發(fā)酵工程原理與技術PPT精品課程課件全冊課件匯總

1、授課人：XX XX 發(fā)酵工程原理與技術XX學院 XX 專業(yè)【全套課件】第一章 總論一、發(fā)酵工程的概念發(fā)酵的定義：利用生物細胞（含動物、植物和微生物細胞），在合適的條件下，經(jīng)特定的代謝途徑轉變?yōu)樗璁a(chǎn)物或菌體的過程。發(fā)酵工程：是發(fā)酵原理與工程學的結合，是研究由生物細胞參與的工藝過程的原理和科學，是研究利用生物材料生產(chǎn)有用物質(zhì)，服務于人類的一門綜合性科學技術。發(fā) 酵 工 程 利用微生物進行產(chǎn)品生產(chǎn)抗生素、生物制藥、氨基酸、核苷酸、有機酸、飼料添加劑、微生態(tài)制劑、生物農(nóng)藥、生物肥料等醫(yī)藥、輕工、食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、能源等行業(yè)基因工程藥物、疫苗及抗體產(chǎn)品 化學工程 生物化工 生物加工行業(yè)傳統(tǒng)生物技術現(xiàn)代

2、生物技術基因工程菌發(fā)酵一、發(fā)酵工程的概念一般的，發(fā)酵工程又可稱為微生物工程，但嚴格來說，發(fā)酵（微生物培養(yǎng)）只是發(fā)酵工程的一部分，而不是全部，但是其核心內(nèi)容。通常，發(fā)酵工程分為兩大部分：發(fā)酵部分：主要是通過一系列的環(huán)節(jié)，提供條件，使菌體生長繁殖，并產(chǎn)生發(fā)酵所要的目的產(chǎn)物（代謝產(chǎn)物）。提純部分：這部分是通過一些物理的、化學的手段、方法，將代謝產(chǎn)物從發(fā)酵醪中提純出來，獲得最終產(chǎn)品。一、發(fā)酵工程的概念現(xiàn)代發(fā)酵工程是以天然生物體和人工修飾的生物體為加工對象，集現(xiàn)代化高新技術為一體，生產(chǎn)產(chǎn)品或服務于人類社會的一種工程技術?，F(xiàn)代發(fā)酵工程加工的對象生物，除天然生物菌種和變異微生物菌株外，還有基因工程菌、細胞融

3、合菌以及動植物細胞株。發(fā)酵工程的無菌概念已由原來的將雜菌排除再發(fā)酵系統(tǒng)外的單向概念轉變?yōu)橥瑫r要求發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)的生物體不能逸出系統(tǒng)外的雙向概念。發(fā)酵的培養(yǎng)技術已不是簡單的通氣攪拌培養(yǎng)技術，而是要根據(jù)生物的類型、目的產(chǎn)物的特征不同而采用更復雜的培養(yǎng)技術，并引入了生化工程放大概念。二、發(fā)酵過程的特點和分類獲得發(fā)酵產(chǎn)品的條件：適宜的微生物、保證或控制微生物進行代謝的各種條件、進行微生物發(fā)酵的設備、精制成產(chǎn)品的方法的設備。發(fā)酵過程的特點： 1）發(fā)酵過程一般都在常溫常壓下進行的生化反應，反應條件比較溫和。2）可采用廉價原材料，甚至可以利用廢物為發(fā)酵原材料生產(chǎn)高附加值的產(chǎn)品。3）發(fā)酵過程是通過生物體的自適應調(diào)

4、節(jié)來完成的，反應的專一性強，因而，可以得到單一的代謝產(chǎn)物。4）發(fā)酵工業(yè)相對投資較少，見效較快，具有經(jīng)濟和效能的統(tǒng)一性。二、發(fā)酵過程的特點和分類發(fā)酵過程分類：根據(jù)發(fā)酵對氧的需要：厭氧和有氧發(fā)酵根據(jù)發(fā)酵原料:糖質(zhì)原料和烴類原料發(fā)酵根據(jù)發(fā)酵狀態(tài)：液體和固體發(fā)酵根據(jù)發(fā)酵工藝類型：分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵根據(jù)產(chǎn)物類型：食品發(fā)酵、有機酸發(fā)酵、氨基酸發(fā)酵、維生素發(fā)酵、抗生素發(fā)酵等三、發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)流程發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)過程主要包括：原料預處理培養(yǎng)基配制無菌空氣的制備微生物菌種制備和擴大培養(yǎng)發(fā)酵發(fā)酵產(chǎn)品的分離和純化發(fā)酵的流程空氣空氣凈化處理保藏菌種斜面活化擴大培養(yǎng)種子罐主發(fā)酵碳源、氮源、無機鹽等營養(yǎng)物質(zhì)滅菌產(chǎn)物分離純化成品

5、三、發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)流程發(fā)酵原料的預處理原料不同處理方法也有所差異。1.淀粉利用前需變成糊精或葡萄糖。方法：酸水解（高壓、耐酸）、酶水解法2.糖蜜加熱殺菌和用水沖稀，也可加酸處理后再補充無機鹽。3.碳氫化合物：石油脫蠟一定餾分的石油經(jīng)冷卻脫蠟而獲得的凝固點在-10的油，加入適量無機鹽進行接種發(fā)酵。三、發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)流程發(fā)酵培養(yǎng)基的配制與滅菌（1）目的要明確；（2）培養(yǎng)基的營養(yǎng)要協(xié)調(diào)；（3）pH要適宜。滅菌:主要采用高壓水蒸汽直接對培養(yǎng)基進行加熱滅菌，多采用121保溫20-30min，然后冷卻，這樣稱之為實罐滅菌；也可采用連續(xù)滅菌。三、發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)流程無菌空氣制備一般采用無菌空氣作為氧氣來源，高空采風

6、，經(jīng)空氣壓縮機加壓后采用加熱滅菌或過濾除菌。微生物種子的制備一般都是由保存于冷凍管及砂土管或冰箱中的斜面菌種開始，在正式使用前要先轉接到新鮮斜面培養(yǎng)基上活化后，再用于種子擴大培養(yǎng)。擴大培養(yǎng)的方法可以根據(jù)需要采用固體培養(yǎng)或液體培養(yǎng)兩級不同方式。菌種篩選搖瓶試驗發(fā)酵罐試驗三、發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)流程發(fā)酵過程的操作方式三種模式：間歇發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵和流加發(fā)酵間歇發(fā)酵又稱分批發(fā)酵，在發(fā)酵過程中，除氣體進出外，與外界沒有其它的物料交換。分批發(fā)酵是一種操作簡單并且廣泛使用的發(fā)酵方式。連續(xù)發(fā)酵是指以一定的速度向培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)添加新鮮的培養(yǎng)基，同時以相同的速度流出培養(yǎng)液，從而使培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)液的體積維持恒定，使微生物細胞處

7、于近似恒定狀態(tài)下生長的微生物發(fā)酵方式。流加發(fā)酵是介于分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間的發(fā)酵形式。發(fā)酵產(chǎn)品及分離提純工藝固液分離技術、細胞破碎技術、濃縮分離技術、精制技術、結晶技術等四、發(fā)酵工程的發(fā)展歷史發(fā)酵現(xiàn)象釀造食品工業(yè)非食品工業(yè)青霉素抗菌素發(fā)酵工業(yè)氨基酸,核酸發(fā)酵（代謝控制發(fā)酵）基因工程菌動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)藻類細胞大規(guī)模培養(yǎng)轉基因動物1、發(fā)酵現(xiàn)象的早期認識1680年制成顯微鏡 微生物的存在1857年巴斯德證明了酒精是由活的酵母發(fā)酵引起的1897年畢希納發(fā)現(xiàn)磨碎的酵母仍使糖發(fā)酵形成酒精 酶四、發(fā)酵工程的發(fā)展歷史2、發(fā)酵工程的早期階段 人們的對發(fā)酵技術的認識起始于19世紀末，主要來自于

8、厭氧發(fā)酵，如利用酵母菌、乳酸菌生產(chǎn)酒精、乳酸和各種發(fā)酵食品。 20世紀初期，1916年英國采用梭狀芽孢桿菌生產(chǎn)丙酮丁醇，德國采用亞硫酸鹽法生產(chǎn)甘油（第一次世界大戰(zhàn)）由食品工業(yè)向非食品工業(yè)發(fā)展。3、發(fā)酵工程的重大轉折點 二十世紀四十年代初，第二次世界大戰(zhàn)爆發(fā)，青霉素的發(fā)現(xiàn)，迅速形成工業(yè)大規(guī)摸生產(chǎn)?？股毓I(yè)的發(fā)展，建立了一套完整的好氧發(fā)酵技術，推動了整個發(fā)酵工業(yè)的深入發(fā)展，現(xiàn)代發(fā)酵工程奠定了基礎。四、發(fā)酵工程的發(fā)展歷史3、發(fā)酵工程的重大轉折點 20世紀70年代，細胞融合技術、基因技術等生物技術發(fā)展，打破了生物種間障礙，能定向地制造出新的有用的微生物： 增加微生物體內(nèi)控制代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的基因拷貝數(shù)，

9、可以大幅度地提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)量。 將動、植物或某些微生物特有產(chǎn)物的控制基因植入細胞中，快速經(jīng)濟地大量生產(chǎn)這些產(chǎn)物。 將具有不同性能的多種質(zhì)粒植入，使新菌株在清除污染或以非糧食物質(zhì)為原料進行發(fā)酵生產(chǎn)或環(huán)境保護。四、發(fā)酵工程的發(fā)展歷史4、發(fā)酵工程產(chǎn)業(yè)化發(fā)展 目前，全球發(fā)酵產(chǎn)品的年銷售額在400億美元左右，并以每年約78的速率增長。 我國發(fā)酵行業(yè)生產(chǎn)企業(yè)有5000多家，主要發(fā)酵產(chǎn)品的年產(chǎn)值高達1300億元。 發(fā)酵工程技術給人類社會生產(chǎn)力的發(fā)展帶來了巨大的潛力，涉及到解決人類所面臨的食品與營養(yǎng)、健康與環(huán)境、資源與能源等重大問題。五、生物工程與發(fā)酵工程的關系 發(fā)酵工程是生物技術產(chǎn)業(yè)化的基礎和關鍵技術，是

10、生物技術四大支柱的核心。 發(fā)酵工程是生物技術產(chǎn)品走向工業(yè)化的必由之路。生物工程基因工程細胞工程酶工程產(chǎn)品發(fā)酵工程產(chǎn)物產(chǎn)品第二章 發(fā)酵工業(yè)微生物菌種制備原理和技術第一節(jié) 發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的選育第二節(jié) 工業(yè)微生物種子的擴大培養(yǎng)第三節(jié) 種子培養(yǎng)基及其制備一、工業(yè)微生物的特點 工業(yè)微生物是指在發(fā)酵工業(yè)上已經(jīng)應用的或具有潛在應用價值的微生物，其范圍隨科學技術的發(fā)展而不斷擴展。工業(yè)微生物的特點：個體小、種類多、繁殖快、分布廣、代謝能力強、易變異改造。第一節(jié) 發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的選育二、發(fā)酵工業(yè)常用微生物菌種及要求（一）發(fā)酵工業(yè)對菌種的要求1、能在廉價原料制備的培養(yǎng)基上迅速生長并生成所需的代謝產(chǎn)物，且產(chǎn)量

11、高；2、培養(yǎng)條件易于控制；3、生長迅速，發(fā)酵周期短；4、滿足代謝控制的要求；5、抗噬菌體和雜菌能力強；二、發(fā)酵工業(yè)常用微生物菌種及要求（一）發(fā)酵工業(yè)對菌種的要求6、遺傳性狀穩(wěn)定，菌種不易變異退化；7、在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的泡沫要少；8、對需要添加的前體物質(zhì)有耐受能力；并且不能將這些前體物質(zhì)作為一般碳源使用；9、不是病原菌，同時在系統(tǒng)發(fā)育上與病原菌無關，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)（包括抗生素、激素和病毒）以保證安全。（二）工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物菌種1、細菌（Bacteria） 細菌是單細胞原核生物，具有環(huán)狀DNA染色體，以典型的二分分裂方式繁殖。(1) 球細菌根據(jù)形態(tài)可分為三類：(2) 桿細菌(3)

12、 螺旋細菌 工業(yè)上常用的有枯草芽孢桿菌、醋酸桿菌、乳酸桿菌、棒狀桿菌、短桿菌等。 放線菌是介于細菌與絲狀真菌之間而又接近于細菌的一類絲狀單細胞原核生物。 因菌落呈放射狀而得名2、放線菌（Actinomycetes）抗生素有60以上是放線菌產(chǎn)生的工業(yè)生產(chǎn)常用的放線菌主要來自以下幾個屬：鏈霉菌屬、小單孢菌屬、諾卡菌屬3、酵母菌（Yeast） 酵母菌是單細胞真核生物，常以出芽方式進行無性繁殖。c 、不形成孢子只通過芽殖的“假酵母”屬半知菌。 a 、形成子囊孢子的株系屬于子囊菌門根據(jù)產(chǎn)生孢子的能力，可將酵母分成三類：b 、形成擔孢子的株系屬于擔子菌門(黑粉菌目)工業(yè)上常用的有：啤酒酵母、假絲酵母、類酵

13、母等4、霉菌（mould） 霉菌非系統(tǒng)演化分類的單元。凡生長在營養(yǎng)基質(zhì)上形成絨毛狀，網(wǎng)狀或絮狀菌絲的真菌統(tǒng)稱霉菌。工業(yè)上常用的霉菌有：藻狀菌綱：根霉，毛霉，犁頭霉子囊菌綱：紅曲霉半知菌類：曲霉，青霉。5、擔子菌（Basidiomycetes）擔子菌是會產(chǎn)生擔子和擔孢子的真菌。擔子菌主要用于多糖、橡膠物質(zhì)和抗癌藥物的開發(fā)。 6、藻類（Alga）許多國家已把它作為人類保健食品和飼料。還可通過藻類將CO2轉變?yōu)槭?；國外還有從“藻類農(nóng)場”獲得氫能的報道。6、藻類（Alga）螺旋藻柵列藻單孢藻三、發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的分離和選育（一）微生物菌種的分離1、施加選擇壓力分離法 施加選擇壓力分離法是利用不同種

14、類的微生物的生長繁殖對環(huán)境和營養(yǎng)（如溫度、pH、滲透壓、氧氣、碳源、氮源等）的要求不同，人為控制這些條件，使之利于某類或某種微生物生長，而不利于其它種類微生物的生存，以達到使目的菌種占優(yōu)勢，而得以快速分離純化的目的。使用高糖或高鹽培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，可獲得耐高滲透壓的微生物控制培養(yǎng)基的各種營養(yǎng)成分（如使某種碳源、氮源成為唯一的碳源、氮源），可使能利用此種營養(yǎng)的微生物富集，從而大量獲得控制不同的pH條件，可分離出嗜酸和嗜堿微生物在高溫下培養(yǎng)，將嗜熱微生物和非嗜熱微生物分開控制培養(yǎng)時的氧氣，將好氧微生物和厭氧微生物分開在分離培養(yǎng)基中加入不同的抗生素或試劑來增加選擇性具體培養(yǎng)方法有兩種方式：1、分批式富

15、集培養(yǎng)（搖瓶培養(yǎng)）2、恒化式富集培養(yǎng)（連續(xù)培養(yǎng)）重復移植幾次后，接種已富集的培養(yǎng)物到固體培養(yǎng)基，可將優(yōu)勢微生物分離出來。移種時間是關鍵，應在所需菌占優(yōu)勢時移種。 用于連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)的菌種選育特別適合。改變限制性基質(zhì)濃度可以控制兩種菌的比生長速率。 2、隨機分離方法（1）抗生素產(chǎn)生菌的分離 抑菌圈法: 工具菌采用抗生素的敏感菌。若被檢菌能分泌某些抑制工具菌生長的物質(zhì)，如抗生素等，便會在該菌落周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈，很容易被鑒別出來。如春雷霉素和青霉素等。除使用高靈敏度的工具菌外，可以利用專一性很強的酶，酶抑制劑，激活劑，抗體等建立高靈敏度，專一的篩選技術。（2）抗腫瘤藥物產(chǎn)生菌的分離 臨床

16、上抗腫瘤藥物大部分是直接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物質(zhì)，由于微生物和人的核酸結構與生物合成方式有許多共同之處，所以大部分抗腫瘤藥物也具有抗菌活性，據(jù)此發(fā)展出利用微生物篩選作用于DNA的抗腫瘤藥物的方法。 生化誘導分析法（BIA） SOS顯色法原理一： 生物體中都存在兩個以上的DNA修復基因，如果一個DNA修復基因損傷或變異，通常仍能存活，但對能引起DNA損傷的化合物十分敏感，易發(fā)生死亡，所以可以利用DNA修復能力突變株篩選抗腫瘤藥物。 實踐中常使用大腸桿菌或枯草芽孢桿菌的重組缺失DNA修復基因突變株和親株作為測試菌來篩選抗腫瘤藥物。原理二：（3）酶抑制劑產(chǎn)生菌的分離 酶抑制劑的生產(chǎn)主要是為

17、了治療某些疾病，如為治療糖尿病需要糖苷酶抑制劑（阻止淀粉等分解為可被吸收的單糖），為治療肥胖需要脂肪酶抑制劑（阻止對攝入的脂肪物質(zhì)的消化吸收）等等。 酶抑制劑產(chǎn)生菌的篩選，主要以所需抑制的酶為靶酶進行篩選。 如果某種化合物能在體外抑制某種關鍵的人體酶，它就可能在體內(nèi)有藥理作用，所以可以在體外進行篩選。例：糖苷酶抑制劑產(chǎn)生菌分離 糖苷酶包括淀粉酶、蔗糖酶和麥芽糖酶 將待篩菌的菌絲提取物加入含-淀粉酶和1淀粉的溶液中，在適合淀粉酶水解淀粉的條件下經(jīng)過一段時間，然后通過于540nm處比色測定OD值，確定淀粉的酶活力，如果酶活力被明顯抑制則證明此菌可產(chǎn)生-淀粉酶抑制劑。例：脲酶抑制劑產(chǎn)生菌的分離（阻止

18、土壤中尿素分解損失） 將不同地點分離的水稻土和廄肥中的待篩微生物的單菌落菌株接種在含2尿素和0.1酚紅的瓊脂培養(yǎng)基上形成單菌落（每一皿可以多接些菌株，如10株），培養(yǎng)一段時間后在培養(yǎng)基表面倒一層一定濃度的脲酶溶液，由于脲酶分解尿素產(chǎn)生堿性物質(zhì)會使含酚紅的培養(yǎng)基由黃色變?yōu)榧t色，如果某個菌落周圍的培養(yǎng)基不變紅，則證明此菌會產(chǎn)生脲酶抑制劑。（4）抗病毒藥物產(chǎn)生菌的分離b、用小平板測定由病毒引起的細胞變性效應（CPE：Cytopathic effect），更多稱細胞病變效應。c、檢測病毒復制中特有的DNA復制酶和核酸合成酶的酶抑制劑。a、利用作用于核酸的方法，如噬菌斑法。 如：殼二孢氯素、衣霉素的分離

19、（5）生長因子產(chǎn)生菌的分離 通過觀察分離菌能否促進營養(yǎng)缺陷型菌株的生長，來檢出生長因子產(chǎn)生菌。 例如氨基酸產(chǎn)生菌的篩選：首先將待試菌接入加了抗真菌化合物（如亞胺環(huán)己酮）的分離培養(yǎng)基中生長，然后采用影印法，將菌落復印到能支持氨基酸產(chǎn)生菌生長的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2-3d后，用紫外線殺死長好的菌落，再往此平板上面鋪一層含有相應氨基酸營養(yǎng)缺陷的營養(yǎng)缺陷型菌株懸液，培養(yǎng)16h后，被殺死的氨基酸產(chǎn)生菌的菌落周圍應有一檢測菌的生長圈。這樣在另一個復印的平板相應的位置上便可以找出產(chǎn)生菌。（6）免疫激活劑產(chǎn)生菌的分離 現(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抑制細胞表面的氨基肽酶B，氨基肽酶A，堿性磷酸脂酶會增強細胞性免疫或抗體產(chǎn)生能力，所以可

20、以利用細胞表面酶的抑制法來篩選免疫激活劑產(chǎn)生菌。（7）多糖產(chǎn)生菌的分離 一般認為制糖工業(yè)，食品加工廠等產(chǎn)生的污水中，可能含有較多的多糖產(chǎn)生菌，并且這類菌的菌落外觀一般比較粘稠，可以通過菌落外觀的觀察來識別。（二）微生物菌種的選育1、自然選育 不經(jīng)過人工處理，利用微生物自然突變進行菌種選育的過程稱為自然選育。 自然選育的一般程序是將菌種制成菌懸液，用稀釋法在固體平板上分離單菌落，再分別測定單菌落的生產(chǎn)能力，從中選出高水平菌種。 自然選育簡單易行，可以達到純化菌種，防止菌種退化，穩(wěn)定生產(chǎn)，提高產(chǎn)量的目的。2、誘變選育 誘變育種是利用各種被稱為誘變劑的物理因素和化學試劑處理微生物細胞，提高基因突變頻

21、率，再通過適當?shù)暮Y選方法獲得所需要的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種的育種方法。（1）誘變育種的原理 誘變育種的理論基礎是突變，主要包括染色體畸變和基因突變兩大類。染色體畸變指的是染色體或DNA片段發(fā)生缺失，易位，逆位，重復等?；蛲蛔冎傅氖荄NA中的堿基發(fā)生變化即點突變。（2）誘變育種的基本方法 誘變育種一般包括誘變和篩選兩個部分，是誘變和篩選過程的不斷重復，直到獲得高產(chǎn)菌株。A、誘變 誘變的關鍵包括出發(fā)菌株的選擇，誘變劑種類和劑量的選擇以及合理的使用。a、出發(fā)菌株的選擇 出發(fā)菌株要有一定的目標產(chǎn)物的生產(chǎn)能力。其它生產(chǎn)性能如生長繁殖快，營養(yǎng)要求低，產(chǎn)孢子多而早，對誘變劑敏感，變異幅度大等。 可以選擇已經(jīng)誘變處理

22、的菌株，因為其對誘變劑的敏感性會有所提高。b、誘變劑種類的選擇單一誘變劑處理復合誘變劑處理c、誘變劑劑量的選擇 誘變劑的劑量與致死率有關，而致死率又與突變率有一定的關系，因此可用致死率作為誘變劑劑量選擇的依據(jù)。 一般突變率隨誘變劑劑量的增加而提高，但達到一定的程度以后，再提高劑量反使突變率下降。B、篩選 誘變處理后，正向突變的菌株通常為少數(shù)，要用各種方法篩選出來a、營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選 某些菌株發(fā)生突變（自然突變或人工誘變）后，失去合成某種（或某些）對該菌株生長必不可少的物質(zhì)（通常是生長因子如氨基酸，維生素）的能力，必須從外界環(huán)境獲得該物質(zhì)才能生長繁殖，這種突變型菌株稱為營養(yǎng)缺陷型。（a）營

23、養(yǎng)缺陷型定義（b）營養(yǎng)缺陷型的意義 在營養(yǎng)缺陷型突變菌株中，生物合成途徑中的某一步發(fā)生了酶缺陷，合成反應不能完成，末端產(chǎn)物不能積累，因此末端產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)作用被解除。只要在培養(yǎng)基中限量加入所要求的末端產(chǎn)物，克服生長障礙，就能使中間產(chǎn)物積累。 營養(yǎng)缺陷型突變株具有明顯的遺傳標記，在雜交育種中作為出發(fā)菌株，有利于雜交重組的分析。 營養(yǎng)缺陷型突變株具有明顯的遺傳標記，可以作為基因工程中的受體菌，檢出克隆基因的表達。（c）營養(yǎng)缺陷型的篩選首先：淘汰野生型，濃縮缺陷型 經(jīng)誘變處理后，缺陷型還是相當少的，必須設法淘汰野生型細胞，提高營養(yǎng)缺陷型細胞所占比例，以達到濃縮缺陷型的目的。 有青霉素法和制霉菌素法等

24、數(shù)種。青霉素法適用于細菌，青霉素能抑制細菌細胞壁的生物合成，殺死正在繁殖的野生型細菌，但無法殺死正處于休止狀態(tài)的營養(yǎng)缺陷型細菌。制霉菌素法則適合于真菌，制霉菌素可與真菌細胞膜上的甾醇作用，從而引起膜的損傷，也是只能殺死生長繁殖著的酵母菌或霉菌。在基本培養(yǎng)基中加入抗生素，野生型生長被殺死，營養(yǎng)缺陷型不能在基本培養(yǎng)基中生長而被保留下來得以濃縮。 (1) 抗生素法 適用于進行絲狀生長的真菌和放線菌。其原理是：在基本培養(yǎng)基中，野生型菌株的孢子能發(fā)芽成菌絲，而營養(yǎng)缺陷型的孢子則不能。通過過濾就可除去大部分野生型，保留下營養(yǎng)缺陷型。(2)菌絲過濾法然后：檢出缺陷型 先在培養(yǎng)皿底部倒一薄層不含菌的基本培養(yǎng)基

25、，待凝，添加一層混有經(jīng)誘變劑處理菌液的基本培養(yǎng)基，其上再澆一薄層不含菌的基本培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后，對首次出現(xiàn)的菌落用記號筆一一標在皿底。然后再加一層完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)后新出現(xiàn)的小菌落多數(shù)都是營養(yǎng)缺陷型突變株。(1)夾層培養(yǎng)法 把誘變處理后的細胞接種在含有微量（0.01%）蛋白胨的基本培養(yǎng)基平板上，野生型細胞就迅速長成較大的菌落，而營養(yǎng)缺陷型則緩慢生長成小菌落。若需獲得某一特定營養(yǎng)缺陷型，可再在基本培養(yǎng)基中加入微量的相應物質(zhì)。(2)限量補充營養(yǎng)法 (3)影印平板法 可以將誘變后的菌液稀釋后接種在完全培養(yǎng)基上，使之形成單株菌落，然后將菌落分別影印到基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，那些在基本培養(yǎng)基上不能

26、生長的菌落就是營養(yǎng)缺陷型菌株的菌落，到完全培養(yǎng)基的相應位置就可以得到營養(yǎng)缺陷型菌株。完全培養(yǎng)基上長成單孢菌落無菌絲絨布橡皮箍圓木柱輕壓在絨布上接上所有菌落的絨布轉印在新鮮的培養(yǎng)基上基本培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基所有菌都長營養(yǎng)缺陷型不長(3)影印平板法 b、抗反饋阻遏和抗反饋抑制突變菌株的篩選 末端產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)在生物合成途徑中普遍存在?？狗答佔瓒艉涂狗答佉种苾煞N突變均是由于代謝失調(diào)，它們有共同的表型，即在細胞中已經(jīng)有了大量的末端產(chǎn)物時仍不斷合成這一產(chǎn)物。（a）因為調(diào)節(jié)基因或操縱基因發(fā)生突變，使產(chǎn)生的阻遏蛋白不再能和終產(chǎn)物結合或結合后不能作用于已突變的操縱基因。因此不再起反饋阻遏作用。（b）由于編碼酶的結

27、構基因發(fā)生突變，使變構酶不再具有結合終產(chǎn)物的能力，但仍具有催化活性，從而解除反饋抑制。代謝失調(diào)的原因：篩選方法1： 通?？狗答佔瓒艉涂狗答佉种仆蛔兙晔峭ㄟ^抗結構類似物突變的方法篩選出來的。結構類似物與末端產(chǎn)物具有相似的結構，能與阻遏蛋白或變構酶結合，阻止產(chǎn)物的合成，引起反饋調(diào)節(jié)作用，但它們不能代替末端產(chǎn)物參與生物合成，它們的濃度不會降低，因此，它們與阻遏蛋白或變構酶的結合是不可逆的。未突變的細胞因代謝受阻，不能合成某種產(chǎn)物而死亡?？狗答佌{(diào)節(jié)的突變株則即使在結構類似物存在的條件下仍可以合成末端產(chǎn)物形成菌落。篩選方法2： 可以從營養(yǎng)缺陷型的回復突變株獲得抗反饋突變株。營養(yǎng)缺陷型突變株是因為對反饋

28、調(diào)節(jié)作用敏感的酶鈍化或缺失等原因所致，發(fā)生回復突變后，雖然酶的催化活性恢復了，但酶的結構發(fā)生了改變，對反饋調(diào)節(jié)作用不敏感，因此可過量積累末端代謝產(chǎn)物。c、組成型突變株的篩選 微生物的產(chǎn)酶過程通常都受到底物誘導、終產(chǎn)物或分解代謝物的阻遏等機制的調(diào)節(jié)，為了解除對誘導物的依賴，擺脫阻遏調(diào)節(jié)，須篩選組成型突變株。突變發(fā)生在調(diào)節(jié)基因或操縱基因,解除對誘導物的依賴,可獲組成型突變株。篩選方法：設計條件使組成型優(yōu)勢生長，或通過菌落分辨。加誘導酶合成抑制物交替培養(yǎng)法顯色反應法例1：加誘導酶合成抑制物 以 - 半乳糖苷酶生產(chǎn)為例，將誘變處理后的菌種培養(yǎng)在含有抑制物鄰硝基 - D- 巖藻糖苷和乳糖的培養(yǎng)液中。在這

29、種培養(yǎng)液中，- 半乳糖苷酶的合成被抑制，因此誘導型菌株不能利用乳糖，則不能生長，而組成型菌株能夠合成 - 半乳糖苷酶，利用乳糖生長，使組成型被富集。例2：交替培養(yǎng)法 將誘導型菌株經(jīng)誘變處理后，先在含誘導劑如乳糖的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，由于組成型的菌株不需誘導物就能合成- 半乳糖苷酶，利用乳糖，因此它會先于誘導型開始生長，在一段時間內(nèi)，它們的菌數(shù)會增加很快。當誘導型在誘導物的誘導下合成 - 半乳糖苷酶，開始利用乳糖生長時，就將細菌全部轉入葡萄糖培養(yǎng)基中，在葡萄糖培養(yǎng)基中兩類菌同樣生長繁殖，但是組成型菌株仍能合成 - 半乳糖苷酶，而誘導型菌株的 - 半乳糖苷酶合成停止，并且酶活力逐漸喪失。這時再將全部細菌

30、轉入乳糖培養(yǎng)基，組成型菌株又獲得一次優(yōu)勢生長。如此反復多次后，組成型菌株數(shù)量大大超過誘導型菌株，然后用平板培養(yǎng)基分離出組成型菌株的單菌落。例3：顯色反應法 利用顯色反應在平板上識別組成型菌株。在不含誘導物的平板上進行培養(yǎng)，由于組成型菌株能產(chǎn)生酶，培養(yǎng)后加入適當?shù)乃a(chǎn)生的酶的底物反應。常采用經(jīng)酶解后有顏色變化的底物，以便快速檢出組成型菌落。如：用鄰硝基苯半乳糖苷來篩選 - 半乳糖苷酶組成突變型。(鄰硝基苯半乳糖苷被分解后生成黃色的硝基苯酚)如：用剛果紅來篩選纖維素酶組成突變型。（剛果紅可使纖維素酶水解纖維素露出的還原基被染上色）包括：抗生素、金屬離子、溫度、噬菌體抗生素抗性突變：提高產(chǎn)量 抗噬菌

31、體突變：消除噬菌體污染條件抗性突變：如溫度，可提高產(chǎn)量物敏突變：提高產(chǎn)量 d、抗性突變株的篩選抗性突變菌株的篩選 抗生素抗性突變株 在抗生素產(chǎn)生菌選育中，通過篩選抗生素抗性突變可提高抗生素產(chǎn)量。 抗生素抗性突變株除能提高抗生素的產(chǎn)量外，還能提高其它代謝產(chǎn)物的量。 條件抗性突變株 因環(huán)境不同，能表現(xiàn)為野生型菌株的特性和突變型菌株特性的突變稱為條件抗性突變或稱為條件致死突變。 溫度敏感突變常用于提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量 致死營養(yǎng)缺陷抗性突變菌株的篩選方法 一次性篩選法 一次性篩選法就是指在對出發(fā)菌株完全致死的環(huán)境中，一次性篩選出少量抗性變異株。 噬菌體抗性菌株 耐高溫菌株 階梯性篩選法 梯度平板法 紙片擴

32、散法 用打孔器將較厚的濾紙（如新華六號）打成小圓片，并使紙片吸收一定濃度的藥物，經(jīng)干燥或不經(jīng)干燥，放入涂布了菌懸液的平板上，一般9厘米的培養(yǎng)皿中等距放置三片為宜。經(jīng)培養(yǎng)后觀察圍繞紙片的抑菌圈，抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)的可能就是抗性菌。3、雜交育種（1）雜交育種的優(yōu)點a、通過具有不同遺傳性狀菌株的雜交，使遺傳物質(zhì)進行交換和重新組合，改變親株的遺傳物質(zhì)基礎，擴大變異范圍，使兩株的優(yōu)良性狀集中在重組體內(nèi)，獲得新品種。b、通過雜交后獲得具有新遺傳特性的重組體，不僅可克服因長期誘變造成的生活力下降，代謝緩慢等缺陷，也可以提高對誘變劑的敏感性，降低對誘變劑的疲勞效應。c、通過雜交可以總結遺傳物質(zhì)的轉移和傳遞規(guī)律，豐富

33、并促進遺傳學理論的發(fā)展。（2）雜交育種的方法微生物常規(guī)雜交形式微生物類別雜交方式供體與受體細胞關系參與交換的遺傳物質(zhì)原核微生物接合體細胞間暫時溝通部分染色體雜合轉化細胞不接觸，吸收游離DNA片段個別或少數(shù)基因雜合轉導細胞間不接觸，噬菌體介導（糾錯）個別或少數(shù)基因雜合真核微生物有性生殖生殖細胞融合或接合整套染色體高頻率重組準性生殖體細胞接合整套染色體高頻率重組4、原生質(zhì)體融合（1）原生質(zhì)體融合法的定義 原生質(zhì)體融合法是首先用酶分別酶解兩個出發(fā)菌株的細胞壁，在高滲的環(huán)境下釋放出原生質(zhì)，將它們混合，在助融劑或電場的作用下，使它們互相凝集，發(fā)生細胞融合，實現(xiàn)遺傳重組。（2）原生質(zhì)體融合法的優(yōu)越性a、受

34、接合型和致育型的限制小，兩親株沒有供體和受體之分，有利于不同種屬微生物的雜交。b、重組頻率高于其他雜交方法。c、遺傳物質(zhì)的傳遞更加充分、完善，既有核配又有質(zhì)配。d、可以用溫度、藥物、紫外線等處理純化親株的一方或雙方，然后使其融合，篩選再生重組子菌落，提高篩選效率。e、用微生物的原生質(zhì)體進行誘變，可明顯提高誘變頻率。（3）原生質(zhì)體融合法的步驟a、原生質(zhì)體制備b、原生質(zhì)體融合c、原生質(zhì)體再生d、融合子的檢出5、基因工程育種 基因工程是用人為的方法將所需的某一供體生物的遺傳物質(zhì)DNA分子提取出來，在離體的條件下進行“切割”，獲得代表某一性狀的目的基因，把該基因與作為載體的DNA分子連接起來，然后導入

35、某一受體細胞中，讓外來的目的基因在受體細胞中進行復制和表達，從而獲得目的產(chǎn)物。由于該受體細胞即包含了原有的一整套遺傳信息，同時也含有外來基因的遺傳信息，是一個自然演化中根本不存在的全新物種。攜帶人血清白蛋白基因的轉基因試管牛“滔滔”（1）基因的分離去垢劑（如SDS）溶解細胞；用酚和蛋白酶除去蛋白質(zhì)；核糖核酸酶除去RNA；乙醇沉淀。a、總DNA提?。篵、分離特定的目的基因：物理分離法；互補DNA分離法；“鳥槍法”（2）DNA分子的切割與連接（a）粘性末端連接：用同一種限制性內(nèi)切酶或者用能夠產(chǎn)生相同粘性末端的兩種限制性內(nèi)切酶分別消化外源DNA分子和載體，所形成的DNA末端彼此互補，用DNA連接酶共

36、價連接起來，形成重組體DNA分子。 （b）平頭末端連接：將平末端的DNA分子在T4DNA連接酶催化下，使DNA分子的3OH和5P進行共價結合。（c）人工接頭法：指利用人工接頭加在平端DNA片段的兩端，然后用相應限制酶切割人工接頭以產(chǎn)生黏性末端，再與帶相同黏性末端的載體相連。 （d）同源多聚尾連接法：在末端脫氧核苷酸轉移酶催化下，在線型載體分子的兩端加上單一核苷酸如dG組成的多聚尾；而在目的DNA分子的兩端加上dC尾，兩者混合退火，然后經(jīng)DNA聚合酶或Klenow填補裂口處缺失的核苷酸，再通過DNA連接酶修復成環(huán)狀的雙鏈DNA。 （3）載體a、常用的載體質(zhì)粒噬菌體黏粒單鏈噬菌體M13b、載體應具

37、備的特點（a）載體本身是一個單獨的復制子，在共價連接了外源DNA后仍能自我復制。（b）對某些限制酶只有一個切口，并在酶作用后不影響其自主繁殖能力。（c）從細菌核酸中分離和純化很容易。（d）在宿主中能以多拷貝的形式存在，有利于插入的外源基因的表達，能在宿主中穩(wěn)定地遺傳。（4）引入宿主（5）重組體的選擇和鑒定:分兩步a、先根據(jù)載體的遺傳標記等選擇出含有重組分子的細胞。b、進一步根據(jù)外源DNA的遺傳特性進行鑒定。（6）外源基因的表達影響外源基因表達的因素四、發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的退化、復壯與保藏（一）微生物菌種的退化及原因1、菌種退化 菌種退化通常指在較長時期傳代保藏后，菌株的一個或多個生理性狀和形態(tài)

38、特征逐漸減退或消失的現(xiàn)象。2、引起菌種退化的原因（1）基因突變（2）變異菌株性狀分離（廣義的退化）（3）連續(xù)傳代（4）其它因素（二）防止菌種的退化和退化菌種的復壯1、防止菌種退化的方法（1）控制傳代次數(shù)（2）選擇合適的培養(yǎng)條件（3）利用不同類型的細胞進行傳代（4）選擇合適的保藏方法2、退化菌種的復壯復壯：使衰退的菌種重新恢復原來的優(yōu)良特性稱為復壯。常用方法：對已退化菌株用一定培養(yǎng)條件進行單細胞分離純化，淘汰已退化菌落而使原菌株得以復壯。（三）菌種的保藏1、菌種保藏的意義2、菌種保藏的原理3、菌種保藏的方法（1）斜面低溫保藏法（2）石蠟油封保藏法（3）砂土管保藏法（4）冷凍干燥法（5）超低溫保藏

39、法第二節(jié) 工業(yè)微生物種子的擴大培養(yǎng) 種子擴大培養(yǎng)：是指將保存在砂土管、冷凍干燥管等中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過搖瓶或靜置培養(yǎng)及種子罐逐級放大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。 發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)過程中的種子的必須滿足以下條件： 1、菌體培養(yǎng)物總量適宜，以保證在發(fā)酵罐中有適當?shù)慕臃N量。 2、菌種的生命力旺盛，移接到發(fā)酵罐中后能迅速生長，延滯期短。 3、菌種能保持穩(wěn)定的生產(chǎn)性能，生理狀態(tài)穩(wěn)定。4、無雜菌和噬菌體污染。 一、菌種擴大培養(yǎng)的任務 菌種擴大培養(yǎng)的任務就是要為每只發(fā)酵罐的投料提供相當數(shù)量代謝旺盛的種子。二、種子制備的過程1、種子擴大培養(yǎng)的工藝流程2

40、、實驗室種子培養(yǎng) 實驗室種子培養(yǎng)階段目的是為種子罐提供種子，包括瓊脂斜面、固體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)或搖瓶液體培養(yǎng)。（1）固體斜面菌種培養(yǎng)（2）固體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)（3）搖瓶液體培養(yǎng)3、生產(chǎn)車間種子制備（1）種子罐培養(yǎng)基（2）種子罐接種 微孔接種法：利用注射器在罐的接種口橡皮膜上注入罐內(nèi)進行接種。（3）種子罐級數(shù) 種子罐級數(shù)是指制備種子需要逐級擴大培養(yǎng)的次數(shù)。 二級發(fā)酵；三級發(fā)酵細菌：生長快，種子用量比例少，級數(shù)也較少，二級發(fā)酵。 茄子瓶種子罐發(fā)酵罐 霉菌：生長較慢，如青霉菌，三級發(fā)酵。 孢子懸浮液一級種子罐（27C,40小時孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲 ）二級種子罐（ 27C,1024小時，菌體迅速繁殖，粗壯菌

41、絲體）發(fā)酵罐 放線菌：生長更慢，采用四級發(fā)酵。酵母：比細菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級種子 。確定種子罐級數(shù)需注意的問題 級數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長特性、接種量的影響； 級數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般2-4級。 在發(fā)酵產(chǎn)品的放大中，反應級數(shù)的確定是非常重要的一個方面。 種子級數(shù)越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌機會；（4）菌種的種齡 菌種的種齡是指種子罐中的培養(yǎng)物移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。種齡短：菌體太少；種齡長：易老化。原則：對數(shù)生長期，細胞活力強，菌體濃度相對較大，但是最終由實驗結果定。（5）種子罐和發(fā)酵罐的接種量雙種法：用兩只種子罐接種一只發(fā)酵罐的接種方法

42、。倒種法：從一只發(fā)酵罐中倒出適宜的，適量的發(fā)酵液給另一發(fā)酵罐做種子的方法。（5）接種量接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度。通常接種量，細菌15%，酵母菌510%，霉菌715%、有時2025%。 移入種子的體積接種量 接種后培養(yǎng)液的體積三、發(fā)酵工業(yè)種子培養(yǎng)1、種子擴大培養(yǎng)的方法靜置培養(yǎng)法（厭氣性發(fā)酵）通氣性培養(yǎng)（好氣性發(fā)酵） 作為種子擴大培養(yǎng)的方法： 表面培養(yǎng)法 固體培養(yǎng)法 液體培養(yǎng)法（三角瓶搖床震蕩或轉式培養(yǎng)） 載體培養(yǎng)法淺盤固體培養(yǎng)深層固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)法（曲法培養(yǎng)）優(yōu)點：（1）酶活力高。（2）生產(chǎn)過程中無菌程度要求不很嚴格。（3）對于固體發(fā)酵，由于產(chǎn)物濃度大，易于分離，可以有

43、效的降低產(chǎn)品分離成本。缺點：（1）生產(chǎn)勞動強度較大，占地面積大，不宜自動化生產(chǎn)。（2）周期長。（3）培養(yǎng)過程中環(huán)境條件控制較難。（4）生產(chǎn)過程中，由于無菌程度較低，其菌種不純。液體深層培養(yǎng)法優(yōu)點：（1）生產(chǎn)效率高，便于自動化管理。（2）生產(chǎn)過程中溫度、溶氧、pH值等參數(shù)可以實現(xiàn)全面控制。（3）通常生產(chǎn)液體種子，整個生產(chǎn)周期較短。缺點：（1）無菌程度要求高，相對生產(chǎn)設備投資較大。（2）對于某些種類的發(fā)酵，液體培養(yǎng)因投資大、生產(chǎn)密度大而難以實現(xiàn)。幾種深層培養(yǎng)法 放大法兩步法控制培養(yǎng)法 分批培養(yǎng)法(間歇發(fā)酵法)連續(xù)培養(yǎng)法補料分批培養(yǎng)法(流加法) 種子質(zhì)量的最終指標是考察其在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來的生產(chǎn)能

44、力。菌種穩(wěn)定性的檢查無雜菌檢查種子液生化分析項目主要有：營養(yǎng)基質(zhì)的消耗速度、pH變化、溶氧變化、色澤和氣味等。四、影響種子培養(yǎng)的因素和種子質(zhì)量的控制1、種子質(zhì)量的判斷2、種子質(zhì)量標準影響種子質(zhì)量的因素接種量種齡染菌控制培養(yǎng)基培養(yǎng)條件3、影響種子質(zhì)量的因素 主要是碳源、氮源、無機鹽、生長素和水等。糖份少而氮源多些(菌體增殖為主要目的)。與發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分相近。*培養(yǎng)基： *種齡和接種量： 溫度過低，菌種生長發(fā)育緩慢。溫度過高，會使菌絲過早自溶。濕度低，孢子生長快。濕度大，孢子生長慢。*培養(yǎng)溫度和濕度： 選擇最適種子培養(yǎng)pH的原則是獲得最大比生長速率和適當?shù)木俊Ｅ囵B(yǎng)最后一級種子的培養(yǎng)基的pH

45、應接近于發(fā)酵培養(yǎng)基的pH，以便種子能盡快適應新的環(huán)境。*pH： 溶解氧的作用：參與菌體呼吸作用攪拌：促進氧的溶解與營養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物的分散。通氣量的多少以溶解氧的多少來衡定（溶解氧濃度應不低于臨界溶氧濃度）。通氣過程中，影響溶解氧的因素：菌種（絲狀影響最大）；培養(yǎng)基性質(zhì)；培養(yǎng)階段；發(fā)酵罐的結構。*通風和攪拌： 危害：影響微生物對氧的吸收；妨礙CO2的排除；減少設備利用率（有效容積減少）；造成跑料，導致染菌；消泡方法：（1）消泡劑：天然動植物油、石油化工礦物油；改性油，表面活性劑（有機硅聚合物）；（2）機械消泡（3）改變培養(yǎng)基成分*泡沫： 染菌原因：設備、管道、閥門漏損、發(fā)酵罐結構“死角”、滅菌

46、不徹底、空氣凈化不好、無菌操作不嚴、菌種不純*染菌的控制： 種子罐級數(shù)越少，越有利于簡化工藝，便于控制，減少染菌。種子罐級數(shù)取決于： 種子的性質(zhì)（生長繁殖性能） 孢子瓶中孢子的密度（密度大則級數(shù)少） 孢子發(fā)芽及菌絲繁殖速度 發(fā)酵罐中種子的最低接種量 種子罐與發(fā)酵罐的容積比*種子罐級數(shù)的決定：4、種子異常的分析（1）菌種生長發(fā)育緩慢或過快 無菌空氣溫度低和滅菌質(zhì)量差是種子生長發(fā)育緩慢的主要原因。（2）菌絲結團原因：攪拌效果差，接種量小。危害：影響菌的呼吸和對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。（3）菌絲粘壁原因：攪拌效果不好，泡沫過多，種子裝料系數(shù)過小。危害：培養(yǎng)液菌絲濃度減少，可能形成菌絲團。第三節(jié) 種子培養(yǎng)基及

47、其制備一、菌體組成和細胞外代謝產(chǎn)物1、菌體組成2、細胞外代謝產(chǎn)物微生物的代謝產(chǎn)物可分為： 初級代謝產(chǎn)物定義：微生物通過代謝活動所產(chǎn)生的、自身生長和繁殖所必需的物質(zhì)。舉例：氨基酸、核苷酸、多糖、脂類、維生素、有機酸、蛋白質(zhì)等。特征：不同的微生物初級代謝產(chǎn)物基本相同；初級代謝產(chǎn)物合成過程是連續(xù)不斷的；與菌體的生長呈平行關系。 次級代謝產(chǎn)物定義：微生物生長到一定階段才產(chǎn)生的化學結構十分復雜、對該微生物無明顯生理功能，或并非是微生物生長和繁殖所必需的物質(zhì)。舉例：抗生素、毒素、激素、色素等。特征：不同的微生物次級代謝產(chǎn)物不同；次級代謝產(chǎn)物的通常在菌體的生長后期合成；發(fā)酵分兩個階段進行，營養(yǎng)增殖期和生產(chǎn)期

48、。在多數(shù)情況下，增加前體是有效的。兩種代謝產(chǎn)物的不同：1、次級代謝通常在生長后期合成。不是微生物生長所必需的，不參與微生物的生長和繁殖。 2、次級代謝對環(huán)境條件的變化很敏感，其產(chǎn)物的合成往往會因環(huán)境條件的變化而停止。3、不同微生物的次級代謝產(chǎn)物有很大區(qū)別?；诰N的特異性。4、催化次級代謝產(chǎn)物合成的某些酶專一性不強。3、微生物的營養(yǎng)類型碳源利用自養(yǎng)型異養(yǎng)型能量來源光能營養(yǎng)型化能營養(yǎng)型電子供體有機營養(yǎng)型無機營養(yǎng)型光能有機異養(yǎng)型光能無機自養(yǎng)型化能無機自養(yǎng)型化能有機異養(yǎng)型絕大部分微生物二、種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基選擇和配置原則1、種子培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分及來源（1）碳源物質(zhì)a、碳源物質(zhì)作用b、種子培養(yǎng)基的碳源物

49、質(zhì)：葡萄糖、糊精等核酸碳可占細胞干重的50左右蛋白質(zhì)脂質(zhì)（a）提供合成細胞結構物質(zhì)所需碳素（b）提供能源（2）氮源物質(zhì)a、氮源物質(zhì)作用核酸蛋白質(zhì)（a）提供合成細胞結構物質(zhì)所需氮素（b）碳源不足時可為某些厭氧微生物提供能源b、種子培養(yǎng)基的氮源物質(zhì)尿素、玉米漿、蛋白胨等通常有機和無機氮源聯(lián)合使用營養(yǎng)豐富吸收迅速（3）無機鹽類a、無機鹽類的作用（a）提供合成細胞結構物質(zhì)所需元素（b）作為酶的組成部分或維持酶的活性（c）調(diào)節(jié)滲透壓、pH、氧化還原電位等b、種子培養(yǎng)基所需無機鹽（a）大量元素：P、S、K、Mg、Ca等（b）微量元素：Cu、Zn、Mn、Mo、Co等（4）生長因子維生素、生物素、硫胺素、肌醇

50、等（5）水水的作用（a）細胞重量的絕大部分（b）良好的溶劑（c）各種生化反應必須在水溶液中進行2、培養(yǎng)基的類型和用途 天然培養(yǎng)基是利用動、植物或微生物體或其提取物制成的培養(yǎng)基，其化學成分還不清楚，比較復雜。缺點：成分不穩(wěn)定。 取材方便、營養(yǎng)豐富、種類多樣、配制方便、成本低廉優(yōu)點：（1）根據(jù)原料劃分a、天然培養(yǎng)基b、合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基是利用化學成分明確的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基。缺點：價格較貴，配制繁瑣。優(yōu)點：成分精確，重演性高 半合成培養(yǎng)基是既含有天然成分有含有純化學試劑的培養(yǎng)基。c、半合成培養(yǎng)基（2）根據(jù)培養(yǎng)基外觀物理狀態(tài)劃分固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基（3）根據(jù)培養(yǎng)基功能劃分 孢子

51、培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基3、培養(yǎng)基的配制原則（1）選擇適宜的營養(yǎng)物質(zhì)（2）營養(yǎng)物質(zhì)濃度及配比合適氮源不足：菌體生長過于緩慢。碳源不足：菌體衰老和自溶。高濃度糖類物質(zhì)和無機鹽等有抑菌和殺菌作用。 營養(yǎng)物質(zhì)間的濃度配比直接影響微生物的生長繁殖，其中碳氮比（C/N）尤其重要。（3）選擇合適的pH（4）氧化還原電位 厭氧菌的培養(yǎng)基中往往要加入還原劑來降低氧化還原電位。 微生物的正常生長均需要合適的pH，一般霉菌和酵母菌比較適于微酸性環(huán)境，放線菌和細菌適于中性或微堿性環(huán)境。4、培養(yǎng)基成分配比的選擇（1）種子培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基一般要求營養(yǎng)成分適當豐富和完全些，尤其是氮源的含量應該較高。（即C/N比值低） 營養(yǎng)缺

52、陷型菌株應添加生長因子。 培養(yǎng)基的成分必須是一些容易被菌體直接吸收利用的物質(zhì)，保證其旺盛生長。 種子罐種子還要考慮和發(fā)酵罐培養(yǎng)基盡量接近。（2）孢子培養(yǎng)基 營養(yǎng)不能太豐富，碳、氮源不宜過多，特別是有機氮源要低，否則不易形成孢子。 無機鹽的濃度要適當，否則會影響孢子的顏色和孢子的數(shù)量。發(fā)酵工程的流程空氣空氣凈化處理保藏菌種斜面活化擴大培養(yǎng)種子罐發(fā)酵罐培養(yǎng)基制備滅菌滅菌產(chǎn)物分離純化成品原料預處理第一節(jié) 發(fā)酵工業(yè)原料的種類和成分第二節(jié) 淀粉水解糖的制備第三節(jié) 發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌第三章 發(fā)酵工業(yè)原料及其處理 發(fā)酵培養(yǎng)基是要求最嚴格的培養(yǎng)基，它具有雙重任務，一是供菌體生長繁殖，二是使菌種能夠大量產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)品

53、。 因此,發(fā)酵培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分即要豐富和完全，有要求嚴格控制，尤其是那些對發(fā)酵產(chǎn)物的形成有嚴重影響的成分。發(fā)酵培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分除碳源、氮源、無機鹽、生長因子及水等物質(zhì)外，還要有前體、促進劑和抑制劑等物質(zhì)。第一節(jié) 發(fā)酵工業(yè)原料的種類和成分一、發(fā)酵培養(yǎng)基中各種成分的定量及原料1、碳源物質(zhì)一、發(fā)酵培養(yǎng)基中各種成分的定量及原料第一節(jié) 發(fā)酵工業(yè)原料的種類和成分（1）碳源物質(zhì)作用 a、提供合成細胞物質(zhì)所需碳素b、提供能源（生長及合成產(chǎn)物）c、提供目的產(chǎn)物中的碳（2）碳源物質(zhì) 淀粉、淀粉水解糖、糖蜜、有機酸、低碳醇、脂類、烴類（3）工業(yè)上常用作碳源的淀粉質(zhì)原料a、淀粉的性質(zhì)不同產(chǎn)地甘薯的淀粉顆粒b、淀粉質(zhì)原

54、料（a）工業(yè)淀粉谷類淀粉：結構致密、顆粒較小薯類淀粉：結構疏松，顆粒較大常用工業(yè)淀粉：玉米淀粉、小麥淀粉、甘薯淀粉、馬鈴薯淀粉（b）谷類（c）薯類2、氮源物質(zhì) a、提供合成細胞物質(zhì)所需氮素。（1）氮源物質(zhì)作用b、碳源不足時可為某些厭氧微生物提供能源c、如果目的產(chǎn)物有氮素存在要提供目的產(chǎn)物所需氮素。（2）氮源物質(zhì)黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、蛋白胨、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉、發(fā)酵菌絲、酒糟等。有機氮源： 無機氮源：氨水、液氨、尿素、硝酸鹽、銨鹽（3）工業(yè)上常用做氮源的蛋白質(zhì)類原料黃豆餅粉：抗生素玉米漿：用量0.40.8蛋白胨酵母粉蠶蛹粉：制霉菌素3、無機鹽（1）發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機鹽a、磷酸鹽

55、（a）作用I、提供某些蛋白質(zhì)、核酸、ADP、ATP所需磷元素II、緩沖作用（b）工業(yè)常用磷酸鹽K3PO43H2O、K3PO4、Na2HPO412H2O 、NaH2PO42H2Ob、硫酸鎂（a）作用I、提供酶的激活劑鎂元素II、為菌體提供合成含硫蛋白的硫源（b）工業(yè)需要量MgSO47H2O：0.251g/Lc、鉀鹽（a）作用I、維持細胞一定滲透壓和細胞透性II、是某些酶的激活劑（b）工業(yè)常用鉀鹽微生物需要鉀量以K2SO4計0.1g/L如果培養(yǎng)基磷酸鹽用K3PO43H2O或K3PO4鉀鹽就足夠。如用Na2HPO412H2O 或NaH2PO42H2O需要配用0.30.6g/L的KCl（2）培養(yǎng)基中無

56、機鹽的濃度能直接結合到產(chǎn)物中，而自身結構沒有多大變化，但是產(chǎn)物產(chǎn)量卻有較大提高。青霉素生產(chǎn)中，加入玉米漿，產(chǎn)量增加，原因是玉米漿含有苯乙胺，被優(yōu)先結合到青霉素分子中去。有些前體濃度過高時對菌體有毒性。此外，菌體還能分解前體，且前體相對價格較高，添加過多，容易引起揮發(fā)和氧化，因此常采用少量多次地加入。青霉素：分子量356苯乙酸:分子量1364、前體4、前體促進劑 指那些既不是營養(yǎng)物又不是前體，但卻能提高產(chǎn)量的添加劑。 例如：加巴比妥鹽能使利福霉素單位增加，并能使鏈霉菌推遲自溶，延長分泌期。加酵母甘露聚糖可誘導甘露糖苷酶的產(chǎn)生，促使甘露糖鏈霉素轉化為鏈霉素?？刂粕锼氐募尤肓?，可以促進谷氨酸從細胞

57、內(nèi)分泌到細胞外。加聚乙烯醇衍生物可防止菌絲結球，提高糖化酶的產(chǎn)量。5、促進劑、抑制劑抑制劑會抑制某些代謝途徑的進行，同時會使另一代謝途徑活躍，從而獲得人們所需的某種產(chǎn)物，或使正常代謝的某一代謝中間物積累起來。例如：微生物發(fā)酵生產(chǎn)甘油，在發(fā)酵液中加入亞硫酸氫鈉，它與代謝中產(chǎn)生的乙醛生成加成物，使乙醇的產(chǎn)生受阻，亞硫酸鹽是乙醇代謝的抑制劑，促使甘油形成。溴化劑能抑制金霉素形成的代謝途徑，促使四環(huán)素的生成。5、促進劑、抑制劑大多數(shù)微生物不能直接利用淀粉（所有的氨基酸生產(chǎn)菌不能直接利用）。有些微生物能夠直接利用淀粉作原料，但必須在微生物產(chǎn)生淀粉酶后才能進行，過程緩慢，發(fā)酵周期延長。若直接利用淀粉作原料

58、，滅菌過程的高溫會導致淀粉結塊，發(fā)酵液粘度劇增。因此，在發(fā)酵生產(chǎn)之前，必須將淀粉水解為葡萄糖，才能供發(fā)酵使用。在工業(yè)生產(chǎn)中，將淀粉水解為葡萄糖的過程稱淀粉的糖化，制得的溶液叫淀粉水解糖。第二節(jié) 淀粉水解糖的制備淀粉水解糖的制備方法及原理淀粉水解的過程淀粉吸水膨脹 糊化 -淀粉酶 或酸 液化 糊精 糖化酶或酸低聚糖 麥芽糖 葡萄糖（由7-12個葡萄糖殘基組成） 3-6個 2個 1 淀粉水解糖的制備方法及原理酸解法酶解法酸酶結合法原料：薯類、玉米、小麥、大米等原料淀粉的性質(zhì)和水解使用的催化劑的不同第二節(jié) 淀粉水解糖的制備一、酸水解法 酸水解法是以酸（無機酸或有機酸）為催化劑，在高溫高壓下將淀粉水解

59、為葡萄糖的方法。1、酸水解法的原理 淀粉在高溫加酸作用下，首先是顆粒結晶結構被破壞，然后酸作用于-1,4糖苷鍵及-1,6糖苷鍵，使之斷裂，水解前者的速度要快于后者。水解過程：總反應式： (C6H10O5)n+nH2O nC6H12O6過程：(C6H10O5)n (C6H10O5)x C12H22O11 C6H12O6 淀粉 糊精 麥芽糖 葡萄糖 H+對作用點無選擇性，-1,4-糖苷鍵和-1,6-糖苷鍵均被切斷。 H+對淀粉的糖苷鍵作用沒有一定順序，糖鏈的斷裂不規(guī)則，同時生成糊精，低聚糖，麥芽糖和葡萄糖。 隨著水解進行，葡萄糖，麥芽糖等還原性糖越來越多，當葡萄糖值60后，葡萄糖復合與分解反應明顯

60、，會產(chǎn)生其它有味物質(zhì)（如苦的龍膽二糖）以及色澤加深。 淀粉 葡萄糖 復合二糖 5羥甲基糠醛 復合低聚糖 有機酸、有色物質(zhì) 在淀粉的酸水解過程中，三種反應同時發(fā)生復合反應分解反應鹽酸副反應酸解法 不利影響：復合反應：生成的多數(shù)復合糖不能被微生物利用，使發(fā)酵結束時殘?zhí)歉?。分解反應：生成?羥甲基糠醛是產(chǎn)生色素的根源，增加了糖化液精制脫色的困難?？偅航档土似咸烟堑氖章省＝o產(chǎn)物的提取和糖化液的精制帶來困難。酸解法如何控制分解反應和復合反應的發(fā)生？ 淀粉乳濃度 酸濃度 不能過高 溫度酸解法工藝流程 原料（淀粉、水、鹽酸）調(diào)漿通蒸汽糖化冷卻中和（Na2CO3)、脫色（活性碳）過濾除雜糖液 2、淀粉酸水解法