血必凈注射液在膿毒癥治療中作用及其機(jī)制探討

1、血必凈注射液在膿毒癥治療中作用及其機(jī)制探討研 究 背 景 膿毒癥(Sepsis)是嚴(yán)重創(chuàng)(燒、戰(zhàn))傷傷員常見并發(fā)癥，進(jìn)一步發(fā)展可致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征，是危重傷員最主要死亡原因。嚴(yán)重膿毒癥來勢兇猛、預(yù)后險惡，救治困難，已成為現(xiàn)代戰(zhàn)傷外科和危重病醫(yī)學(xué)面臨的突出難題。膿毒癥 新世紀(jì)對人類健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重大挑戰(zhàn)全球性的威脅和挑戰(zhàn)，患病率約為人口的 3/1000 ，全球總病例數(shù)約1800萬/年，我國300400萬/年。 全世界死亡人數(shù) 1.4萬/天，ICU 死亡的主要原因。在美國平均治療費用約 $2.2萬/例，年耗資近 $200億；歐洲年耗資近$100億；發(fā)病人數(shù)以年1.5比例增長；過去

2、10年間，增加病例139%。膿毒癥與急性心梗死亡率變化的比較1960年 1995年10%20%30%40%50%膿毒癥急性心梗研 究 背 景 盡管膿毒癥新概念與臨床特征的認(rèn)識有所進(jìn)步，但膿毒癥臨床試驗性治療相繼失敗，病死率仍居高不下。究其原因，關(guān)鍵是膿毒癥的根本發(fā)病環(huán)節(jié)及作用機(jī)制尚未充分闡明，缺乏早期有效的預(yù)防與治療措施。因此，開展其研究具有極其重要的理論意義和實用價值。發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且未完全闡明Systemic InflammationCoagulationImpaired FibrinolysisImmunoparalysis 經(jīng)過多年的臨床實踐，我們認(rèn)為利用中藥多組分、多途徑、多靶點協(xié)同效

3、應(yīng)可以在膿毒癥治療中發(fā)揮獨特作用。深入探討中藥血必凈注射液對膿毒癥的作用機(jī)理，明確其詳細(xì)干預(yù)途徑和影響環(huán)節(jié)具有重要理論意義和實用價值，它將進(jìn)一步提高我國中藥防治膿毒癥的水平。 問 題 的 提 出血必凈對膿毒癥大鼠死亡率的影響，進(jìn)一步明確其對膿毒癥動物預(yù)后的改善效果。血必凈對膿毒癥大鼠多器官功能的保護(hù)作用，驗證其保護(hù)主要靶器官或系統(tǒng)，為臨床應(yīng)用提供重要實驗依據(jù)。血必凈對凝血、免疫系統(tǒng)可能的影響及其機(jī)制研究，闡明其作用的多靶點、多環(huán)節(jié)效應(yīng)。血必凈對膿毒癥大鼠早、晚期細(xì)胞因子蛋白/基因表達(dá)的影響，闡明其作用的核心靶分子及其分子機(jī)理。血必凈作用的可能相關(guān)受體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究，提示其對細(xì)胞內(nèi)信號通路調(diào)

4、節(jié)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為血必凈功效的進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用開辟新途徑。主要研究內(nèi)容技術(shù)路線和試驗方案 “血必凈”對膿毒癥大鼠死亡率的影響（包括量-效關(guān)系和時-效關(guān)系觀察），進(jìn)一步明確“血必凈”對膿毒癥動物預(yù)后的改善效果。 大鼠分為8組（每組30只動物，共250300只大鼠）：正常對照組、膿毒癥組（采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)造成膿毒癥模型）、不同時間治療組（3個亞組：預(yù)先給藥、膿毒癥后2h、12h膿毒癥）、不同治療劑量組（3個亞組：低、中、高劑量組），觀察7天動物死亡率。1技術(shù)路線和試驗方案 “血必凈”對膿毒癥大鼠多器官功能保護(hù)作用（包括量-效關(guān)系和時-效關(guān)系），驗證其保護(hù)的靶器官或系統(tǒng)，為臨床應(yīng)用提供重要實驗依據(jù)。

5、 基本設(shè)計同上，大鼠分為8組（每組分兩個時間點處死動物、每亞組10只動物，共160200只大鼠）：檢測肝功、腎功、心肌酶譜、小腸二胺氧化酶（DAO）和血氣分析、肺組織髓過氧化物酶（MPO）活性等功能指標(biāo)改變（同時在光鏡、電鏡下觀察病理形態(tài)學(xué)改變）。 2技術(shù)路線和實驗方案 “血必凈”對膿毒癥大鼠早、晚期細(xì)胞因子蛋白/基因表達(dá)的影響 早期細(xì)胞因子包括腫瘤壞死因子（TNF）-、白介素-10（IL-10）；晚期細(xì)胞因子包括高遷移率族蛋白B1（HMGB1）等，闡明其作用的核心靶分子及其分子機(jī)理。 根據(jù)第1、2部分結(jié)果找出最佳給藥劑量和治療時間點來設(shè)計本組實驗（觀察時間設(shè)計4個不同時相點即可，每時相點10

6、只動物，共100120只大鼠）；實驗分為正常對照組、假手術(shù)組、膿毒癥組（4個亞組）和治療組（4個亞組），分別處死動物檢測血清和肝、肺、腎、腸、心肌組織早、晚期細(xì)胞因子蛋白/基因表達(dá)改變。3技術(shù)路線和試驗方案 “血必凈”作用的可能炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究，揭示其對細(xì)胞內(nèi)信號通路調(diào)節(jié)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為“血必凈”功效的進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用開辟新途徑。 主要探討其對絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）系統(tǒng)（包括ERK、JNK、p38信號通路）和NF-B通路的影響；實驗方法基本同第3部分，主要檢測5種器官ERK、JNK、p38磷酸化/非磷酸化活性、核因子-B（NF-B）活性改變。4技術(shù)路線和試驗方案 “血必凈”對細(xì)胞免疫

7、系統(tǒng)的可能影響及其機(jī)制研究，闡明其對膿毒癥免疫系統(tǒng)作用的多層次、多環(huán)節(jié)效應(yīng)。 主要觀察對淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、白介素-2(IL-2) /IL-2受體表達(dá)、淋巴細(xì)胞功能極化(Th1/Th2)、淋巴細(xì)胞相關(guān)信號途徑（NF-AT、AP-1）、單核/巨噬細(xì)胞Ia/e表達(dá)改變的影響。同時，進(jìn)一步探討其對樹突狀細(xì)胞（DC）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的調(diào)控效應(yīng)。5技 術(shù) 路 線（舉例）血必凈對內(nèi)毒素刺激大/小鼠脾臟T細(xì)胞、DC、巨噬細(xì)胞的影響體外實驗用內(nèi)毒素攻擊大/小鼠后分離脾臟T細(xì)胞、DC、巨噬細(xì)胞；不同劑量血必凈對膿毒癥動物免疫系統(tǒng)的可能作用 體內(nèi)實驗動物實驗血必凈對用內(nèi)毒素誘導(dǎo)分離人外周血T細(xì)胞、DC、單核細(xì)胞的作用離體研究血必凈治療對膿毒癥患者外周血T細(xì)胞、DC、單核細(xì)胞免疫功能紊亂的干預(yù)效果在體研究臨床研究體外實驗血必凈對DC分化成熟的影響DC受體的檢測DC對T淋巴細(xì)胞免疫的影響CD83、CD86、 I-A/E的表達(dá)IL-12、TNF-a基因/蛋白的表達(dá)抗原遞呈功能RAGE的表達(dá)用RAGE抗體觀察血必凈處理前后內(nèi)毒素誘導(dǎo)DC的分化成熟情況淋巴細(xì)胞增殖Th1/Th2漂移IL-2和IL-2R的表達(dá)NFAT和AP-1活性血必凈與DC/T細(xì)胞研究部分舉例技術(shù)路線和試驗方案 “血必凈”對凝血、纖溶系統(tǒng)的可能影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制研究，明確其對膿毒癥時DIC途徑的