流式細(xì)胞術(shù)的基本理論

1、第一節(jié)流式細(xì)胞術(shù)的基本理論節(jié)概述流式細(xì)胞術(shù)是一種對懸液中單個細(xì)胞或細(xì)胞器、質(zhì)點進行快速測量和自動分析的高新技術(shù)。該技術(shù)的特點是: 測量速度快，每秒鐘能測量上千個細(xì)胞，它不僅可以進行多參數(shù)相關(guān)測量，而且還可以把指定特征的細(xì)胞亞群從整 個細(xì)胞群中分離出來。本節(jié)主要介紹流式細(xì)胞儀的光學(xué)及工作原理。撅知識點導(dǎo)航工作原理流式細(xì)胞儀主要由流動室及液流系統(tǒng)、激光器及光學(xué)系統(tǒng)、光電管及檢測系統(tǒng)、計算機及分析系統(tǒng)四個部分組 成如圖17 1 o圖17-1流式細(xì)胞儀的工作原理圖待測細(xì)胞被制備成單細(xì)胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后置于專用樣品管中，在氣體壓力作用下被壓入流動室， 流動室內(nèi)充滿鞘液，在鞘液作用下，細(xì)胞排成

2、單列，沿液流的軸心一個接一個地從流動室下端的噴嘴噴出，形成細(xì) 胞液柱。液柱與高度聚焦的激光束垂直相交，細(xì)胞受到激光激發(fā)產(chǎn)生熒光信號和散射光信號，這些光信號通過相應(yīng) 的光電管和檢測器被接收并轉(zhuǎn)換成電信號，經(jīng)放大器放大后送入計算機并進行分析顯示和結(jié)果輸出。光學(xué)原理流式細(xì)胞儀的光學(xué)系統(tǒng)由激光器和若干組透鏡、濾光片及小孔組成，它們分別將不同波長的熒光信號送入到不 同的電子探測器。其主要光學(xué)元件是分色反射鏡(DL)和濾光片(filter)，它們一般分為三類：長通濾片(long pass filter， LP)、短通濾片(short pass filter， SP)和帶通濾片(band pass filt

3、er， BP)。分色反射鏡(488DL、550DL、600DL、640DL)用于選擇被測熒光波長，只允許大于特定波長的光通過，而將 小于特定波長的光反射到光電檢測器。長通濾片只允許特定波長以上的光通過，特定波長以下的光不能通過。如LP620 nm濾片，只允許620 nm以 上的光通過，而620 nm以下的光吸收或返回。短通濾片與長通濾片相反，允許特定波長以下的光通過，而特定波長以上的光吸收或返回。帶通濾片(488BP、525BP、575BP、675BP)允許某一特定波長的光線通過，而其他波長的光全部被阻斷。例如，F(xiàn)ITC染料發(fā)射出525 nm的綠色熒光，PE染料發(fā)射出575 nm的橙色熒光，分

4、別選擇550DL和525BP組成 的濾片組和600DL和575BP濾片組，即可達(dá)到特異地接收FITC和PE熒光信號的目的。光電倍增管和硅光電二極管， 可分別將側(cè)向散射光和前向散射光以及525675等不同的熒光信號收集檢測。散射光測量細(xì)胞在通過測量區(qū)時由于受光照射會向空間360立體角的所有方向散射光線，散射的信號與細(xì)胞的大小、形狀、 質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)部的折射率有關(guān)，與收集散射光的方向也有關(guān)。在流式細(xì)胞術(shù)中一般采用0前向散射光(FS)和90 側(cè)向散射光(SS)。前向散射光的強度與細(xì)胞大小有關(guān)，對于同一個細(xì)胞群體，散射光強的細(xì)胞大一些，而散射光弱 的細(xì)胞小一些。側(cè)向散射光對細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為

5、敏感，對胞質(zhì)內(nèi)較大的顆粒也有反應(yīng)，可獲得有關(guān) 細(xì)胞內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)及膜表面光滑程度的有關(guān)信息。圖17-2是利用流式細(xì)胞儀前向散射光和側(cè)向散射光 測得的全血白細(xì)胞二維點圖，由圖可見，利用FS和SS可將白細(xì)胞群中不同細(xì)胞群分開，得到很清楚的三群細(xì)胞。0 fe 5 5S S 5& ZeFS:前向散射光；SS:側(cè)向散射光圖17-2全血白細(xì)胞二維點圖熒光測量熒光信號有特征熒光和自發(fā)熒光兩類。特征熒光是指用熒光染料對細(xì)胞進行特異性染色，受到光照射后發(fā)出的 熒光稱為特征熒光。自發(fā)熒光是指未染色的細(xì)胞，受到光照射后所發(fā)出的熒光稱為自發(fā)熒光。其熒光強弱與細(xì)胞的 大小、細(xì)胞的類型、激發(fā)光的波長和發(fā)射光的檢測

6、范圍等有關(guān)，細(xì)胞中產(chǎn)生自發(fā)熒光的分子可能是核黃素和細(xì)胞色 素等。在培養(yǎng)細(xì)胞中死細(xì)胞比活細(xì)胞的自發(fā)熒光要強。用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞的特征熒光時，自發(fā)熒光對所測定特 征熒光是一種本底信號，應(yīng)在設(shè)定陰性對照樣品時加以去除，同時應(yīng)盡可能地選用較亮的熒光染料染色細(xì)胞，提高 信號/噪聲比，以減少自發(fā)熒光的干擾，這是在樣品處理與測量中應(yīng)特別注意的問題。熒光補償：對于雙標(biāo)記或三標(biāo)記熒光染色的樣品，在應(yīng)用FCM測量時需要對熒光信號的光譜重疊部分進行校正， 當(dāng)用一束激光激發(fā)兩種熒光染料，而同時發(fā)出兩種不同波長的熒光時，從理論上講，可以通過選擇濾片使每種熒光 僅被檢測器檢測。但由于兩種熒光的發(fā)射光譜不可避免的重疊現(xiàn)象

7、，在實際測量中當(dāng)兩波長比較接近，如FITC發(fā)射 的525 nm熒光和PE發(fā)射的575 nm熒光會發(fā)生交叉干擾，使被測信號失真，測量結(jié)果產(chǎn)生較大的誤差，因此須采用 熒光補償方法來解決這種交叉重疊的問題。目前生產(chǎn)廠家都提供有熒光補償?shù)膶嵱贸绦?，用廠商指定的488 nm激光 激發(fā)的三種熒光染料（FITC、PE、PerCP）,在測量中加以正確補償即可比較容易達(dá)到正確測量熒光信號的目的。測量參數(shù)分析（1）單參數(shù)直方圖分析：是流式細(xì)胞術(shù)使用最多的一種分析方法，它主要用來分析細(xì)胞相對數(shù)與測量參數(shù)之間的 關(guān)系（圖17 3）。圖17-3是CD3陽性T淋巴細(xì)胞的直方圖，橫坐標(biāo)代表所測CD3分子的熒光強度（即“熒光

8、道數(shù)”）， 縱坐標(biāo)代表細(xì)胞的相對數(shù)，進入B門域內(nèi)的為表達(dá)CD3陽性T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)，陽性率占細(xì)胞總數(shù)的78.27%，未 進入B門域左側(cè)的為CD3陰性細(xì)胞數(shù)，占細(xì)胞總數(shù)的21.8%。coo-rnr圖17-3 CD3+T淋巴細(xì)胞的直方圖雙參數(shù)直方圖分析：多用于一種細(xì)胞以兩種熒光染料染色而獲得兩個參數(shù)的二維數(shù)據(jù)的分析，也可用于前向 散射光與側(cè)向散射光圍成的細(xì)胞二維點圖的分析。一般用橫坐標(biāo)代表某一個參數(shù)，縱坐標(biāo)代表另一個參數(shù)。圖17 -4是同時用雙標(biāo)記抗體CD4 /FITC和91C3/PE染色的細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀測量所得到的雙參數(shù)直方圖。平面上每一 個點表示同時具有相應(yīng)坐標(biāo)值的細(xì)胞，D1區(qū)域為91C3陽性細(xì)胞群，D2區(qū)域為CD4和91C3雙陽性細(xì)胞群，D3區(qū)域為 陰性細(xì)胞群，D4區(qū)域為CD4陽性細(xì)胞群。4圖17-4細(xì)胞雙參數(shù)直方圖DNA直方圖分析：主要用于細(xì)胞周期分析，用該方法可以得到細(xì)胞周期中各時相(G0/G1期、S期和G2/M期) 細(xì)胞的百分比及DNA含量，以便進行細(xì)胞動力學(xué)的研究。另一應(yīng)用是進行細(xì)胞DNA倍體分析，以同種屬正常二倍體 細(xì)胞作對照判定所測細(xì)胞屬于幾倍體細(xì)胞。圖17-5是用Coultor公司提供的DNA染色試劑盒，染色細(xì)胞DNA所獲得的DNA直方圖。細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，其熒光強度與DNA含量成正比。G0/G1期細(xì)胞的DNA含量是2C, G2/M細(xì)