藥物分析課件第16章藥品質(zhì)量控制中現(xiàn)代分析方法與技術(shù)

1、基本要求一、熟悉毛細管氣相色譜法、手性藥物的高效液相色譜法的基本內(nèi)容及其在藥物分析中的應用。二、熟悉核磁共振光譜分析法的定量方法及其在藥物分析中的應用。三了解毛細管電泳分析法、紅外光譜法、聯(lián)用技術(shù)在藥物分析中的應用。返 回 毛細管氣相色譜法使用的色譜柱是空心的毛細管柱，叫開管柱：固定液涂漬或固定化在柱管內(nèi)壁上，而載氣和其中的樣品從中心的通道上通過。柱材料主要是熔融石英（FSOT）。一、高分辨氣相色譜法（一）色譜柱mm 560m 0.11.0m 壁涂開管柱 多孔層開管柱 擔體涂漬開管柱 微內(nèi)徑開管柱 100mmm 1m或5m2毛細管柱的選擇常用的固定液有：SE-31、OV-1、SE-54、SE-

2、52、OV-1701、Carbowax 20M。柱的選擇：根據(jù)樣品組分的沸點，一般地，相差2或2以上的組分，采用非極性毛細管柱分離；若沸點相差在2以內(nèi)的組分，則需在極性較大的毛細管柱上分離。 3毛細管柱的性能評價評價指標：分離效率、表面惰性、熱穩(wěn)定性。評價方法：在一定的色譜條件下，分離各種測試物質(zhì)，獲得的特征性數(shù)據(jù)和峰對稱性，以此來評價柱效和表面活性。在測定了柱效和表面活性之后，用流失速率試驗來評價熱穩(wěn)定性。（二）進樣方式 分流進樣：使用方便，對分流比、進樣溫度 樣品和載氣的情況、進樣體積和 濃度、進樣重復性需要注意。 不適于痕量分析和寬沸程樣。 適合大多數(shù)類型的樣品，樣品濃 濃高、各組分的濃

3、度相近不分流進樣：須利用溶劑效應或冷阱，操作較難 特別適用于痕量分析和寬沸程樣品柱頭進樣mm的 細針，柱內(nèi)徑必須大于0.32 mm , 不能通過隔墊進樣，緩慢進樣 對熱不穩(wěn)定、稀的和寬沸程樣品較 理想；能給出定量結(jié)果 非揮發(fā)物在柱的中積累導致柱變性 和柱效損失 直接進樣：樣品無須事先濃縮，進樣器溫度可較 低，載氣消耗量小，分析所需樣量小 適用于濃度范圍要比不分流進樣寬一個 數(shù)量級以上的樣品，有利于對熱不穩(wěn)定 的樣品；當樣品中含有揮發(fā)性低的組分 時，難于定量分析 （三）應用示例-人尿中勞拉西泮的檢測1.測定意義：勞拉西泮(簡稱LRZ)上用為催眠、鎮(zhèn)靜和抗癲癇藥物 ,常被犯罪分子作為麻醉藥物用于麻

4、醉搶劫等麻醉后犯罪。為了確證這類案件的性質(zhì) ,經(jīng)常需要對受害人的血、尿等體液中麻醉藥物或其代謝物進行檢測。人體攝入該藥后其血液中藥物濃度較低 ,且犯罪分子所用藥量一般不使受害人死亡,而且此類案件一般報案較遲，因此血中藥物濃度較低 ,對其檢測較為困難。該藥主要以葡萄糖醛酸苷的形式由尿液排泄。 2.色譜條件：HP-5mm ,min),進樣口溫度:280,柱溫:200(1min)20/min280 (15min),ml/min),尾吹氣為高純氮(10ml/min)。3.樣品預處理-酶解及萃取 取檢尿1ml,加10mg/L的羥乙基氟西泮(HEF)標準工作液10l,再加的乙酸鹽緩沖液 50l及-l,置于

5、55水浴中水解4冷至室溫后加 ml及乙醚5ml,渦旋2min,離心,分取上層有機相4mlml,ml,進樣1l進行GC分析 4.方法學評價（1)選擇性: 空白尿1ml及空白尿1ml加LRZ和HEF標準液,經(jīng)酶解、萃取后進樣分析所得色譜圖表明尿中雜質(zhì)不干擾檢測.（2)線性試驗: 用空白尿配制不同濃度的LRZ標準液進行酶解、萃取、進樣分析,將LRZ與HEF色譜峰面積的比值與LRZ在尿液中的質(zhì)量濃度進行線性回歸,得到工作曲線方程 :Y=3.110-3X 3.010 -3 , =0.998。LRZ在尿中的濃度為50500g/L范圍內(nèi)呈良好的線性.（3)萃取液的選擇及萃取率:作者進行了多種溶劑萃取 LRZ

6、的研究 ,由經(jīng)萃取與未經(jīng)萃取所得色譜峰面積 比計算LRZ的萃取率 ,得(meanSD)為(83.43.1)%。（4）檢出限:以3倍信噪比計算檢出限 ,得本法的檢出 限為5g/L。（5)回收率:由工作曲線計算LRZ的質(zhì)量濃度及其回收 率 ,得(meanSD)為(103.35.1)%。5.尿液檢測:志愿者口服LRZ 2后,于32小時內(nèi)收集其排泄的尿液進行檢測 ,LRZ于9h達尿中最高濃度為444/L,檢測結(jié)果表明 ,本方法適合于麻醉后犯罪案件中的檢測要求。返 回二、手性藥物的高效液相色譜法（一）手性藥物拆分機理 為了使對映體轉(zhuǎn)化為化學和物理性質(zhì)不同的非對映體，就要提供一種手性源，使待拆分的對映異構(gòu)

7、體（樣品）、手性作用物（如固定相）和手性源之間形成一個非對映異構(gòu)分子的絡(luò)合物。在對映體拆分理論中頗為流行的是“三點手性識別模式”。（二）手性HPLC拆分法的類型直接法：柱前手性衍生化法間接法：手性流動相拆分法、手性固定相拆分法1柱前手性衍生化法：對映體混合物以手性試劑作柱前衍生化，形成非對映體，然后以常規(guī)（偶見手性）固定相分離。對手性衍生化試劑的要求：高光學純度。常用的手性衍生化試劑：羧酸衍生物類、胺類、異硫氰酸酯類、異氰酸酯類、萘衍生物類、光學活性氨基酸類、固相衍生化試劑。2手性流動相拆分法（手性洗脫法或手性流動相添加劑法）：將手性試劑加入流動相中，手性添加劑與樣品形成手性絡(luò)合物。常用的手性

8、添加劑：配基交換型手性添加劑、環(huán)糊精類添加劑、手性離子對絡(luò)合劑3手性固定相拆分法：將手性選擇器（如手性流動相添加劑）固著于多種基質(zhì)上而制成手性固定相。迄今為止，尚沒有一種通用型的手性柱，需要根據(jù)化合物的分子結(jié)構(gòu)來選擇合適的手性柱。常用的手性固定相：Pirkle型手性固定相、蛋白質(zhì)類手性固定相、環(huán)糊精類手性固定相。（三）應用1對某些手性藥物進行對映體的純度檢查；2生物體液中藥物對映體的分離分析研究可探 索血藥濃度與臨床療效的關(guān)系；3在研制手性藥物過程中，可分別評價單個對 映體的效價、毒性、不良反應、藥動學性質(zhì)；4必要時，可進行手性藥物對映體的制備分離 （或拆分）。 示例一、左旋吡喹酮中吡喹胺的檢

9、查（柱前手性衍生化法）手性衍生化試劑：乙酰葡萄糖異硫氰酸酯色譜條件：色譜柱 NOVA-Pack C18（150mm3.9mm） mol/L磷酸二氫鉀 （pH2.8）（5149） 該法所用的手性衍生化試劑可以與一級胺、二級胺在溫和的條件下迅速反應，所生成的非對映體衍生物可以在普通色譜系統(tǒng)中進行分離分析。示例二、DL-色氨酸的拆分（手性流動相拆分法）色譜條件：色譜柱 Zorbax ODS（250mm4.6mm），流動相 含有0.15%L-苯丙氨酸及0.11%硫酸銅（CuSO45H2O）mol/L硫酸調(diào)pH至3.0）-甲醇（91）（流動相中L-mol/Lmol/L）。 流動相中L-苯丙氨酸為配基交換

10、型手性添加劑，硫酸銅為二價金屬螯離子，L-苯丙氨酸與銅離子螯合，分布于流動相中，遇到色氨酸對映體，共同形成配位絡(luò)合物對，然后在反相柱上拆分。示例三、克侖特羅對映體的拆分（手性固定相拆分法）色譜條件：色譜柱 Chirex 3005手性色譜柱 （R）-1-萘基甘氨酸和3，5-二硝基 苯甲酸以共價鍵結(jié)合流動相 正己烷-二氯乙烷-甲醇該法的拆分機理為“三點手性識別模式”。返 回三、核磁共振光譜分析法 核磁共振光譜廣泛用于化合物的結(jié)構(gòu)分析，而其在化合物的定量分析中的應用則是比較新的內(nèi)容，日益受到重視。1定量參數(shù)：峰面積或峰高。2定量的特點：1）對于確定的核（質(zhì)子），其信號強度與產(chǎn)生該信號的核（質(zhì)子）的數(shù)目成正比，而與核的化學性質(zhì)無關(guān)。2）利用內(nèi)標法或相對比較法分析混合物中某一化合物時，物需該化合物的純品作為對照標準。3）峰很窄，遠小于各化合物之間的化學位移的差值，因而混合物中不同組分的信號之間很少發(fā)生明顯的重疊。4）方法簡單快速、準確、專屬性高，不破壞被測樣品，可選擇性的測定混合藥物或藥物制劑中的組分乃至藥物的立體異構(gòu)體。3測定方法：選擇一個合適的峰作為測量峰。（1）內(nèi)標法（絕對測量法） 內(nèi)標法為NMR定量分析最常用的方法，它與GC的內(nèi)標法相似，在樣品溶液中，直接加入一定量內(nèi)標物質(zhì)后，NMR光譜測定，將樣品指定基團上的質(zhì)子引起的共振峰面積進行比較，當樣