固相萃取基本原理及操作

1、-. z.一、固相萃取根本原理與操作1、固相萃取吸附劑與目標化合物之間的作用機理固相萃取主要通過目標物與吸附劑之間的以下作用力來保存/吸附的1疏水作用力：如C18、C8、Silica、苯基柱等2離子交換作用：SA*, SC*，COOH、NH2等3物理吸附：Florsil、 Alumina等2、p H值對固相萃取的影響pH值可以改變目標物/吸附劑的離子化或質(zhì)子化程度。對于強陽/陰離子交換柱來講，因為吸附劑本身是完全離子化的狀態(tài)，目標物必須完全離子化才可以保證其被吸附劑完全吸附保存。而目標物的離子化程度則與pH值有關。如對于弱堿性化合物來講，其pH值必須小于其pKa值兩個單位才可以保證目標物完全離

2、子化，而對于弱酸性化合物，其pH值必須大于其pKa值兩個單位才能保證其完全離子化。對于弱陰/陽離子交換柱來講，必須要保證吸附劑完全離子化才保證目標物的完全吸附，而溶液的pH值必須滿足一定的條件才能保證其完全離子化。3、固相萃取操作步驟及考前須知針對填料保存機理的不同填料保存目標化合物或保存雜質(zhì)，操作稍有不同。1填料保存目標化合物固相萃取操作一般有四步見圖1： 活化- 除去小柱內(nèi)的雜質(zhì)并創(chuàng)造一定的溶劑環(huán)境。注意整個過程不要使小柱干涸 上樣- 將樣品用一定的溶劑溶解，轉(zhuǎn)移入柱并使組分保存在柱上。注意流速不要過快，以1ml/min為宜，最大不超過5ml/min 淋洗- 最大程度除去干擾物。建議此過程

3、完畢后把小柱完全抽干 洗脫- 用小體積的溶劑將被測物質(zhì)洗脫下來并收集。注意流速不要過快，以1ml/min為宜如下列圖1:2填料保存雜質(zhì)固相萃取操作一般有三步見圖2： 活化-除去柱子內(nèi)的雜質(zhì)并創(chuàng)造一定的溶劑環(huán)境。注意整個過程不要使小柱干涸 上樣-將樣品轉(zhuǎn)移入柱，此時大局部目標化合物會隨樣品基液流出，雜質(zhì)被保存在柱上，故此步驟要開場收集注意流速不要過快 洗脫-用小體積的溶劑將組分淋洗下來并收集，合并收集液。注意流速不要過快此種情況多用于食品或農(nóng)殘分析中去除色素。如下列圖2：二、固相萃取方法的建立與優(yōu)化固相萃取技術使用起來雖然比液液萃取簡單，但建立一個固相萃取的方法并無快捷方式可走。建立固相萃取方法

4、必須考慮與萃取過程相關的多種因素，歸納起來可通過下列圖來了解：方法建立如下列圖片1.jpg：方法建立如下列圖片2.jpg：1、初步固相萃取方法的建立建立初步的萃取方法要考慮:選擇適宜的SPE柱選擇適宜的固相萃取方法方法的優(yōu)化2、固相萃取柱的選擇1柱填料的選擇首選根據(jù)目標化合物與干擾物的差異，如極性，分子量，pka值等，選擇適宜的填料。固相萃取柱的選擇如下列圖片.jpg：2固相萃取柱規(guī)格的選擇對于反相、正相和吸附型固相萃取柱來說，被萃取樣品的質(zhì)量不超SPE柱填料的5%參考值，同一種SPE柱對不同的目標物選擇性不同，吸附容量不同；離子交換型的固相萃取柱，必須考慮離子交換的容量。不同廠家的小柱離子交

5、換容量稍有差異。下表附SPE小柱的容量和洗脫參數(shù)SPE柱上樣容量和洗脫體積的選擇規(guī)格最大上樣量最小洗脫體積100mg/1mL5mg250L200mg/3mL10mg500L500mg/6mL25mg1.2mL1g/6mL50mg2.4mL3、選擇適宜的固相萃取方法固相萃取的保存機制可分為兩種：吸附劑填料保存目標化合物：絕大多數(shù)化合物應用此機制，填料保存其目標組分及少量雜質(zhì)，通過淋洗步驟去除吸附在柱上的少量雜質(zhì)，最后選擇適宜的洗脫溶劑把目標組分洗脫下來。根據(jù)吸附劑的保存機理可進一步分為：1反相C18,C8,Phenyl,C4,C1 分析物：非極性至中等極性 基質(zhì)：水溶性 方法：a.活化：通常用水

6、溶性有機溶劑如甲醇活化，然后用水平衡b.淋洗：含0-50%極性溶劑的緩沖溶液淋洗雜質(zhì)c.洗脫：極性或非極性溶劑洗脫目標物2正相Silica, Florisil,Diol,NH2分析物：中等極性到強極性基質(zhì)：非極性至中等極性方法：a.活化：非極性有機溶劑b.洗脫：非極性有機溶劑如下列圖片：3陽離子交換SC*,PRS,COOHu 分析物：陽離子堿性化合物u 方法：1.活化：用于非極性有機溶劑中的樣品時，可用樣品溶劑來活化；在用于極性溶劑中的樣品時，可用水溶性有機溶劑過柱后，然后用水平衡，最后再用適當pH值的緩沖溶液進展平衡。2.上樣：樣品溶液pH值要小于其pKa兩個單位以保證其帶電荷 3.洗脫：洗

7、脫溶液pH值要大于其pKa兩個單位中和分析物的電荷4陰離子交換SA*,PSA,NH2，PA*/MA* u 分析物：陰離子酸性化合物u 方法：1.活化：用于非極性有機溶劑中的樣品時，可用樣品溶劑來活化；在用于極性溶劑中的樣品時，可用水溶性有機溶劑活化后，然后用水平衡，最后再用適當pH值的緩沖溶液進展平衡。2.上樣：樣品溶液pH值要大于其pKa兩個單位以保證其帶電荷 。3.洗脫：洗脫溶液pH值要小于其pKa兩個單位中和分析物的電荷。u 吸附劑填料保存雜質(zhì)：食品中色素等雜質(zhì)的去除多用此機制。填料保存雜質(zhì)而不保存或只保存極少量的目標組分，所以上樣后即開場收集目標組分，最后用目標物所在的溶劑進一步洗脫。

8、合并兩局部收集液。1活化：以樣品所在的有機溶劑進化活化，1-2柱管體積2上樣：提取液轉(zhuǎn)移至柱內(nèi)，并收集流出液3洗脫：用樣品所在的有機溶劑進一步洗脫，收集流出液。合并上樣和洗脫流出液。4、固相萃取方法的優(yōu)化1影響萃取效率的因素1填料固定相- 核心選擇適宜的SPE柱是保證理想結果的前提。2洗脫溶劑的強度： 采用正相固定相時，溶劑強度隨其極性增強而增加； 采用反相固定相時，溶劑強度隨極性減弱而增強。3pH值： 離子交換固定相、被分析物和干擾物質(zhì)的pKa各不一樣。通過調(diào)節(jié)pH大小，可以使固定相帶電荷，被分析物帶相反電荷，而使干擾物質(zhì)不帶電荷；或者反過來，使固定相帶電荷，干擾物質(zhì)帶相反電荷，而使被分析物

9、不帶電荷。4操作：控制適宜的流速、活化的時不要讓柱干涸等2常見問題及解決方法分析物回收率低萃取重現(xiàn)性差洗脫餾分中含有干擾物SPE柱流速降低或阻塞具體解決方案如下：A. 分析物回收率低 未保存？ 被淋洗？ 未被洗脫或局部洗脫？首先要把上樣液、淋洗液、洗脫液均收集，進樣分析，確定問題來源回收率差如下列圖片 ：重現(xiàn)性差如下列圖片：相關圖片如下 ：相關圖片如下：舉例說明1. 參考文獻方法用C18柱做相關藥物的凈化，過柱方法如下：分別用乙酸乙酯、甲醇和水活化小柱，然后把處理過的樣品過柱溶劑為具一定pH值得緩沖溶液，水淋洗小柱后，用乙酸乙酯洗脫目標物。結果：承受液混濁狀，回收率和重現(xiàn)性都不理想，可能是什么

10、原因呢？答案：正確的做法是要在淋洗過程完畢后把小柱完全抽干。原因有二，其一因為淋洗溶劑水與洗脫溶劑乙酸乙酯不互溶，如果不抽干洗脫溶劑與目標物不能充分作用，所以造成回收率和重現(xiàn)性都沒有保證，同時從外觀上看 承受液是液混濁液；其二如果淋洗過程不抽干小柱，洗脫溶劑里會引入水淋洗劑，對下一步濃縮造成很大的困難。相關圖片如下：2、水中的滅草松前處理方法 取500ml水樣過濾，待過Cleanert PEP柱相當于Waters HLB凈化1用5mL四氫呋喃洗柱子，除掉雜質(zhì)2用5mL甲醇1mL/min活化柱子3用5mL純水1mL/min活化柱4500mL的水樣以5mL/min的速度過柱55mL純水2mL/mi

11、n淋洗6小柱真空抽干20min70.9mL的甲醇1mL/min淋洗，棄去淋洗液83mL四氫呋喃1mL/min的速度洗脫柱子，收集洗脫液濃縮定容至3mL液相檢測。結果：回收率不理想，請問此方法有何問題？答案：因為目標物滅草松呈酸性，pKa=3.3，而選擇的小柱PEP是極性的。所以正確的做法是樣品在過柱之前一定要調(diào)節(jié)水樣的pH值小于等于3，使目標物分子化，以保證目標物能被小柱充分保存，否則在上柱的過程中容易造成漏的現(xiàn)象，從而造成回收率差。三、固相技術應用實例解析1、食品領域應用1動物組織中鹽酸克侖特羅等4種-沖動劑藥物殘留檢測Cleanert PC*, P/N: C*15061.實驗材料1.1 固

12、相萃取小柱：PC*(150mg/6mL)1.2 四種-沖動劑藥物：鹽酸克侖特羅、沙丁胺醇、西馬特羅、萊克多巴胺等4種-沖動劑藥物。2. 試樣的制備取豬肝空白樣品，經(jīng)過液液萃取初步處理后，添加適宜濃度的標準溶液作為空白添加試樣。3. 凈化 依次用甲醇5mL、水5mL和30mmol/L鹽酸5mL潤洗固相萃取小柱，將上述備用液過柱，依次用水5mL、甲醇5mL淋洗，真空抽干，用4%氨化甲醇5mL洗脫PC*小柱，收集洗脫液于具塞玻璃試管中，50下氮氣吹干。在樣液過柱和洗脫過程中流速控制在1mL/min左右。4. 衍生化及檢測將上述盛有殘渣的具塞玻璃試管放入50烘箱中加熱片刻，除去水分后，參加甲苯100m

13、L和雙三甲基硅基三氟乙酰胺BSTFA100mL，渦旋振蕩20s，密封玻璃塞，置于80恒溫烘箱中加熱1小時，冷卻后參加300mL甲苯，作為試樣溶液，供氣相色譜-質(zhì)譜分析色譜柱：DA-5MS, 30m0.25mm0.25m，P/N:1525-3002。5. 結果5.1 回收率實驗精細度和準確度將豬肝空白樣品經(jīng)過液液萃取初步處理后，分別添加一定量的標準溶液，配制1g/L、2g/L、5g/L、10g/L和100g/L五個濃度的試樣溶液，每批次內(nèi)同一濃度做5次平行實驗，共4個批次樣品典型回收率色譜圖見附圖。豬肝中實驗結果列表如下添加濃度g/L回收濃度g/L平均回收值g/L平均回收率%相對標準偏差%10.

14、750.7272.405.930.670.720.700.7821.621.6381.301.231.661.601.611.6454.024.2484.804.164.104.274.384.43108.248.4584.452.818.358.778.628.2510090.249.1291.152.8687.1591.7792.6293.955.2重復性實驗批間誤差實驗：豬肝中實驗結果列表如下批間添加濃度g/L12510100平均回收率%RSD%平均回收率%RSD%平均回收率%RSD%平均回收率%RSD%平均回收率%RSD%172.405.9381.303.4984.806.1684.4

15、53.5991.152.86275.376.1280.475.3784.747.5587.464.6890.053.86370.097.8580.806.5783.108.1783.215.3989.534.16476.734.9078.508.3582.905.1185.955.7288.275.93平均值73.656.2080.255.9583.886.7585.274.8489.754.20RSD%12.9510.799.437.005.75附圖：豬肝中0.5g/L、1g/L、2g/L、5g/L、10g/L和100g/L六個濃度檢測結果總離子流圖TIC代表圖譜：豬肝+1ppb(PC*)相

16、關圖片如下2雞蛋中三聚氰胺的檢測Cleanert PC*, P/N: C*06031 材料和方法1.1 主要儀器和試劑，色譜柱Venusil ASB C8，4.6*250mm，5m，艾杰爾科技，混合型陽離子交換固相萃取柱Cleanert PC*，60mg/3mL，艾杰爾科技，12位固相萃取裝置艾杰爾科技，高效液相色譜儀；高速離心機；超聲波震蕩儀；渦旋混合器；分析天平萬分之一；溶劑過濾器帶0.45m有機、水系過濾膜和真空泵；乙腈HPLC級；三聚氰胺標準品99.0%；檸檬酸分析純；庚烷磺酸鈉色譜級；水二次蒸餾水以上。1.2 色譜條件：色譜柱：Venusil ASB C8，4.6*250mm，5m；

17、流動相：乙腈10mM/L檸檬酸+10mM/L庚烷磺酸鈉緩沖液=793pH=3.0檢測波長：240nm；流速：1mL/min；進樣20L。2 實驗局部2.1三聚氰胺標準溶液配制：稱取三聚氰胺標樣10.0mg，加流動相溶解定容至100mL，即得濃度為100mg/L的三聚氰胺標樣溶液。將濃度為100mg/L的三聚氰胺標準溶液分別用水稀釋成濃度為1mg/L 、5mg/L 、10mg/L 、15mg/L 、20mg/L的標準品溶液，用0.45m濾膜過濾后進液相色譜檢測。2.21%三氯乙酸溶液溶液的配制稱取三氯乙酸1.00g，加水溶解定容至1000mL即得。2.35%氨化甲醇的配制準確量取5mL氨水和95

18、mL甲醇，混勻后備用。2.45%醋酸鉛溶液的配制稱取5.0g醋酸鉛，加水溶解定容至100mL即得。2.5混合型陽離子交換固相萃取柱Cleanert PC* 60mg/3mL的活化取Cleanert PC* 固相萃取柱，以3mL甲醇，3mL水依次過柱活化，棄去流出液，備用。2.5加標樣本處理將雞蛋翻開攪勻，分別稱取1.00g雞蛋樣本置于10mL具塞離心管中，分別參加100mg/L三聚氰胺標樣溶液10l、20l、100l，分別得到添加濃度為1.0mg/kg、2.0mg/kg、10.0mg/kg的樣本。往裝有上述樣本的具塞離心管中分別參加10mL 1%三氯乙酸溶液，2mL 5%醋酸鉛溶液，搖勻，超聲

19、20分鐘，8000rpm離心10分鐘，全部上清液轉(zhuǎn)入活化好的混合型陽離子交換固相萃取柱Cleanert PC*，60mg/3mL，依次使用3mL水，3mL甲醇淋洗，抽干，棄去淋洗液。最后用5mL 5%的氨化甲醇洗脫V/V，接收洗脫液，50氮氣吹干，用1mL流動相定容，0.45m濾膜過濾后進液相色譜檢測。另取空白雞蛋樣本1.00g，不添加三聚氰胺照上述方法處理，作為空白對照樣品。3實驗結果：3.1 峰型與別離度圖片如下由圖1可見，用該方法處理，三聚氰胺峰型對稱鋒利，且與雜質(zhì)別離良好3.2 精細度分別移取濃度為1.0mg/L、5.0mg/L的三聚氰胺標準溶液，分別連續(xù)進樣6次，結果如表1所示。表1

20、保存時間與峰面積的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)濃度mg/mL指標1#2#3#4#5#6#平均值RSD%1.0保存時間min18.83018.82918.82918.83818.84018.83418.833 0.026 峰面積89818488848084 4.286 5.0保存時間min18.94918.95218.94718.94918.95018.94618.949 0.011 峰面積423440438439437438436 1.461 由表1結果可見，本方法具有很好的精細度和重現(xiàn)性。3.3 標準校正曲線表2標準校正曲線實驗數(shù)據(jù)濃度mg/kg峰面積第1次進樣峰面積第2次進樣峰面積均值1.08979845.

21、042344043110.083284483815.012651299128220.0168918231756根據(jù)以上數(shù)據(jù)計算線性方程為：y = 87.43* - 13.67， R = 0.999 ，相關曲線見圖2。3.4 添加回收率表3 添加濃度與回收率數(shù)據(jù)添加濃度(mg/kg)峰面積計算含量回收率%1.019.91.158892115.891.021.01.214532121.452.041.72.261587113.082.040.82.216062110.8010.0188.89.70224797.0210.0219.611.26018112.60由表3可見，本方法檢測雞蛋中三聚氰胺回

22、收率較好。4 結論通過上述實驗可見，運用本方法測定雞蛋中三聚氰胺，基質(zhì)凈化效果好，雜質(zhì)干擾小，色譜峰型良好對稱度高，操作簡單方便，和準確度高等優(yōu)點，非常適用于雞蛋中三聚氰胺的檢測。 2010-9-15 12:53:21 Last edit by pjs123儀器專場展示：離子色譜色譜柱離子色譜柱關 鍵 詞：固相萃取原理及應用萃取技術2、環(huán)境檢測應用1水中酚類檢測Cleanert PEP, P/N: PE06031 實驗材料：1.1 SPE小柱：Cleanert PEP 500mg/6mL1.2 7種酚類：苯酚，4-硝基酚，間甲酚，2-氯酚，2,4-二氯酚，2,4,6-三氯酚，五氯酚2 實驗過程

23、2.1樣品前處理方法1 活化：依次用5mL甲基叔丁基醚10:90，V/V、5mL甲醇活化富集柱、5mL去離子水活化Cleanert PEP柱，5mL/min2 上樣：1L的水樣過柱，5mL/min3 淋洗：10mL去離子水淋洗小柱，5mL/min，然后真空抽干20min4 洗脫：2mL甲醇/甲基叔丁基醚10:90，V/V分兩步洗脫，收集洗脫液至尖嘴瓶中5 濃縮：將收集的2mL洗脫液，氮氣濃縮至1mL2.2色譜條件色譜柱：Venusil MP C18(4.6*150,5m)流動相：A：1%乙酸B：1%乙酸甲醇檢測器：UV檢測器梯度洗脫程序：時間流動相比例流速mL/min檢測波長(nm)0-15m

24、inA:B=50:50127515-30minA:B=15:851.8295圖片如下：3實驗結果七種酚在水中的添加回收率見表1.表1.七種酚類在水中的添加回收率結果加標平均值標準偏差平均回收率%123苯酚1.3671.5411.5241.4770.096100.34-硝基酚1.2291.3081.4301.3220.10190.0間甲酚1.2941.5401.5481.4610.144106.32-氯酚0.5270.6840.6410.6170.081100.62,4-二氯酚1.3051.6131.6211.5130.18092.82,4,6-三氯酚1.3651.6091.5111.4950.

25、12390.3五氯酚1.2591.4871.4721.4060.12895.62水中的多環(huán)芳烴固相萃取方法Cleanert PEP, P/N: PE06031. 材料1.1 目標物成分萘，苊，苊烯，芴，菲，蒽，熒蒽，芘，屈，苯并(a)蒽，苯并(k)熒蒽，苯并(a,h)熒蒽，苯并(a)芘，苯并(g,h,i)芘，茚并(1,2,3-cd)芘1.2SPE柱：Cleanert PEP60g/3mL2. 樣品處理：1L 水中參加20mL10%的硝酸3. SPE方法1 活化：5mL異丙醇和5mL水分別依次活化PEP柱2上樣：把處理好的水樣過PEP柱3 淋洗：用5mL淋洗液300mL水+700mL甲醇+2.1

26、 g Na2HPO4+2.04 g KH2PO4淋洗4抽干：抽真空枯燥柱管30min5洗脫：用4mL洗脫液90mL異丙醇+10mL冰醋酸+200mL甲苯，參加到1L石油醚中，混合均勻洗脫，收集洗脫液6濃縮，定容4. 色譜條件：色譜柱：Venusil PAH專用柱4.6250mm，5m，200樣品：溶于MeOH:CH2Cl21:116PAHs標品, 用MeOH:CH2Cl21:1稀釋10倍流速：1.2mL/min進樣量：10L柱溫：30波長：254nm甲醇/水 線性梯度洗脫，梯度表如下TminMeOH%H2O%0851528515795540955圖片如下：3水中硝基苯的固相萃取方法Cleane

27、rt PEP, P/N: PE06031SPE柱：Cleanert PEP500mg/6mL2樣品制備：分析前應先調(diào)節(jié)水樣pH值為中性，向每份水樣中加人甲醇使甲醇濃度為0.5%?；靹?。3SPE方法：3.1 PEP柱活化：將 PEP柱置于固相萃取裝置的針座圈上，用3mL正己烷預洗萃取柱，加人5mL甲醇，在甲醇完全流過萃取柱前參加10mL試劑水，使柱床處于濕潤和活化狀態(tài)。3.2 樣品的富集：根據(jù)水樣濃度準確量取適量水樣于分液漏斗中，開啟固相萃取裝置真空系統(tǒng)，使水樣連續(xù)通過活化過的萃取柱保持流速不超過5mL/min進展萃取，在萃取過程中要始終保持柱床上至少有1cm高水樣。當所有樣品都通過萃取柱后，用10mL超純水沖洗分液漏斗內(nèi)壁，繼續(xù)真空抽吸20min。3.3 枯燥柱預處理：向帶篩板的枯燥管中參加5g處理過無水硫酸鈉，使用前分別用10mL丙酮和正己烷,再以10mL丙酮洗以凈化枯燥柱3.4 萃取柱的洗脫：保持管線的連接，在真空多管裝置的萃取缸中放人試管架及接收管，在針座圈和萃取柱之間連接枯燥柱用于脫水，用1mL丙酮過渡，棄去過柱液該步驟不要吹干，讓丙酮和柱內(nèi)填料平衡2min，10mL正己烷/丙酮(90:10，V/V)洗脫萃取柱，洗脫經(jīng)過枯燥柱與PEP柱串聯(lián)，收集流出液至承受管中，用氮吹儀在40下濃縮至1.0mL，進樣