生命起源與進化：10核酶、脫氧核酶的分子進化

1、 第十章核酶、脫氧核酶的分子進化自然進化與人工分子進化的比較自然進化分子進化選擇壓環(huán)境靶分子選擇方式自然選擇強存弱汰親和純化選擇對象表型肽、蛋白質 生命起源過程中，先有蛋白質，還是先有核酸？ 1 核酶（Ribozyme）概述剪接型核酶剪切型核酶脫氧核酶（deoxyribozyme)三鏈DNA核酶的應用對酶及生物催化劑的認識的發(fā)展一、概 述生物催化劑（Biocatalyst）蛋白質類：天然酶 enzyme 極端酶 extremozyme 抗體酶 abzyme 生物工程酶其它：模擬酶核酸類:克隆酶遺傳修飾酶蛋白質工程新酶、RibozymeDeoxyribozyme長期以來，人們認為只有某些蛋白質才

2、有生物催化功能。但近些年研究發(fā)現(xiàn)，某些RNA分子也具有生物催化功能，被稱為Ribozyme。1982年Cech等發(fā)現(xiàn)四膜蟲細胞大核期間26SrRNA前體具有自我剪接功能，并于1986年證明其內含子L-19IVS具有多種催化功能。1984年Altman等發(fā)現(xiàn)RNaseP的核酸組分M1RNA具有該酶的活性，而該酶的蛋白質部分C5蛋白并無酶活性。Cech和Altman因發(fā)現(xiàn)Ribozyme而獲得1989年度諾貝爾化學獎。核酶指一類具有生物催化功能的RNA。1981年美國科羅拉多大學Cech等發(fā)現(xiàn)四膜蟲rRNA中I型內含子具有自我剪接功能。1983年Altman等發(fā)現(xiàn)單獨RNA可催化tRNA前體為成熟

3、tRNA，具有RNase P活性。核酶的發(fā)現(xiàn)打破了只有蛋白質才可能有酶催化功能的概念。為此獲得1989年度諾貝爾獎。 剪切型核酶剪接型核酶根據(jù)催化反應錘頭核酶I型內含子II型內含子發(fā)夾核酶丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNaseP核酶的分類Chambon等發(fā)現(xiàn)類內含子切割位點有2個特點（1）內含子的兩個末端并不存在同源或互補。（2）連接點具有很短的保守序列，稱為邊界 順序。其規(guī)律稱為GT-AG法則（GT-AG rule) 或Chambon法則。 左邊的剪接位點稱供體位點（donor）， 右邊的剪接位點稱受體位點（acceptor）。邊界順序核酶的催化類型已發(fā)現(xiàn)的核酶有幾十種。其中植物病毒、擬病毒、

4、衛(wèi)星RNA均為以RNA為模板，以滾動環(huán)方式復制RNA，自我切割是其RNA生命周期中不可缺少一環(huán)。核酶分為催化分子內反應和分子間反應二大類。催化分子內反應核酶又可分為自我剪接（Self-splicing）和自我剪切（Self-cleavage）二類。內含子的自我剪接 四膜蟲26S rRNA轉錄產(chǎn)物可在幾秒鐘內自動切除413nt內含子。G親核攻擊內含子剪接點，切開后外顯子接在一起。放出的內含子自身環(huán)化。 分子間催化反應底物專一性 催化t-RNA加工 大腸桿菌RNase P是一種5端內切酶，催化生成成熟t-RNA。發(fā)現(xiàn)該酶由RNase P-蛋白質和RNase P-RNA組成。自體催化剪切 丁型肝炎病

5、毒（HDV）RNA自我剪切。箭頭所指為剪切部位。鏈孢霉線粒體RNA自我剪切類病毒的自體剪切 環(huán)狀220-400nt小分子RNA不編碼蛋白，復制依賴宿主，為RNA到RNA途徑，滾環(huán)狀復制模式。環(huán)狀類病毒進入宿主后，由正鏈類病毒轉錄出多個負鏈復制中間物。負鏈中間物自我剪切后環(huán)化，再轉錄出多個正鏈復制中間物。正鏈中間物剪切并環(huán)化后成為有感染性的類病毒。其剪切通過錘頭狀二級結構進行。二、剪接型核酶剪接型核酶的作用機制是通過既剪有接的方式除去內含子（Intron).剪接型核酶分類1、I類內含子2、II類內含子核酶是一種金屬依賴酶金屬離子的作用：1、特異的結構作用，或參與活性部位的 化學過程2、促進RNA

6、的總體折疊3、二價金屬離子（如Mg 2+ ）與底物活性部位直接相互作用，參與過渡中間復合物的形成CCCUCUOP+HOG 3OAoooCCCUCUOPOAoO GCCCUCUOH+P-oGoAoo 過渡態(tài)CCCUCUOPOAoO GoCCCUCUOPOAoO GMg 2+Mg 2+o過渡態(tài) 金屬離子催化UCUAAAIVSGUAAPre-rRNAUCU A AAGUAAUCUoH35GAAAGUAAUCUUAA5GAAAGOH 3 G-IVSL-19IVS19nt53rRNA535pGOH353四膜蟲rRNA前體自我剪接反應1. I類內含子的自我剪接(Self-splicing)剪接機制L-19

7、IVS在體外的多種酶活性核酶是一種金屬依賴酶結構與功能的關系 邊界序列為5-UG-3 引導序列：IVS中的6個嘌呤核苷酸序列 5-CUCUCU-3 3-GGGAGG-5 G結合位點:IVS 中的 P7莖區(qū) 空間結構 類內含子二級結構通式保守序列G結合位點剪接部位引導序列 mRNA剪接過程 mRNA剪接反應是在剪接體（splicesome)上進行的. 5種snRNA 剪接體 50多蛋白質p 3 HO-Gp3 pP-GOHp P-G3HO 類內含子的剪接機制Mg 2+或Mn 2+GMP,GDP,GTP外顯子 內含子或居間序列（Intervening sequence,IVS)52、類內含子的自我剪

8、接剪接機制結構與功能的關系1、轉核苷酸作用 2CpCpCpCpC CpCpCpCpCpC +CpCpCpC2、水解作用 CpCpCpCpC CpCpCpC + pC3、轉磷酸作用CpCpCpCpCpCp+UpCpU CpCpCpCpCpC + UpCpUp4、去磷酸作用 CpCpCpCpCp CpCpCpCpC +Pi5、限制性內切酶作用 CpUpCpUpN +G CpUpCpU +GpN 類內含子有一個保守的二級結構：邊界序列為5-GUGCGYnAG-3結構域：兩個保守內含子結構序列EBS1,EBS2與兩個外顯子結構序列IBS1,IBS2互相配對。結構域：高度保守，催化活性必需。結構域：A

9、提供2-OH 類內含子二級結構模式5 3p 2 HO-Ap p-A p3OHpP-AHO 3類內含子的剪接機制Mg 2+套環(huán)的形成53外顯子連接三、剪切型核酶1、自身催化剪切型RNA剪切機制錘頭結構 (Hammerhead)發(fā)夾結構(Hairpin)斧頭結構(Axehead)假結樣結構(Pseudoknot-like) 這類RNA進行自身催化的反應是只切不接。特點：在 Mg 2+ 或其他二價金屬離子存在下，在特定的位點，自我剪切，產(chǎn)生5-OH 和2，3-環(huán)磷酸二酯末端。 剪 切 機 制核酶自身剪切反應錘頭（Hammerhead)結構二級結構模型錘頭二級結構編號錘頭結構的類型錘頭核酶的催化反應機

10、制錘頭結構的 五種類型R示酶，S示底物，箭頭示剪切位點錘頭型核酶的二級結構 和空間立體結構示意圖三個雙螺旋區(qū)13個核苷酸殘基保守序列剪切反應在右上方GUX序列的3端自動發(fā)生錘頭狀二級結構錘頭狀二級結構中有13個核苷酸保守序列，其中11個不變時剪切反應即可發(fā)生。17位（ X ）的核苷酸殘基多數(shù)是C,不能是U,G.7位核苷酸殘基的置換不會對酶活性產(chǎn)生很大影響錘頭二級結構編號7位核苷酸17位核苷酸錘頭型核酶對切割位點的識別位點遵守NHH規(guī)則（N代表任意核苷酸，H代表A,U或C）。催化過程需要二價金屬離子參與。單金屬離子催化雙金屬離子催化 發(fā)夾（hairpin ）結構 發(fā)夾核酶發(fā)現(xiàn)于三種不同植物RNA

11、病毒，即煙草環(huán)點病毒，菊苣黃色斑點病毒型和筷子芥花葉病毒。三種發(fā)夾核酶分別是這些RNA病毒衛(wèi)星RNA的負鏈，英文縮寫分別是sTRSV,sCYMVT,sARMV,均為單鏈RNA。 發(fā)夾核酶結構模型 發(fā)夾核酶催化機制 金屬離子在催化反應 中起結構作用，其剪切活性比錘頭結構核酶高。5個環(huán)和4個螺旋形成兩個結構域剪切反應發(fā)生在底物識別序列GUC的5端兩個內部環(huán)中的堿基及在螺旋區(qū)的G11和底物中的G+1都是酶發(fā)揮作用所必需的。53 發(fā)夾二級結構模型剪切位點HDV RNA斧頭結構模式 三個堿基對的莖需要二價陽離子，產(chǎn)生5-OH和 2,3-環(huán)磷酸剪切部位剪切部位GUACGGCCGGUGCCGGCUGGGGC

12、AUUCCGAGGGGAC CAAGUAAUGGCUCCCCUGcCGGGUCCAGCCU U C C G C C UCAGGUAAGCG35剪切位點 HDV 核酶假結樣結構L3L4J1/2 J1/4J2/4四個螺旋區(qū)，三個連接區(qū)，兩個環(huán)活性中心區(qū)： J1/4, J2/4, L3剪切位點：688/6892、異體催化剪切型RNA 核糖核酸酶P(RNaseP)是內切核酸酶，是核糖核蛋白體復合物，能剪切所有tRNA前體的5端，除去多余的序列，形成3-OH 和 5-磷酸末端。 RNaseP由M1RNA和蛋白質亞基組成。體外： M1RNA具催化作用，蛋白質作為輔助因子 體內： M1RNA和蛋白質對酶活性

13、都是必需的。剪切機制: 依賴于Mg 2+結構與功能的關系：M1RNA 5端完整結構對維持催化活性是必需的。 RNaseP可剪切前體5端41nt, 5端成熟。不同tRNA的 5 端沒有順序共同性，剪切的準確性與剪切部位周圍的核苷酸順序無關，表明在RNaseP的組分內沒有引導序列， RNaseP所識別的是底物的高級結構。RNaseP底物的二級結構剪切位點影響核酶活性的因素1、pH值對活性的影響 pH7.0 - 7.5 時核酶活性最高。2、二價金屬陽離子對活性的影響Mg 2+ Mn 2+ 3、抗生素對活性的影響大多數(shù)為抑制效應4、變形劑對活性的影響5、溫度對活性的影響在65范圍內隨溫度升高而增加，3

14、7 時均有適宜的活性。四、脫氧核酶1、體外選擇技術篩選脫氧核酶分子脫氧核酶分子的體外選擇是通過優(yōu)先擴增事先固定在固相載體上的具有自我裂解功能的活性分子來實現(xiàn)的。通過這一技術已有兩種具有RNA裂解活性的脫氧核酶被篩選出來。2、脫氧核酶催化特征 10-23裂解位點為嘌呤、嘧啶連接雙鏈穩(wěn)定性越高，酶活性越高 結合臂的長度影響酶催化轉換性 RNA-DNA 比 RNA-RNA 穩(wěn)定性差。 對Mg 2+,Zn 2+,Ca 2+,Mn 2+有依賴性 組氨酸，精氨酸促進催化活性 極強的切割特異性（單堿基錯配即可大幅降低切割活性）10-23型脫氧核酶作用機理RY RRNA substrate切割點R=A or

15、GY=C or Udeoxyribozyme 5 3手槍型脫氧核酶自我剪切作用機理莖II (催化部位)莖I(結合部位) 53 3 C A切割點102030 40BAA5BBABAPCRPCR555StreptavidinColumnNaOHcofactor體外選擇技術篩選具有自我裂解功能的DNA分子N50(DNA分子庫）五、三鏈DNA三鏈DNA在基因治療中的意義寡聚脫氧核苷酸（ODN）以DNA雙螺旋分子的專一性序列為靶子，通過與該序列形成三螺旋DNA來阻止轉錄作用機制合成脫氧寡核苷酸（ODN）（同聚嘌呤或同聚嘧啶）DNA分子中同聚嘌呤 同聚嘧啶ODN也被稱為TFO(triplex-formin

16、g oligo)六、核酶的應用RNA干擾在醫(yī)學領域中的應用作為高特異性RNA限制性內切酶生命起源探索RNA干擾（RNA interference, RNAi）是指在多種生物細胞內，由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）介導同源序列mRNA的特異性降解，從而導致基因沉默（gene silencing）的現(xiàn)象。因RNAi所致的基因沉默發(fā)生在轉錄后水平，所以被稱為轉錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）。RNAi現(xiàn)象廣泛存在于大多數(shù)真核生物中，這種存在揭示了RNAi很可能是出現(xiàn)于生命進化的早期階段。近年來，隨著對

17、RNAi研究的不斷深入，其作用機制正在逐步被闡明；同時作為阻斷基因表達的新手段，RNAi技術也日趨完善和成熟。 核酶在醫(yī)學領域中的應用：通過識別特定位點而抑制目標基因的表達，抑制效率高，專一性強。免疫源性低，很少引起免疫反應。針對錘頭核酶而言，催化結構域小，既可作為轉基因表達產(chǎn)物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在體內轉運。在其他領域的應用防治動、植物 病毒侵害：馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒負鏈的多價核酶構建，馬鈴薯卷葉病毒復制酶基因負鏈的突變核酶的克隆等核酶在醫(yī)學上的應用1、核酶抗肝炎病毒的研究 目前人們已進行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎病毒（ HBV）、丙型肝炎病毒（ HCV）以及

18、HDV作用的研究。人工設計核酶多為錘頭狀結構，少部分是采用發(fā)夾狀核酶。2、抗人類免疫缺陷病毒型（HIV- )核酶 1998年，美國加利福尼亞大學Wong-Staal等利用發(fā)夾核酶抑制HIV- 基因表達，并率先進入臨床期。3、抗腫瘤治療 核酶能在特定位點準確有效地識別和切割腫瘤細胞的mRNA,抑制腫瘤基因的表達，達到治療腫瘤的目的。 基因治療（gene therapy）向有功能缺陷的細胞補充相應功能基因，以糾正或補償其基因缺陷，從而達到治療的目的。對象： 體細胞 生殖細胞基因治療的必要條件發(fā)病機制在DNA水平上已經(jīng)清楚要轉移的基因已經(jīng)克隆分離，其表達產(chǎn)物有詳盡的了解該基因正常表達的組織可在體外進

19、行遺傳操作理想的基因治療還必須：外源基因可有效導入靶細胞外源基因能在靶細胞中長期穩(wěn)定存留導入基因能適量表達導入基因的方法及載體對宿主細胞安全無害基因治療的主要策略基因標記(gene labeling)Neo基因，逆轉錄病毒載體基因置換（基因矯正）定位重組或同源重組糾正缺陷基因或異常序列基因添加（基因增補）導入外源基因使靶細胞表達其本身不表達的基因導入正常的基因補償缺陷基因的功能導入新的基因，利用表達產(chǎn)物治療基因干預(gene interference)指采用特定的方式抑制某個基因的表達，或者通過破壞某個基因而使之不表達，以達到治療疾病的目的。(mRNA,DNA)導入寡核苷酸抑制內源基因的表達反

20、義核酸 封閉基因表達核酶 裂解特異的靶mRNA基因轉移的方法：生物學方法逆轉錄病毒載體，腺病毒載體，腺病毒相關病毒載體，單純皰疹病毒載體安全性問題：感染的可能性、污染的可能性、整合導致的基因突變非生物學方法脂質體直接注射受體介導基因轉移技術其它方法(磷酸鈣共沉淀法、電穿孔法、顯微注射法、基因槍法)目前常用的靶細胞有：造血細胞皮膚成纖維細胞肝細胞血管內皮細胞淋巴細胞肌肉細胞腫瘤細胞反義RNA與特異的mRNA結合而調控其翻譯安全性高反義RNA設計和制備方便具有劑量調節(jié)效應能直接作用于一些RNA病毒核酶應用的優(yōu)勢核酶結構穩(wěn)定可重復使用核酶的設計 靶序列無二級結構切割位點GUN容易與其它RNA互補結合

21、核酶技術面臨的問題1、核酶催化切割反應的可 逆性問題2、提高催化效率3、尋找合適載體將核酶高效、特異地導入靶細胞4、使核酶在細胞內有調控地高效表達5、增強核酶在細胞內的穩(wěn)定性6、對宿主的損傷問題有待進一步考察 2 核酶的體外分子進化核酶的功能隨機RNA庫的構建新酶的體外選擇一、核酶的功能與特定的蛋白質（病毒顆粒）結合RNA的拼接切割DNA連接酶的功能自身催化與生物素(biotin)連接酰基化反應磷酸激酶活性其他活性確定要進化的區(qū)域 類內含子二級結構保守序列G結合位點剪接部位引導序列類內含子二級結構5 317位（ X ）的核苷酸殘基多數(shù)是C,不能是U,G.7位核苷酸殘基的置換不會對酶活性產(chǎn)生很大影響錘頭二級結構7位核苷酸17位核苷酸RNaseP底物的二級結構剪切位點二、隨機RNA庫的構建添加T7 promoter序列隨機序列DNA庫的構建體外轉錄體外篩選富集擴增GCCGGATCCGGGCCTCATGTCGAA - (Nt)nT7promoterPCR合成DNA隨機DNA序列隨機序列DNA庫T7-promoter-PrimerPCR篩選特異RNA逆轉錄體外轉錄cDNA隨機RNA多輪篩選富集提高R