《儀器分析》課件第六章 色譜分析法

1、第六章 色譜分析法導論 色譜法或色譜分析法，是一種分離分析技術，它利用混合物中各物質(zhì)在兩相間分配系數(shù)的差別，當溶質(zhì)在兩相間作相對移動時，各物質(zhì)在兩相間進行多次分配，從而使各組分得到分離?？赏瓿蛇@種分離的儀器稱為色譜儀。 本章教學內(nèi)容色譜分離儀的基本原理和基本概念 色譜分離的理論基礎 色譜定性和定量分析的方法 本章知識目標熟悉色譜分析中的基本術語;了解色譜分析中的塔板理論和速率理論;熟悉影響色譜柱柱效、分離度的因素;熟悉色譜分析中的定性和定量方法。本章能力目標熟練校正因子的計算方法;掌握歸一化法、內(nèi)標法的定量計算方法;掌握外標法，熟練繪制外標法工作曲線并進行定量計算;掌握填充柱的制備方法。第一節(jié)

2、 色譜及分類 茨維特實驗固定相CaCO3顆粒流動相石油醚 色帶一、色譜法色譜法是一種分離分析技術。它是利用各物質(zhì)在兩相中具有不同的分配系數(shù)，當兩相作相對運動時，這些物質(zhì)在兩相中進行多次反復的分配來達到分離的目的 。色譜法以其具有高分離效能、高檢測性能、分析時間快速而成為現(xiàn)代儀器分析方法中應用最廣泛的一種方法。 固定相在色譜柱中固定不動的相?？梢允枪腆w，還可以是液體。 流動相攜帶試樣混合物流過固定相的流體，是液體或氣體。 色譜柱承載固定相的裝置。各種材質(zhì)和尺寸。 被分離組分不再僅局限于有色物質(zhì)基本術語：二、色譜法分類 1按兩相分子的聚集狀態(tài)流動相 固定相 類型液相色譜液體 固體 液-固色譜液體

3、液體 液-液色譜氣體 固體 氣-固色譜氣體 液體 氣-液色譜氣相色譜2按固定相的固定方式平面色譜 紙色譜 薄層色譜 高分子薄膜色譜柱色譜 填充柱色譜 毛細管柱色譜 3按分離機制分分配色譜：利用分配系數(shù)的不同吸附色譜：利用物理吸附性能的差異離子交換色譜：利用離子交換原理空間排阻色譜：利用排阻作用力的不同 色譜法的特點分離效率高：復雜混合物，有機同系物、異構體。手性異構體。靈敏度高：可以檢測出g.g-1(10-6)-ng.g-1(10-9)級的物質(zhì)量。分析速度快：一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個試樣的分析。應用范圍廣：氣相色譜：沸點低于400的各種有機或無機試樣的分析。 液相色譜：高沸點、熱不

4、穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。不足之處：被分離組分的定性較為困難。分離過程 當流動相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時，其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強弱不同，隨著流動相的移動，混合物在兩相間經(jīng)過反復多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時間不同，從而按一定次序由固定相中流出。第二節(jié) 色譜流出曲線和術語 一、 色譜流出線 從進樣到被測組分流出色譜柱進入檢測器連續(xù)測定，得到的檢測信號隨時間變化的曲線稱為色譜流出曲線或色譜圖。二、色譜術語 1基線：操作條件穩(wěn)定后，無樣品通過時檢測器所反映的信號一時間曲線。 它反映檢測器系統(tǒng)噪聲隨時間變化。穩(wěn)定

5、的基線是一條直線。2色譜峰：從被測組分開始進入檢測器至完全流出檢測器所形成的峰型部分稱色譜峰?；€與色譜峰組成了一個完整的色譜圖。色譜峰3保留值 保留時間tM：不與固定相作用的物質(zhì)從進樣到出現(xiàn)峰極大值時的時間。 保留時間tR：試樣從進樣到出現(xiàn)峰極大值時的時間。它包括組份隨流動相通過柱子的時間 tM和組份在固定相中滯留的時間。 調(diào)整保留時間 ：某組份的保留時間扣除死時間后的保留時間，它是組份在固定相中的滯留時間。 死體積Vm：不被保留的組分通過色譜柱所消耗的流動相的體積，又指色譜柱中未被固定相所占據(jù)的空隙體積（包括色譜儀中的 管路、連接頭的空間、檢測器的空間）。F0：流動相的體積流速 保留體積V

6、R：從進樣開始到組分出現(xiàn)濃度極大點時所消耗的流動相的體積。調(diào)整保留體積 ：保留體積與死體積之差，即組分停留在固定相時所消耗流動相的體積 相對保留值is ：一定實驗條件下組分i與另一標準組分S的調(diào)整保留時間之比。相對保留值只與柱溫和固定相性質(zhì)有關，與其他色譜操作條件無關，色譜定性分析的重要參數(shù) 。4. 色譜峰區(qū)域分析峰高h：色譜峰頂?shù)交€的垂直距離。 半峰寬W1/2 ：色譜峰高一半處的寬度。峰底寬W：從色譜峰兩側(cè)拐點上的切線與基線交點之間的距離，也稱基線寬度。標準偏差 ：峰高(h)的0.607倍處色譜峰寬度的一半。與半峰寬及峰底寬的關系為： W1/2=2.354 W=4 區(qū)域?qū)挾龋悍迕娣e（A）：

7、由色譜峰與基線之間所圍成的面積稱為峰面積。定量分析的基本依據(jù)。對理想的對稱峰： A=1.065hW1/2 在相同的色譜操作條件下獲得的色譜峰的區(qū)域?qū)挾戎翟叫?，說明色譜柱的分離效能越好，柱效越高。 5. 描述分配過程的參數(shù) 分配系數(shù)K： 組分在固定相和流動相之間的分配處于平衡狀態(tài)時，在兩相中的濃度之比。K 只與固定相和溫度有關，與兩相體積、柱管特性和所用儀器無關。 分配比k： 在一定的溫度和壓力下，組分在兩相間分配達平衡時，分配在固定相和流動相中的質(zhì)量比。 =Vm/Vs，表示相比率，是柱型特點參數(shù)，對于填充柱，值一般為635，對于毛細管柱，值一般為60600。 選擇性因子： 指相鄰兩組分調(diào)整保留

8、值之比。值的大小反映了色譜柱對難分離組分對的分離選擇性，值越大，相鄰兩組分色譜峰相距越遠，色譜柱的分離選擇性越高。當?shù)扔诨蚪咏?時，說明相鄰兩組分不能分離。色譜流出曲線的意義色譜峰數(shù)=樣品中單組份的最少個數(shù)；色譜保留值定性依據(jù)；色譜峰高或面積定量依據(jù)；色譜保留值或區(qū)域?qū)挾壬V柱分離效能評價指標；色譜峰間距固定相或流動相選擇是否合適的依據(jù)。第三節(jié) 色譜分析基本理論兩組份峰間距足夠遠： 由各組份在兩相間的分配系數(shù)決定，即由色譜過程的熱力學性質(zhì)決定。每個組分峰寬足夠?。?由組份在色譜柱中的傳質(zhì)和擴散決定，即由色譜過程的動力學性質(zhì)決定。熱力學理論：塔板理論平衡理論 動力學理論：速率理論Vander方程

9、 基本理論一、塔板理論 塔板模型：將一根色譜柱視為一個精餾塔，即色譜柱是由一系列連續(xù)的、相等的水平塔板組成。每一塊塔板的高度用H表示，稱為塔板高度。塔板理論假設：在每一塊塔板上，溶質(zhì)在兩相間很快達到分配平衡，然后隨著流動相按一個一個塔板的方式向前轉(zhuǎn)移。對一根長為L的色譜柱，溶質(zhì)平衡的次數(shù)n稱為理論塔板數(shù)。塔板理論要點當溶質(zhì)在柱中的平衡次數(shù)，即理論塔板數(shù)n大于50時，可得到基本對稱的峰形曲線。當試樣進入色譜柱后，只要各組分在兩相間的分配系數(shù)有微小差異，經(jīng)過反復多次的分配平衡后，仍可獲得良好的分離。 n與半峰寬度及峰底寬的關系式為： 有效塔板數(shù)和有效塔板高度單位柱長的塔板數(shù)越多，表明柱效越高。用不

10、同物質(zhì)計算可得到不同的理論塔板數(shù)。常用有效塔板數(shù)n有效表示柱效： 例題1： 在柱長為2m的5%的阿皮松柱、柱溫為1000C，記錄紙速度為2.0cm/min的色譜條件下，測定苯的保留時間為1.5min，半峰寬為0.20cm，求理論塔板數(shù)。解(1) ：解(2) ：二、速率理論 速率方程（也稱范.弟姆特方程式） u 為流動相線速度； A，B，C為常數(shù) A分別表示渦流擴散系數(shù)； B分子擴散系數(shù)；C傳質(zhì)阻力系數(shù)（包括液相和固相傳質(zhì)阻力系數(shù)）減小A、B、C三項可提高柱效1渦流擴散項 A = 2dp dp：固定相的平均顆粒直徑：固定相的填充不均勻因子固定相顆粒越小dp，填充的越均勻，A，H，柱效n。表現(xiàn)在渦

11、流擴散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。2分子縱向擴散項 B = 2Dg ：彎曲因子，填充柱色譜，1。Dg：組分分子在氣相中的擴散系數(shù)（cm2s-1）擴散導致色譜峰變寬，H(n)，分離變差液相色譜中的分子縱向擴散可以忽略。對氣相色譜，采用相對分子質(zhì)量較大的N2、Ar為流動相并適當加大流動相流速，可降低分子縱向擴散項的影響.3傳質(zhì)阻力項 k為容量因子； Dg 、Ds為擴散系數(shù)。固定相液膜越薄，擴散系數(shù)越大，固定相傳質(zhì)阻力就越小，但固定相液膜不宜過薄，否則會減少樣品容量，降低柱的壽命。減小擔體粒度，選擇小分子量的氣體作載氣，可降低傳質(zhì)阻力。三、分離度 1色譜柱的總分離效能 (a)兩色譜峰距離

12、近且峰形寬，彼此嚴重相重疊，柱效和選擇性都差；(b)雖能很好分離，但峰形很寬，表明選擇性好，但柱效低；(c)分離情況最為理想，既有良好的選擇性，又有高的柱效。 2.分離度(R)的表達式R值越大，表明兩組分的分離程度越高;R=1.0時，分離程度可達98;R1.0時兩峰有部分重疊;R=1.5時，分離程度達到99.7;所以，通常用R=1.5作為相鄰兩色譜峰完全分離的指標。 R=1.5R=0.75R=1.0響應信號保留時間 t, min3. 色譜分離方程分離度R與塔板數(shù)有關;分離度R與保留因子 有關系； 越大，柱選擇性越好，對分離有利。例2：兩物質(zhì)A和B在30cm長的色譜柱上的保留時間分別為16.4和

13、17.63min，有一不與固定相作用的物質(zhì)，其在此柱上的保留時間為1.30 min。物質(zhì)A和B的峰底寬分別為1.11和1.21min。試問：1）柱分離度R；2）柱平均理論塔板數(shù)nav3）平均塔板高度Hav4）若要求R達到1.5，則柱長至少應為多少？4) 完全分離, R=1.5【例3】有一根1.5m長的柱子，分離組分1和2，得到如圖6-5所示的色譜圖。圖中橫坐標為記錄紙走紙距離。(1)求此兩種組分在該色譜柱上的分離度和該色譜柱的有效塔板數(shù)。(2)如要使1、2完全分離，色譜柱應該要加到多長？求出分離度： 有效塔板數(shù)： 【解】（1）先求出組分2對組分1的相對保留值2,1(即值)（2）該柱有效塔板高度

14、：完全分離的條件是分離度R=1.5此時色譜柱的有效塔板數(shù)：要使有效塔板數(shù)為4356塊，柱長第四節(jié) 定性和定量分析 色譜法是分離復雜混合物的重要方法,同時還能將分離后的物質(zhì)直接進行定性和定量分析。 一、定性分析色譜定性分析: 確定色譜圖上每一個峰所代表的物質(zhì)。依據(jù): 在色譜條件一定時，任何一種物質(zhì)都有確定的保留時間。方法: 在相同色譜條件下，通過比較已知物和未知物的保留值或在固定相上的位置，即可確定未知物是何種物質(zhì)。方法的發(fā)展:色譜與質(zhì)譜或其它光譜法聯(lián)用，是目前解決復雜混合物中未知物定性分析的最有效的技術。二、定量分析 色譜定量分析:在一定的色譜條件下，組分i的質(zhì)量(mi)或其在流動相中的濃度，

15、依據(jù):組分i的質(zhì)量(mi)或其在流動相中的濃度，與檢測器響應信號(峰面積Ai或峰高hi)呈正比。分別為峰面積和峰高的校正因子。 1響應信號的測量 峰高：峰頂與基線之間的距離，測量比較簡單，特別適于較窄的色譜峰 峰面積： （1）自動測量：色譜工作站。 （2）手工法測量： 手工測量對稱的峰: 近似計算公式為： A = 1.064 hW1/2不對稱峰: 近似計算公式為: A = h（W 0.15 + W 0.85 ）/ 2 W0.15和W0.85分別是峰高0.15和0.85處的峰寬值 2定量校正因子 (1) 絕對校正因子: 組分i的峰面積和峰高的絕對校正因子分別為：絕對校正因子是指某組分i通過檢測器

16、的量與檢測器對該組分的響應信號之比。mi的單位用克、摩爾或體積表示時相應的校正因子，分別稱為質(zhì)量校正因子(fm)，摩爾校正因子(fM)和體積校正因子(fv) (2) 相對校正因子 相對校正因子：指組分i與基準組分s的絕對校正因子之比. 由于絕對校正因子很少使用，因此，一般文獻上提到的校正因子，就是相對校正因子。 表6-1 一些化合物的相對校正因子化合物沸點/C相對分子質(zhì)量熱導池檢測器氫焰檢測器fMfvfm甲烷-160162.800.451.03乙烷-89301.960.591.03丙烷-42441.550.681.02丁烷-0.5581.180.680.91乙烯-104282.080.590.

17、98丙烯-48421.550.633. 定量方法 分類： （1）外標法 （2）內(nèi)標法 （3）歸一化法（1）外標法把待測組分的純物質(zhì)配成不同濃度的標準系列；在一定操作條件下分別向色譜柱中注入相同體積的標準樣品，測得各峰的峰面積或峰高，繪制Ac或h-c的標準曲線；在完全相同的條件下注入相同體積的待測樣品，根據(jù)所得的峰面積或峰高從曲線上查得含量。外標法也稱為標準曲線法 外標法不使用校正因子，準確性較高；操作條件變化對結(jié)果準確性影響較大；對進樣量的準確性控制要求較高；適用于日?？刂品肿踊虼罅客惲吭嚇拥目焖俜治?。特點及要求：（2）內(nèi)標法 應用前提：當只需測定試樣中某幾個組分，或試樣中所有組分不可能全部

18、出峰時，可采用內(nèi)標法； 準確稱取試樣，加入一定量某種純物質(zhì)作為內(nèi)標物，然后進行色譜分析; 由被測物和內(nèi)標物在色譜圖上相應的峰面積(或峰高)和相對校正因子，求出某組分的含量。 在實際工作中，一般以內(nèi)標物作為基準物質(zhì)，此時含量計算式可簡化為【例題4】用氣相色譜法測定試樣中一氯乙烷、二氯乙烷和三氯乙烷的含量。采用甲苯作內(nèi)標物，稱取2.880g試樣，加入0.2400g甲苯，混合均勻后進樣，測得其校正因子和峰面積如下表所示，試計算各組分的含量。組分甲苯一氯甲烷二氯甲烷三氯甲烷1.001.151.471.652.161.482.342.64【解】 內(nèi)標物要滿足以下要求：試樣中不含有內(nèi)表物質(zhì)；與被測組分性質(zhì)比較接近；不與試樣發(fā)生化學反應；出峰位置應位于被測組分附近，且無組分峰影響 特點：內(nèi)標法的準確性較高，操作條件和進樣量的稍許變動對定量結(jié)果的影響不大;每個試樣的分析，都要進行兩次稱量，不