大腸菌群檢測方法(中文翻譯)

1、單倍料(g)雙倍料(g)3定義和簡介3.1定義所有的大腸菌群均是發(fā)酵乳糖，革蘭氏陰性，無牙孢的桿菌。官方的對大腸菌群的定義可能以培養(yǎng)溫度（30、32、35、37）不同作評價；或以確定是否發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣作為定義的一個特征大多數(shù)ISO和其他官方標(biāo)準(zhǔn)是利用發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣作為一個定義特征。而在ISO4832中則利用了在VRBL上的菌落大小作為其唯一的定義特征。鑒于這些定義的不同，建議實(shí)驗(yàn)室根據(jù)相關(guān)定義用相應(yīng)的適當(dāng)方法。國際標(biāo)準(zhǔn)：樣品分析是否符合國際交易規(guī)范官方主市場調(diào)整定義：樣品分析是否符合地方標(biāo)準(zhǔn)一般定義：樣品分析是否符合一般規(guī)范。任何必要方法的調(diào)改必須通過市場實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量確認(rèn)中心和雀巢研究中心食品安全微

2、生物組的協(xié)助。以下為一些官方定義例子：*ISO4831大腸菌群是通過其在選擇性肉湯上的生長和發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣能力來定義*AOACINTERNATIONAL,APHA/FDA定義大腸菌是指發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣（T=32或35度）革蘭氏陰性桿菌*ISO4832大腸菌群定義是根據(jù)其在VRBL-agar（30or35or37度）的菌落大小（最小5mm直徑）和產(chǎn)酸情況。（T=30或35或37C）311液體培養(yǎng)基中ISO4831大腸菌群是根據(jù)其在選擇性肉湯中生長能力和發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣情況來定義.（T=30或35或37C）AOACINTERMATIONAL,APHA/FA中大腸菌群是指發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣革蘭氏陰性桿菌。（

3、T=32或35C）由LI第一章概述，大腸菌群是指發(fā)酵乳糖氣微生物群。312固體培養(yǎng)基中IOS4832大腸菌群定義是根據(jù)其在VRBL-agar（30or35or37度）的菌落大?。ㄗ钚?mm直徑）和產(chǎn)酸情況。（T=30或35或37C）AOACINTERMATIONAL,APHA/FA中大腸菌群是指發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣革蘭氏陰性桿菌?；谝陨隙x可知大腸菌群在VRBL培養(yǎng)基上會形成5mm以上直徑的紅色菌落且在確認(rèn)試驗(yàn)中發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣由LI第二章概述，大腸菌群是指在VRBL瓊脂培養(yǎng)基上會形成特征性菌落且在確認(rèn)試驗(yàn)中發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣微生物群。3.2簡注BGLB：亮綠乳糖膽鹽培養(yǎng)基肉湯LST：月桂基硫酸鹽胰蛋白胨

4、肉湯MPN：最可能數(shù)VRBL：紫紅膽汁瓊脂4安全防范大腸菌群不表現(xiàn)為無害，注意實(shí)驗(yàn)室的良好操作。5參考資料5.1LIs中提到的及其它心要文件LI-00700LI-00702LI-00743-252參考書目*美國公共健康協(xié)會(1985)日用品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，華盛頓。DC*BruchezN(1996).ResearchNoteQS-TN960017:Detectionofcoliforms-lnprovementofLST*ColwellN.D.andM.D.Microbiologicaltechniques-Somestatisticalaspects.J.Sci.FdAgric_20(1969)57

5、3-579*ISO4831:1991:Microbiology-Generalguidancefortheenumerationofcoliforms-Mostprobablenumbertechnique*ISO4831:1991:Microbiology-Generalguidancefortheenumerationofcoliforms-Colonycounttechnique.*MerckMicrobiologyManual2002http:/chemdat.merckde/mda/ch/de/indexhtml*U.S.FDA(1995).BacteriologicalAnalyt

6、icalManual,8thEdAOACinternational,Gaitheresburg,MD,pp4.01-4.296前面說法之修正完整修訂本額外細(xì)節(jié)在大腸菌群計(jì)數(shù)、定義和分離改編中提供。7方法認(rèn)可審批人簽名日期編寫者組領(lǐng)導(dǎo)部門領(lǐng)導(dǎo)CT-QM8附1安全說明2概述大腸菌群的研究與舉例第一章液體培養(yǎng)基中的生長研究1方法原理接種至原倍或稀釋后的選擇性培養(yǎng)基中，30C培養(yǎng)24-48小時，再通過轉(zhuǎn)接陽性管進(jìn)確認(rèn)。摘要根據(jù)大腸菌群相應(yīng)用的不同定義選用不同的培養(yǎng)溫度(30C/32C/35C/37C)(查閱定義)2培養(yǎng)基的準(zhǔn)備在使用化學(xué)藥品前查閱Sigma/Aldrich化學(xué)藥品安全指南或其它相應(yīng)手冊

7、或地方權(quán)威提供的安全數(shù)據(jù)表。認(rèn)真閱讀附1中的安全說明。更多的安全信息可從NEC/QS中獲得。2.1月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(LST)根據(jù)制造商說明配制培養(yǎng)基，如是非成品干粉則可按以下方法配備(g/L)胰蛋白胨20.040.0乳糖5.010.0磷酸二氫鉀2.755.5磷酸氫二鉀2.755.5氯化鈉5.010.0月桂硫酸鈉0.10,2蒸餾水1000ml1000mlPH6.67.0(25C)將以上化合物水中溶解，必要時可以加熱，調(diào)整PH單倍料分裝到16*160mm的試管中每管10ml雙倍料分裝到18*180mm的試管每管10ml121C,15分鐘滅菌為了避免月桂硫酸鈉沉淀，LST室溫貯藏不應(yīng)超過4星

8、期。注意由于樣品引起高百分比的假陽性，也就說氣體的產(chǎn)生是由于其它微生物而非大腸菌群。在LST肉湯滅菌后加入無菌梭鏈抱酸或萬古霉素，最終濃度為10毫克每毫升。2.2亮綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)TOC o 1-5 h z蛋白胨10.0乳糖10.0脫水牛膽苯20.0煌綠0.0133蒸餾水1000mlPH7.07.4(25C)將以上化合物水中溶解，必要時可以加熱，調(diào)整PH,分裝到帶有小試管的16*160mm的試管中每管10ml,滅菌后小試管中不應(yīng)含有氣泡。3化學(xué)藥品與材料商業(yè)參考僅供指導(dǎo)，列在頁邊提到的或是莫克化學(xué)藥物和試劑目錄或是2002莫克微生物手冊或是雀巢實(shí)驗(yàn)室材料。31化學(xué)藥品101310微生

9、物煌綠104873KH2PO4p.a.K2HPO4anhydrousGR梭鏈抱酸鈉鹽SigmaF0881Mannanasesolution,NovoNordiskKHNO1051a-淀粉酶，Termamyl1201Novozymes106404氯化鈉，p.a.107657微生物一水乳糖112533生物化學(xué)月桂基硫酸鈉822187萬古霉素氫化物，sigmaV20023.2藥品和準(zhǔn)備1.03756干純微生物牛膽苯1.05454BGLB或OxoidCM311.07214胰蛋白胨1.10213微生物胰蛋白1.10266LST或OxoidCM451或Difco02413.3器材101601試管，直徑15

10、或16mm,長160mm101603平口試管17/18mm長180mm101605平口試管，聚丙烯，10mm長100mm101901發(fā)酵試管，圓底，縱切7mm長28mm252801發(fā)酵試管，聚丙烯，12mm長55mm902103調(diào)整到301C培養(yǎng)，如HeraeusB61204樣品樣品處理根據(jù)產(chǎn)品相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)或說明根據(jù)L1-00.700或L1S細(xì)節(jié)取適當(dāng)用量選恰當(dāng)方法處理樣品。5步驟5.1樣品的準(zhǔn)備樣品的準(zhǔn)備與稀釋在L1-00.700中有說明注意在從第一個稀釋度（-1）的準(zhǔn)備到最后的分析不超過15分鐘5.2樣品準(zhǔn)備-特別事項(xiàng)5.2.1谷物和面粉類制品用100ml蒸餾水溶解5g淀粉酶，過濾滅菌并加10

11、ml到80ml無菌的TS中。5.2.2稠化1ml甘露聚糖酶加99mlTS溶解，過濾滅菌注意加入的甘露聚糖酶體積可以增加到3ml，以促進(jìn)諸如藻酸鹽、果阿膠、黃原膠特殊稠化劑的溶解。5.2.3卵磷脂滅菌前加1ml到80至90ml的TS中，第一個稀釋度充分混勻。5.2.4含脂肪較多的食品（20%脂肪含量）滅菌前加1ml到80至90ml的TS中，第一個稀釋度充分混勻。5.2.5酸性或類酸性產(chǎn)品第一稀釋度PH低于65的，用1N的氫氧化鈉調(diào)至PH6.5-705.2.6嬰兒食品根據(jù)樣品類型要求，如ML-44.006和CP-08.714中所述,稱取10g產(chǎn)品到90mlTS中，在寬頸瓶里稀釋。將產(chǎn)品噴灑到該溶液

12、上，放置10分鐘，通過慢慢旋轉(zhuǎn)瓶子將濕潤、溶解。如有必要，40C以下水浴5分鐘同時輕輕震蕩散熱，然后室溫放置。如果其他類型樣品要求，可適當(dāng)調(diào)整TS用量。5.2.7植物乳用LST加萬古霉素。加過濾滅菌后的萬古霉素稀釋至最終濃度10Ag/ml5.3接種轉(zhuǎn)接10ml第一個稀釋度或10ml原液體樣品到10ml雙倍LST料液1ml（-1）稀釋液和之后的稀釋接到10ml單倍LST培養(yǎng)液中小心混勻接種液與培養(yǎng)液5.4培養(yǎng)所有的雙倍和單倍LST試管301C培養(yǎng)24和48小時注意如果是嬰兒食品分析，LST肉湯必須在371C培養(yǎng)24和48小時5.5觀察24和48小時后檢查各試管，有產(chǎn)氣或變渾濁的均認(rèn)為是假定大腸菌

13、群。大腸菌群的存在應(yīng)該在這些管中確認(rèn)。5.6確認(rèn)每支產(chǎn)氣或渾濁管轉(zhuǎn)接一環(huán)到BGLB肉湯30C培養(yǎng)。如果此階段氣體形成無法觀測則再培養(yǎng)24小時。24或48小時培養(yǎng)后對每個稀釋的陽性管數(shù)第一時間統(tǒng)計(jì)。注意對于嬰兒食品，LST假定陽性管要在VRBL上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，用于如L1-00743-2上所述進(jìn)行后續(xù)鑒定6結(jié)果描述&1計(jì)算僅計(jì)算大腸菌陽性管并將結(jié)果表述如下：出現(xiàn)或不出現(xiàn)測試：基于陽性管確認(rèn)數(shù)，根據(jù)所做稀釋度計(jì)算，并表達(dá)為：每克或每毫升分析樣出現(xiàn)或不出現(xiàn)大腸菌。（見L1-00.700）最大可能數(shù)（MPN）：根據(jù)L1-00.700計(jì)算大腸菌確認(rèn)數(shù)。6.2方法的精確度如果是MPN,其結(jié)果必須考慮到置信度

14、的限制。第二章固體培養(yǎng)基中的舉例應(yīng)用1方法原理傾注法接種到VRBL瓊脂培基上，并做適當(dāng)?shù)南♂尪取?0C培養(yǎng)20至24小時。列舉特征菌落。注意根據(jù)所提供的不同的大腸菌群的定義選擇不同的培養(yǎng)溫度。2試劑與器材2.1脂紅膽汁乳糖膽鹽VRBL根據(jù)制造商說明準(zhǔn)備培養(yǎng)基，如非干粉成品，按以下方法配置TOC o 1-5 h z蛋白胨7.0酵母汁3.0乳糖10.0氯化鈉5.0膽汁鹽1.5中性紅0.03結(jié)晶紫0.002瓊脂一瓊脂9.0-18.0蒸餾水1000mlPH7.2-7.6（25C）*根據(jù)供應(yīng)商推薦各組分水中放置5分鐘，混合，煮沸，同時攪拌。調(diào)整PH，煮沸2分鐘，不須滅菌和再熱。立即45-47C水浴冷卻。

15、2.2BGLB藥品和試管的準(zhǔn)備參考第一章3化學(xué)藥品、培養(yǎng)基和器材3.1化學(xué)藥品3.2培養(yǎng)基和微生物準(zhǔn)備3.3器材請參考第一章和L100.7004樣品根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)或產(chǎn)品相關(guān)說明處理依據(jù)L1-00.700或L1s的具體規(guī)定選取適當(dāng)量和恰當(dāng)方法處理樣品5步驟5.1樣品準(zhǔn)備樣品準(zhǔn)備和稀釋如L1-00.700上所述注意在從第一個稀釋度（-1）的準(zhǔn)備到最后的分析不超過15分鐘。5.2樣品準(zhǔn)備-特別事項(xiàng)參照第一章5.2.1至5255.3接種轉(zhuǎn)接每個適當(dāng)梯度1ml到無菌平皿，立刻傾注45-47C的VRBL約15ml，馬上將其混勻，水平放置冷卻凝固，不堆疊。完全凝固后再一層510ml的VRBL在上面，然后待凝固。5

16、.4培養(yǎng)倒扣放置301C培養(yǎng)2024小時，不要堆放超過6個皿。5.5.1ISO方法4832在VRBL上培養(yǎng)，計(jì)數(shù)直徑0.5mm或更大，略帶紫色的菌落，有時其周邊會有微紅膽鹽沉淀物注意不要求再確認(rèn)5.5.2AOAC，BAM在VRBL上培養(yǎng)，計(jì)數(shù)直徑05mm或更大，略帶紫色的菌落，有時其周邊會有微紅膽鹽沉淀物。確認(rèn)那些認(rèn)為有氣體產(chǎn)生（如56所述）的菌落為大腸菌群。注意1在菌落周邊出現(xiàn)的微紅膽鹽沉淀取決于大腸菌群的類型和培養(yǎng)基的質(zhì)量。注意2某些大腸菌群菌落顏色可以變成粉紅色或者甚至白色。5.6確認(rèn)接種5個特征菌落到BGLB管中（2.2），30C培養(yǎng)24小時如果24小時后氣體產(chǎn)生不易觀察，可再培養(yǎng)24小時。產(chǎn)生有氣體在發(fā)酵管中的被認(rèn)為是大腸菌群。24或48小時后，記數(shù)每個稀釋度的產(chǎn)氣管數(shù)，將結(jié)果代入公式計(jì)算（第六節(jié)）注意如果是嬰兒食品，在VRBL瓊脂上的菌落則須如L100.743-2上所述進(jìn)行鑒定。6結(jié)果表達(dá)保留特征菌落數(shù)在10150之間的平皿，每克或