霍山石斛細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及條件優(yōu)化課件

1、 霍山石斛細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及條件優(yōu)化 目的要求 利用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)霍山石斛單細(xì)胞，解決石斛藥用植物資源短缺問題。 方法 以霍山石斛葉片等外植體為實(shí)驗(yàn)材料，通過不同的制備方法獲得霍山石斛單細(xì)胞，研究霍山石斛細(xì)胞培養(yǎng)的多種影響因素，應(yīng)用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化霍山石斛細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的條件。 第1頁(yè)，共37頁(yè)。第2頁(yè)，共37頁(yè)。第3頁(yè)，共37頁(yè)。近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)藥用植物石斛進(jìn)行了大量深層次的開發(fā)，對(duì)石斛的需求量也越來越大，而多年來石斛主要靠采收野生資源供藥用和出口，由于野生石斛繁殖很慢，自然更新能力很差，加之生態(tài)環(huán)境的制約，人為過度采掘，致使野生資源日漸枯竭。其中霍山石斛Dendrobium huoshanen

2、se C. Z. Tanget S. J Che 等名貴品種已成為日益稀少的瀕危植物，被國(guó)家列為重點(diǎn)保護(hù)的藥材品種。第4頁(yè)，共37頁(yè)。應(yīng)用種子離體萌發(fā)誘導(dǎo)原球莖或原球莖懸浮培養(yǎng)方式 培養(yǎng)霍山石斛 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用霍山石斛為起始培養(yǎng)材料，以其莖尖和莖段為外植體，通過酶法和機(jī)械法獲取單細(xì)胞，并進(jìn)行大量培養(yǎng)。該培養(yǎng)方法可明顯縮短霍山石斛生長(zhǎng)繁殖周期，更宜于后期的有效成分提取等工業(yè)生產(chǎn)步驟，對(duì)解決石斛資源短缺問題具有重大意義。第5頁(yè)，共37頁(yè)。1、材料與方法1.1 材料與試劑1.2 實(shí)驗(yàn)方法第6頁(yè)，共37頁(yè)。 1.1 材料與試劑液體培養(yǎng)基為改良的MS；碳源：蔗糖、葡萄糖；氮源：NaNO3、NH4NO3、NH

3、4Cl、脲；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：IAA、6-BA第7頁(yè)，共37頁(yè)。第8頁(yè)，共37頁(yè)。 1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 外植體滅菌1.2.2 霍山石斛單細(xì)胞的制備1.2.3 培養(yǎng)基的選擇1.2.4 接種與培養(yǎng)第9頁(yè)，共37頁(yè)。1.2.1 外植體滅菌取霍山石斛幼莖段沖洗干凈，70%酒精浸1 min 后無(wú)菌水沖洗5 次，轉(zhuǎn)入0.1%HgCl2 加1 滴聚山梨酯80 消毒10min 后，無(wú)菌水沖洗5 次，用無(wú)菌紗布或無(wú)菌濾紙吸干水后待用。第10頁(yè)，共37頁(yè)。1.2.2 霍山石斛單細(xì)胞的制備取霍山石斛滅菌后的外植體，采用組織勻漿機(jī)勻漿（或酶解法或玻璃珠搗碎法），濾過，離心，獲得霍山石斛單細(xì)胞懸浮液。第11頁(yè)，共

4、37頁(yè)。 1.2.3 培養(yǎng)基的選擇以 MS 為基本培養(yǎng)基，pH5.06.0；6-BA/IAA 的配比分別為：2.00.4、1.00.4、0.50.4、1.00.2 和1.00.（mg/L）；添加物為香蕉泥。第12頁(yè)，共37頁(yè)。 1.2.4 接種與培養(yǎng)用移液器移取3 mL 霍山石斛單細(xì)胞懸浮液注入各個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，同時(shí)用超濾器向每瓶?jī)?nèi)各滴入不同質(zhì)量濃度的IAA 和6-BA 組合，將已接種的三角瓶置于（252），180 r/min 的恒溫?fù)u床中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)第13頁(yè)，共37頁(yè)。 2、 結(jié)果2.1 不同提取方法對(duì)獲取霍山石斛單細(xì)胞的影響2.2 碳源對(duì)霍山石斛細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響2.3 氮源對(duì)霍山石斛細(xì)胞懸浮

5、培養(yǎng)的影響2.4 pH 對(duì)霍山石斛細(xì)胞培養(yǎng)的影響2.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)霍山石斛細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響2.6 不同激素配比對(duì)霍山石斛細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響2.7 培養(yǎng)溫度對(duì)石斛細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響2.8 正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)與結(jié)果2.9 石斛細(xì)胞傳代培養(yǎng)第14頁(yè)，共37頁(yè)。2.1 不同提取方法對(duì)獲取霍山石斛單細(xì)胞的影響本實(shí)驗(yàn)獲取霍山石斛單細(xì)胞主要用了3 種方法：機(jī)械勻漿組織破碎提取法、酶解法、玻璃珠搗碎法。3 種方法得到的細(xì)胞數(shù)分別為：7.73105、1.19106、1.54106 個(gè)/mL，說明玻璃珠搗碎法效果最好，本實(shí)驗(yàn)的操作均采用玻璃珠搗碎法。第15頁(yè)，共37頁(yè)。2.2 碳源對(duì)霍山石斛細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響分別選

6、用蔗糖和葡萄糖作為碳源對(duì)霍山石斛細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蔗糖培養(yǎng)的石斛細(xì)胞數(shù)目為1.13106 個(gè)/mL，葡萄糖培養(yǎng)的石斛細(xì)胞數(shù)目為6.93105 個(gè)/mL。蔗糖比葡萄糖更適宜石斛細(xì)胞的培養(yǎng)，故用蔗糖作為碳源；同時(shí)又用不同質(zhì)量濃度蔗糖對(duì)霍山石斛細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)果如圖1 所示。第16頁(yè)，共37頁(yè)。圖1 蔗糖濃度對(duì)石斛細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響細(xì)胞數(shù)目/（105個(gè)mL1）108642010 20 30 40 50 蔗糖質(zhì)量濃度/(gL1)第17頁(yè)，共37頁(yè)。2.3 氮源對(duì)霍山石斛細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響實(shí)驗(yàn)選用了 4 種不同氮源對(duì)霍山石斛細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，結(jié)果見圖2。第18頁(yè)，共37頁(yè)。圖 2 氮源對(duì)石斛細(xì)

7、胞懸浮培養(yǎng)的影響第19頁(yè)，共37頁(yè)。2.4 pH 對(duì)霍山石斛細(xì)胞培養(yǎng)的影響培養(yǎng)基的 pH 值與細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖關(guān)系密切，在培養(yǎng)過程中過酸或過堿可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這主要與蛋白質(zhì)的變性和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)受損有關(guān)。植物細(xì)胞培養(yǎng)的pH 一般控制在微酸性的范圍內(nèi)，即pH為5.06.0本實(shí)驗(yàn)考察不同pH 對(duì)霍山石斛細(xì)胞數(shù)目的影響，結(jié)果如圖3 所示。第20頁(yè)，共37頁(yè)。圖 3 pH 值對(duì)石斛單細(xì)胞培養(yǎng)的影響第21頁(yè)，共37頁(yè)?；羯绞?xì)胞在營(yíng)養(yǎng)充足的情況下，開始快速地有絲分裂，細(xì)胞的數(shù)目隨著時(shí)間的變化而變化。通過培養(yǎng)、觀察、計(jì)數(shù)，得到其數(shù)目變化的結(jié)果見圖4。由圖可知，在前12 d，石斛細(xì)胞進(jìn)行迅速的有絲分裂；到第1

8、4 天有絲分裂開始緩慢，并趨于穩(wěn)定達(dá)到最大值1.673106 個(gè)/mL；18 d 以后逐漸呈下降趨勢(shì)。因此最佳培養(yǎng)時(shí)間為1418 d。2.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)霍山石斛細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響第22頁(yè)，共37頁(yè)。圖 4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)石斛細(xì)胞培養(yǎng)的影響第23頁(yè)，共37頁(yè)。2.6 不同激素配比對(duì)霍山石斛細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響在植物細(xì)胞培養(yǎng)的過程中激素的種類及其比例都對(duì)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖、分化、發(fā)育和新陳代謝起重要調(diào)節(jié)控制作用。取6-BA/IAA 分別為2.00.4、1.00.4、 0.50.4、1.00.2 和1.00.1 不同配比（mg/L），進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果如圖5 所示。第24頁(yè)，共37頁(yè)。圖 5 激素配比對(duì)霍山

9、石斛細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響第25頁(yè)，共37頁(yè)。2.7 培養(yǎng)溫度對(duì)石斛細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響培養(yǎng)溫度與細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖關(guān)系密切。不同培養(yǎng)溫度下獲得的石斛細(xì)胞數(shù)目結(jié)果如圖6 所示。在其他條件均相同的情況下，當(dāng)培養(yǎng)溫度調(diào)控在（252）時(shí)，石斛細(xì)胞數(shù)目為1.019106當(dāng)培養(yǎng)溫度調(diào)控在（352）時(shí)，培養(yǎng)的石斛細(xì)胞數(shù)目為6.15105 個(gè)/mL。故培養(yǎng)的最適溫度是（252）。第26頁(yè)，共37頁(yè)。圖 6 培養(yǎng)溫度對(duì)石斛細(xì)胞培養(yǎng)的影響第27頁(yè)，共37頁(yè)。 2.8 正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)以上單因素優(yōu)化的結(jié)果，選取影響霍山石斛細(xì)胞培養(yǎng)的4 個(gè)主要因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)，考察pH （A）、碳源（B）、氮源（C）

10、和激素配比（D），結(jié)果見表1。 表 1 正交試驗(yàn)因素水平表 個(gè)/mL。按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，配制不同的培養(yǎng)基，接種后在溫度（252），轉(zhuǎn)速120 r/min 條件下培養(yǎng)，結(jié)果見表2。第28頁(yè)，共37頁(yè)。表2 正交分析試驗(yàn)結(jié)果及極差分析第29頁(yè)，共37頁(yè)。 對(duì)霍山石斛細(xì)胞培養(yǎng)條件進(jìn)行L9（34）試驗(yàn)，結(jié)果表明：4 個(gè)因素對(duì)石斛細(xì)胞的生長(zhǎng)影響順序依次是BDAC，即碳源激素配比pH氮源。蔗糖35 g/L，NH4NO3 為1.3 g/L，pH 為5.6，激素配比6-BA/IAA 為1.00.4 組合的培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)最多，為9.42105 個(gè)/mL。第30頁(yè)，共37頁(yè)。 2.9 石斛細(xì)胞傳代培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)在原代懸浮培

11、養(yǎng)霍山石斛細(xì)胞 14 d 后，對(duì)石斛細(xì)胞進(jìn)行了第1 次傳代培養(yǎng)，即將原代細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，靜置10 min，然后在超凈工作臺(tái)上取5 mL 原代培養(yǎng)上清液注入到含有香蕉泥的完全培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)。隨后每隔10 d 傳代1 次，共傳代4 次，以此來建立細(xì)胞系。傳代后的細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)較原代不同，最大特點(diǎn)就是細(xì)胞較圓，可見細(xì)胞壁，如圖7 所示。第31頁(yè)，共37頁(yè)。圖 7 霍山石斛細(xì)胞培養(yǎng)前（A）及培養(yǎng)后（B）的細(xì)胞形態(tài) A B第32頁(yè)，共37頁(yè)。根據(jù)顯微攝影圖片可以看出，霍山石斛細(xì)胞在培養(yǎng)前后形態(tài)發(fā)生了很大變化。培養(yǎng)前的霍山石斛細(xì)胞懸浮液較分散均勻，單細(xì)胞較少，且多為游離狀，可明顯觀察到細(xì)胞碎片，霍山石斛細(xì)胞多呈大小不一，不規(guī)則的多邊菱形。培養(yǎng)后的霍山石斛細(xì)胞有的緊挨在一起，形成細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)過4 次繼代培養(yǎng)后霍山石斛細(xì)胞多為圓狀或橢圓狀，細(xì)胞數(shù)目明顯增多。第33頁(yè)，共37頁(yè)。 3 結(jié)論與討論3.1 單細(xì)胞的制備3.2 激素配比3.3 添加物第34頁(yè)，共37頁(yè)。 3.1 單細(xì)胞的制備植物細(xì)胞可以從外植體中直接分離獲得，從外植體中直接分離植物細(xì)胞的方法通常有機(jī)械法、玻璃珠搗碎法和酶解法。本實(shí)驗(yàn)主要采用玻璃珠搗碎法制備單細(xì)胞。第35頁(yè)，共37頁(yè)。 3.2 激素配比植物激素是植物細(xì)胞培養(yǎng)中不可缺少的成分，其種類及比例都對(duì)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖、分化、發(fā)育和新陳代謝