質(zhì)粒DNA的提取及檢測實(shí)驗(yàn)二課件

1、實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒DNA的提取及檢測實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 學(xué)習(xí)堿裂解法提取質(zhì)粒的原理和方法。2 學(xué)習(xí)DNA瓊脂糖凝膠電泳的原理和方法。菌種接種根據(jù)所選擇的熒光蛋白基因的菌種進(jìn)行接種：DH5-pEGFP-N3（綠色）卡那霉素抗性DH5-pDsRed1-N1 （紅色）卡那霉素抗性DH5-pET- 28a （表達(dá)載體）卡那霉素抗性接入LB液體培養(yǎng)基6ml+12l (20mg/ml)kana 另每組配制200mlLB (Kana) 固體培養(yǎng)基 ， 倒10個(gè)平板。一、實(shí)驗(yàn)原理分離質(zhì)粒DNA的方法一般包括三個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增 收集和裂解細(xì)菌 分離和純化質(zhì)粒DNA一、 實(shí)驗(yàn)原理（堿裂解法）溶液 ：50mmol/

2、L 葡萄糖， 10mmol/ EDTA-Na， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 溶液 ：0.4mol/L NaOH ， 2% SDS 臨用前1：1配制。溶液 ：5mol/L 醋酸鉀 60ml 冰醋酸 11.5ml 雙蒸水 28.5ml作用：分散細(xì)胞，螯合金屬離子使酶失活，防止DNA的降解作用：細(xì)胞在NaOH和SDS溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與染色體DNA發(fā)生變性作用：酸性條件上質(zhì)粒DNA復(fù)性，留在上清液。大腸桿菌DNA和蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等發(fā)生沉淀二、實(shí)驗(yàn)用品1、儀器 恒溫?fù)u床，高壓滅菌鍋，超凈工作臺(tái)， 10、100、1000L微量移液器各一支， 臺(tái)式高速離心機(jī)，制冰機(jī)，混合漩

3、渦器。臺(tái)式高速離心機(jī)制冰機(jī)微量移液器漩渦混合器二、實(shí)驗(yàn)用品2、材料：事先培養(yǎng)好的含三種質(zhì)粒菌液1.5ml塑料離心管EP管架微量取液器和取液器吸頭常用玻璃器皿（如三角瓶、量筒、試劑瓶等） 二、實(shí)驗(yàn)用品3、試劑LB培養(yǎng)液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g，瓊脂（固體培養(yǎng)基）15g，用 1N NaOH調(diào)pH 7.5。溶液 ，溶液 ，溶液 卡那霉素(20mg/mL)，工作濃度40g/ml抽提液（飽和酚：氯仿：異戊醇=25：24：1 ） 作用：氯仿可使蛋白質(zhì)變性，有助于液相與有機(jī)相的分離。平衡酚密度大，可是DNA在上清中。異戊醇防止抽提液

4、起泡。無水乙醇 作用：除去DNA水化層，使DNA沉淀。70%乙醇 作用：純化質(zhì)粒DNA。含RNA酶的ddH2O 作用：溶解DNA三、實(shí)驗(yàn)步驟（1）將帶有質(zhì)粒pET-28a和pEGFP-N3的大腸桿菌接種在液體培養(yǎng)基中（加卡那霉素40g/mL），370C培養(yǎng)過夜。取培養(yǎng)菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm2min，棄上清液。加入100L溶液I，漩渦器上充分混勻，在室溫下放置10 min。 加入200L新配制的溶液，輕輕翻轉(zhuǎn)23次，使之混勻，冰上放置5 min。 三、實(shí)驗(yàn)步驟（2）加入150L冰冷的溶液，加蓋后溫和顛倒數(shù)次使混勻，產(chǎn)生白色絮狀物，冰上放置15 min。 100

5、00rpm 5 min，取上清液于另一干凈的離心管中。向上清液中加入等體積（約400L）酚/氯仿/異戊醇（25:24:1，v/v），振蕩混勻，10000rpm 10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。 加入等體積（約370L）氯仿/異戊醇（24:1），混勻，離心2min ,取上清液于新離心管中 三、實(shí)驗(yàn)步驟（3）向上清液加入2倍體積無水乙醇，混勻， -200C放置30min。12000rpm 5 min，倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。 加0.8mL70%乙醇，離心1 min，倒去上清液，真空抽干或室溫自然干燥30min。 加30L ddH2O ，-200C保存?zhèn)溆谩Ｋ摹?注意

6、事項(xiàng) 1）飽和酚（取下層）單獨(dú)吸，氯仿：異戊醇（24：1）吸。 2）制備質(zhì)粒過程中，所有操作必須緩和，不要?jiǎng)×艺袷帲ㄌ貏e是加入溶液II 和III ），以避免機(jī)械剪切力對(duì)DNA的斷裂作用。 3）在取各種試劑的過程中，一定注意移液器吸頭的更換，避免污染。1.2 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測 電泳：帶電荷的物質(zhì)，在電場中的趨向運(yùn)動(dòng)稱為電泳。 DNA的瓊脂糖凝膠電泳可以分離長度為200bp至近50kb的DNA分子。 DNA的遷移率（U）的對(duì)數(shù)與凝膠濃度（T）之間存在反平行線性關(guān)系。因此，要有效地分離不同大小的DNA片段，選用適當(dāng)?shù)沫傊悄z濃度是非常重要的。一 實(shí)驗(yàn)原理一 實(shí)驗(yàn)原理 在質(zhì)粒提取的過程中，由

7、于操作原因，提取的質(zhì)粒可能有三種：線性DNA、開環(huán)DNA 、閉環(huán)超螺旋DNA 。 當(dāng)提取的質(zhì)粒DNA電泳時(shí),同一質(zhì)粒 DNA泳動(dòng)速度：閉環(huán)超螺旋線狀開環(huán)。 但有時(shí)也有也會(huì)出現(xiàn)相反情況，因?yàn)榕c瓊脂糖濃度、電流強(qiáng)度、離子強(qiáng)度及核酸染料含量有關(guān)。 1、儀器 電泳儀，電泳槽，樣品槽模板（梳子），有機(jī)玻璃內(nèi)槽，水平儀，取液器，微波爐，凝膠成像系統(tǒng)。 二、實(shí)驗(yàn)用品凝膠電泳系統(tǒng)凝膠成像系統(tǒng)二、實(shí)驗(yàn)用品2、材料： 提取的質(zhì)粒溶液 ，瓊脂糖，錐形瓶，一次性手套，膠鏟，封口膜，剪刀，取液器吸頭。3、試劑： Gold view（DNA染料） 0.5TAE緩沖液 上樣緩沖液（6） 三、實(shí)驗(yàn)步驟1、瓊脂糖凝膠板的制備 稱取0.3g瓊脂糖，置于錐形瓶中，加入30mL1TAE緩沖液，微波爐加熱直至瓊脂糖溶解。 待膠液冷卻到650C（不燙手為宜），加入1L Gold view混勻，攪拌器上攪拌排除氣泡，（如右圖）緩慢倒入事先準(zhǔn)備的制膠有機(jī)玻璃槽（插入樣品槽模板梳子 ）內(nèi) 。靜置30min左右，輕輕晃動(dòng)拔出梳子。三、實(shí)驗(yàn)步驟2、加樣 膠板放入電泳槽中（樣品孔位于負(fù)極），注入1TAE緩沖液淹沒過膠板1mm，用取液器將提取的質(zhì)粒DNA5L與1L Loading Buffer（ 6 ）混勻，加入膠板的樣品小槽內(nèi)。3、電泳