fù)染核)1分鐘 流水洗5分鐘蒸餾水。 甘油明膠或Apathy糖膠封固 第31頁，共79頁。結(jié)果：腎小體（近端小管）刷狀緣、小腸絨毛紋狀緣和血管內(nèi)皮出現(xiàn)棕黑色或黑色的硫化鈷沉淀，顯示AKP活性強(qiáng) 。評價：此法反應(yīng)產(chǎn)物可發(fā)生擴(kuò)散，定位欠準(zhǔn)確；第32頁，共79頁。腎曲管堿性磷酸酶-鈣鈷法 X100第33頁，共79頁。腎曲管堿性磷酸酶-鈣鈷法 X200第34頁，共79頁。大鼠小腸絨毛吸收細(xì)胞呈深棕色 第35頁，共79頁。對照 無底物孵育，以蒸餾水代替孵育液中的3甘油磷酸鈉，其余各步進(jìn)行同上。 加熱滅活酶活性。 加抑制劑，左旋咪唑

12、0.11.0mmol/L第36頁，共79頁。注意事項Ca2+要足量 用水將鈷離子洗凈，以防止出現(xiàn)假陽性 有些組織中有色素（含鐵血黃素、黑色 素）出現(xiàn)，可影響結(jié)果。 也可用石蠟切片，（石蠟切片可顯示大多數(shù)水解酶） 本法可用顯示：5核苷酸酶、肌蛋白ATPase、AKP第37頁，共79頁。金屬離子沉淀法2、同步法細(xì)胞中的酶催化底物水解生成的分解產(chǎn)物立即與金屬離子反應(yīng)成為有色不溶的沉積在原位以顯示酶的存在。如：酸性磷酸酶鉛法第38頁，共79頁。鉛法顯示酸性磷酸酶 (ACP)原理 以甘油磷酸鈉為底物，在酸性PH下，被ACP水解，釋放出磷酸鹽，遇鉛離子則生成磷酸鉛沉淀。在被S2-置換，最終生成硫化鉛棕色沉

13、淀。第39頁，共79頁。酸性磷酸酶硝酸鉛法要求：在底物溶液中的H濃度為弱酸性的條件常用硝酸鉛或醋酸鉛應(yīng)用：酸性磷酸酶和在中性附近其作用的磷酸酯酶類。最早把本法應(yīng)用于酸性磷酸酶的是Gomori（1941），也稱為硫化鉛法該方法金屬離子容易反應(yīng)，沉著顆粒微細(xì)，反應(yīng)色調(diào)美麗，反差比較鮮明。第40頁，共79頁。 ACP的特性 PH 4.55.5適宜 激活劑：Mn2+ 抑制劑：NaF，有些ACP為Cu2+、酒石 酸鹽、四氧嘧啶甲醛等抑制劑。ACP定位 溶酶體（顆粒狀）內(nèi)； 溶酶體外ACP存在于ER和胞液。 該酶活性高的器官：腎、肝、腸、脾、腎上腺。第41頁，共79頁。方法：標(biāo)本：大白鼠腎、肝恒冷箱切片，

14、6-8微米固定：本實驗不固定或固定于丙酮氯仿（11） 25min或10福爾馬林鈣10min步驟： 入孵育液中 37 孵育液：0.1M醋酸緩沖液，PH4.75.0 0.24硝酸鉛 3甘油磷酸鈉 要求完全透明后，過濾備用（可用Tris順丁烯二酸緩沖液或乙酸巴比妥緩沖液）第42頁，共79頁。 于37蒸餾水中洗2次，每次1分鐘。（溫蒸餾水洗） 入5硫化胺，12分鐘。 流水沖洗35分鐘后，換蒸餾水。 （可用蘇木精復(fù)染核） 用甘油明膠或Apathy氏糖膠封固。第43頁，共79頁。結(jié)果 酶活性部位棕黑色硫化鉛沉淀。 分布于腎近曲小管細(xì)胞核周圍，肝細(xì)胞毛細(xì)膽管周圍均有棕黑色顆粒 對照：1、孵育液內(nèi)加0.01M

15、 NaF 2、去底物實驗第44頁，共79頁。腎小管上皮細(xì)胞第45頁，共79頁。注意事項 鉛離子的濃度是關(guān)鍵問題，沒有底物，有些組織吸附鉛離子（+），因此必須用NaF抑制酶活性排除假陽性反應(yīng)。 孵育時間不可過長，否則染色擴(kuò)散或核染色。第46頁，共79頁。應(yīng)用范圍 “鉛法”適用于：ACP，5-核苷酸酶、G6P酶; 膜ATPase、 MitoATPase、TTPase（硫胺素焦磷酸酶）第47頁，共79頁。顯示酶的組織化學(xué)方法二、偶聯(lián)偶氮色素法（偶氮色素法） 指用人工合成的酶底物，在酶的作用下，產(chǎn)生分解產(chǎn)物，后者與重氮鹽結(jié)合，引起偶聯(lián)偶氮反應(yīng)，使其形成不溶性的偶氮色素，以此證明酶的定位。 第48頁，共

16、79頁。 （二）偶氮偶聯(lián)法（偶氮色素法）1.原理底物混合液 PRP與 不溶性 重氮鹽結(jié)合 偶氮色素2. 方法 同時偶聯(lián)法 后偶聯(lián)法酶 偶氮偶聯(lián)第49頁，共79頁。顯示酶的組織化學(xué)方法重氮鹽種類不同，其偶氮顏色多樣（藍(lán)色、紫色、紅色、褐色、黑色、棕色等）重氮鹽還有不同程度的抑制酶活性作用，故必須選用其中抑制作用最弱的種類使用。第50頁，共79頁。常用底物 萘酚AS-BI 萘酚AS-D 萘酚AS-MX 萘酚AS-TR常用重氮鹽 堅牢蘭RR 堅牢蘭B 堅牢紅RC 堅牢紅TR 堅牢紫B 六偶氮副品紅 六偶氮新品紅應(yīng)用：可顯示ALPase, ACPase, 酯酶, 轉(zhuǎn)肽酶, 肽酶, -葡糖苷酶等第51頁

17、，共79頁。第52頁，共79頁。偶氮色素法分類（一）同時偶聯(lián)法在底物混合液中，通過酶的分解作用所得到的沉積物，立即形成重氮化合物和偶氮色素。（二）后偶聯(lián)法為了防止重氮鹽對酶的抑制作用，先使酶在底物內(nèi)發(fā)生作用，使分解產(chǎn)物沉著，然后再浸漬于重氮鹽溶液中，使其形成偶氮色素。第53頁，共79頁。 偶氮偶聯(lián)法顯示ACP原理 以奈酚的衍生物磷酸酯為底物，在酸性PH（5.2）下，經(jīng)酸性磷酸酶水解釋放出萘酚ASBI，立即與六氮化對品紅偶聯(lián)，生成紅色偶氮染料，用以代表酸性磷酸酶活性。第54頁，共79頁。方法標(biāo)本：大白鼠腎、肝恒冷箱切片，厚8-10微米。不固定或固定于丙酮氯仿（11）混合液內(nèi)，4，25min 標(biāo)本

18、入下列孵育液，37，3060分鐘。 孵育液：磷酸奈酚ASBI 二甲基亞砜 （溶劑） 六氮化對品紅 緩沖液 充分混勻并過濾 第55頁，共79頁。 蒸餾水洗 入Mayer蘇木精內(nèi)染1分鐘。 流水沖5分鐘后入蒸餾水。 用Apathy糖膠或甘油明膠封固。結(jié)果 酶的活性部位呈紅色，核蘭色。 分布于腎近端小管核周，肝毛細(xì)膽管周圍。第56頁，共79頁。涂片-腹腔巨噬細(xì)胞酸性磷酸酶 X400第57頁，共79頁。對照用抑制劑NaF濃度為10mmol/L注意事項 六氮鹽濃度不能太高 背景會略帶黃色第58頁，共79頁。顯示酶的組織化學(xué)方法三、 色素形成法 在酶作用下使無色化學(xué)物質(zhì)在局部形成色素沉著1、四唑鹽法2、聯(lián)

19、苯胺色素法3、靛酚藍(lán)法（吲哚酚法） 第59頁，共79頁。顯示酶的組織化學(xué)方法（一）四唑鹽法 含有四唑鹽或雙四唑鹽的底物混合液，在脫氫酶的作用下，從底物分離出來的氫原子與無色的四唑鹽或雙四唑鹽相結(jié)合，形成紅色或藍(lán)色的甲臢或二甲臢色素。 第60頁，共79頁。四唑鹽法用于顯示氧化酶和脫氫酶原理: 四唑鹽或雙四唑鹽 氫離子 與 與 底物混合液 無色四唑鹽結(jié)合 紅色或蘭色的沉淀 脫氫酶 +2H被還原第61頁，共79頁。常用四唑鹽種類 三苯四唑氯化物 TTC 藍(lán)四唑鹽 BT 新四唑鹽 NT 硝基藍(lán)四唑 NBT 四硝基藍(lán)四唑 TNBT 噻唑藍(lán) MTT第62頁，共79頁。第63頁，共79頁。 以琥珀酸（鈉鹽）

20、為底物，在酶的作用下脫氫，人工合成的硝基藍(lán)四唑（NBT）為受H體，其接受H后被還原成紫色不溶物以代表琥珀酸脫氫酶的活性。 四唑鹽法顯示琥珀酸脫氫酶第64頁，共79頁。 琥珀酸脫氫酶是線粒體的標(biāo)志酶之一。 SDH存在于所有有氧呼吸的細(xì)胞，以心肌、腎曲管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞含量最豐富 抑制物：丙二酸鹽（競爭抑制） 對照第65頁，共79頁。【孵育液】0.1M 琥珀酸鈉, 0.1M 磷酸鹽緩沖液 NBT(硝基藍(lán)四唑)【步驟】 1. 新鮮組織低溫冰凍切片 2. 孵育液15-35 分鐘 3. 生理鹽水洗 4. Fca(氯化鈣Formalin)固定10分鐘 5. 入80%乙醇5分鐘 6. 甘油明膠封固【結(jié)果】 酶活性處為藍(lán)紫色沉淀第66頁，共79頁。小鼠心肌冰凍切片-琥珀酸脫氫酶 X400第67頁，共79頁。思考題： 在細(xì)胞培養(yǎng)中，常用的MTT法測定細(xì)胞活性，用的是什么原理？檢測的是什么酶？第68頁，共79頁。顯示酶的組織化學(xué)方法（二）聯(lián)苯胺色素法檢測過氧化物酶酶作用釋放的氧使無色的聯(lián)苯胺脫氫而形成有色的聯(lián)苯胺藍(lán)，再形成聯(lián)苯胺褐?！窘Y(jié)果】酶活性處呈棕色第69頁，共79頁。過氧化物酶 催化各種物質(zhì)被