生命起源與進(jìn)化：10核酶、脫氧核酶的分子進(jìn)化

1、 第十章核酶、脫氧核酶的分子進(jìn)化自然進(jìn)化與人工分子進(jìn)化的比較自然進(jìn)化分子進(jìn)化選擇壓環(huán)境靶分子選擇方式自然選擇強(qiáng)存弱汰親和純化選擇對象表型肽、蛋白質(zhì) 生命起源過程中，先有蛋白質(zhì)，還是先有核酸？ 1 核酶（Ribozyme）概述剪接型核酶剪切型核酶脫氧核酶（deoxyribozyme)三鏈DNA核酶的應(yīng)用對酶及生物催化劑的認(rèn)識的發(fā)展一、概 述生物催化劑（Biocatalyst）蛋白質(zhì)類：天然酶 enzyme 極端酶 extremozyme 抗體酶 abzyme 生物工程酶其它：模擬酶核酸類:克隆酶遺傳修飾酶蛋白質(zhì)工程新酶、RibozymeDeoxyribozyme長期以來，人們認(rèn)為只有某些蛋白質(zhì)才

2、有生物催化功能。但近些年研究發(fā)現(xiàn)，某些RNA分子也具有生物催化功能，被稱為Ribozyme。1982年Cech等發(fā)現(xiàn)四膜蟲細(xì)胞大核期間26SrRNA前體具有自我剪接功能，并于1986年證明其內(nèi)含子L-19IVS具有多種催化功能。1984年Altman等發(fā)現(xiàn)RNaseP的核酸組分M1RNA具有該酶的活性，而該酶的蛋白質(zhì)部分C5蛋白并無酶活性。Cech和Altman因發(fā)現(xiàn)Ribozyme而獲得1989年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。核酶指一類具有生物催化功能的RNA。1981年美國科羅拉多大學(xué)Cech等發(fā)現(xiàn)四膜蟲rRNA中I型內(nèi)含子具有自我剪接功能。1983年Altman等發(fā)現(xiàn)單獨(dú)RNA可催化tRNA前體為成熟

3、tRNA，具有RNase P活性。核酶的發(fā)現(xiàn)打破了只有蛋白質(zhì)才可能有酶催化功能的概念。為此獲得1989年度諾貝爾獎(jiǎng)。 剪切型核酶剪接型核酶根據(jù)催化反應(yīng)錘頭核酶I型內(nèi)含子II型內(nèi)含子發(fā)夾核酶丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNaseP核酶的分類Chambon等發(fā)現(xiàn)類內(nèi)含子切割位點(diǎn)有2個(gè)特點(diǎn)（1）內(nèi)含子的兩個(gè)末端并不存在同源或互補(bǔ)。（2）連接點(diǎn)具有很短的保守序列，稱為邊界 順序。其規(guī)律稱為GT-AG法則（GT-AG rule) 或Chambon法則。 左邊的剪接位點(diǎn)稱供體位點(diǎn)（donor）， 右邊的剪接位點(diǎn)稱受體位點(diǎn)（acceptor）。邊界順序核酶的催化類型已發(fā)現(xiàn)的核酶有幾十種。其中植物病毒、擬病毒、

4、衛(wèi)星RNA均為以RNA為模板，以滾動(dòng)環(huán)方式復(fù)制RNA，自我切割是其RNA生命周期中不可缺少一環(huán)。核酶分為催化分子內(nèi)反應(yīng)和分子間反應(yīng)二大類。催化分子內(nèi)反應(yīng)核酶又可分為自我剪接（Self-splicing）和自我剪切（Self-cleavage）二類。內(nèi)含子的自我剪接 四膜蟲26S rRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可在幾秒鐘內(nèi)自動(dòng)切除413nt內(nèi)含子。G親核攻擊內(nèi)含子剪接點(diǎn)，切開后外顯子接在一起。放出的內(nèi)含子自身環(huán)化。 分子間催化反應(yīng)底物專一性 催化t-RNA加工 大腸桿菌RNase P是一種5端內(nèi)切酶，催化生成成熟t-RNA。發(fā)現(xiàn)該酶由RNase P-蛋白質(zhì)和RNase P-RNA組成。自體催化剪切 丁型肝炎病

5、毒（HDV）RNA自我剪切。箭頭所指為剪切部位。鏈孢霉線粒體RNA自我剪切類病毒的自體剪切 環(huán)狀220-400nt小分子RNA不編碼蛋白，復(fù)制依賴宿主，為RNA到RNA途徑，滾環(huán)狀復(fù)制模式。環(huán)狀類病毒進(jìn)入宿主后，由正鏈類病毒轉(zhuǎn)錄出多個(gè)負(fù)鏈復(fù)制中間物。負(fù)鏈中間物自我剪切后環(huán)化，再轉(zhuǎn)錄出多個(gè)正鏈復(fù)制中間物。正鏈中間物剪切并環(huán)化后成為有感染性的類病毒。其剪切通過錘頭狀二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行。二、剪接型核酶剪接型核酶的作用機(jī)制是通過既剪有接的方式除去內(nèi)含子（Intron).剪接型核酶分類1、I類內(nèi)含子2、II類內(nèi)含子核酶是一種金屬依賴酶金屬離子的作用：1、特異的結(jié)構(gòu)作用，或參與活性部位的 化學(xué)過程2、促進(jìn)RNA

6、的總體折疊3、二價(jià)金屬離子（如Mg 2+ ）與底物活性部位直接相互作用，參與過渡中間復(fù)合物的形成CCCUCUOP+HOG 3OAoooCCCUCUOPOAoO GCCCUCUOH+P-oGoAoo 過渡態(tài)CCCUCUOPOAoO GoCCCUCUOPOAoO GMg 2+Mg 2+o過渡態(tài) 金屬離子催化UCUAAAIVSGUAAPre-rRNAUCU A AAGUAAUCUoH35GAAAGUAAUCUUAA5GAAAGOH 3 G-IVSL-19IVS19nt53rRNA535pGOH353四膜蟲rRNA前體自我剪接反應(yīng)1. I類內(nèi)含子的自我剪接(Self-splicing)剪接機(jī)制L-19

7、IVS在體外的多種酶活性核酶是一種金屬依賴酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 邊界序列為5-UG-3 引導(dǎo)序列：IVS中的6個(gè)嘌呤核苷酸序列 5-CUCUCU-3 3-GGGAGG-5 G結(jié)合位點(diǎn):IVS 中的 P7莖區(qū) 空間結(jié)構(gòu) 類內(nèi)含子二級結(jié)構(gòu)通式保守序列G結(jié)合位點(diǎn)剪接部位引導(dǎo)序列 mRNA剪接過程 mRNA剪接反應(yīng)是在剪接體（splicesome)上進(jìn)行的. 5種snRNA 剪接體 50多蛋白質(zhì)p 3 HO-Gp3 pP-GOHp P-G3HO 類內(nèi)含子的剪接機(jī)制Mg 2+或Mn 2+GMP,GDP,GTP外顯子 內(nèi)含子或居間序列（Intervening sequence,IVS)52、類內(nèi)含子的自我剪

8、接剪接機(jī)制結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系1、轉(zhuǎn)核苷酸作用 2CpCpCpCpC CpCpCpCpCpC +CpCpCpC2、水解作用 CpCpCpCpC CpCpCpC + pC3、轉(zhuǎn)磷酸作用CpCpCpCpCpCp+UpCpU CpCpCpCpCpC + UpCpUp4、去磷酸作用 CpCpCpCpCp CpCpCpCpC +Pi5、限制性內(nèi)切酶作用 CpUpCpUpN +G CpUpCpU +GpN 類內(nèi)含子有一個(gè)保守的二級結(jié)構(gòu)：邊界序列為5-GUGCGYnAG-3結(jié)構(gòu)域：兩個(gè)保守內(nèi)含子結(jié)構(gòu)序列EBS1,EBS2與兩個(gè)外顯子結(jié)構(gòu)序列IBS1,IBS2互相配對。結(jié)構(gòu)域：高度保守，催化活性必需。結(jié)構(gòu)域：A

9、提供2-OH 類內(nèi)含子二級結(jié)構(gòu)模式5 3p 2 HO-Ap p-A p3OHpP-AHO 3類內(nèi)含子的剪接機(jī)制Mg 2+套環(huán)的形成53外顯子連接三、剪切型核酶1、自身催化剪切型RNA剪切機(jī)制錘頭結(jié)構(gòu) (Hammerhead)發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)斧頭結(jié)構(gòu)(Axehead)假結(jié)樣結(jié)構(gòu)(Pseudoknot-like) 這類RNA進(jìn)行自身催化的反應(yīng)是只切不接。特點(diǎn)：在 Mg 2+ 或其他二價(jià)金屬離子存在下，在特定的位點(diǎn)，自我剪切，產(chǎn)生5-OH 和2，3-環(huán)磷酸二酯末端。 剪 切 機(jī) 制核酶自身剪切反應(yīng)錘頭（Hammerhead)結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)模型錘頭二級結(jié)構(gòu)編號錘頭結(jié)構(gòu)的類型錘頭核酶的催化反應(yīng)機(jī)

10、制錘頭結(jié)構(gòu)的 五種類型R示酶，S示底物，箭頭示剪切位點(diǎn)錘頭型核酶的二級結(jié)構(gòu) 和空間立體結(jié)構(gòu)示意圖三個(gè)雙螺旋區(qū)13個(gè)核苷酸殘基保守序列剪切反應(yīng)在右上方GUX序列的3端自動(dòng)發(fā)生錘頭狀二級結(jié)構(gòu)錘頭狀二級結(jié)構(gòu)中有13個(gè)核苷酸保守序列，其中11個(gè)不變時(shí)剪切反應(yīng)即可發(fā)生。17位（ X ）的核苷酸殘基多數(shù)是C,不能是U,G.7位核苷酸殘基的置換不會(huì)對酶活性產(chǎn)生很大影響錘頭二級結(jié)構(gòu)編號7位核苷酸17位核苷酸錘頭型核酶對切割位點(diǎn)的識別位點(diǎn)遵守NHH規(guī)則（N代表任意核苷酸，H代表A,U或C）。催化過程需要二價(jià)金屬離子參與。單金屬離子催化雙金屬離子催化 發(fā)夾（hairpin ）結(jié)構(gòu) 發(fā)夾核酶發(fā)現(xiàn)于三種不同植物RNA

11、病毒，即煙草環(huán)點(diǎn)病毒，菊苣黃色斑點(diǎn)病毒型和筷子芥花葉病毒。三種發(fā)夾核酶分別是這些RNA病毒衛(wèi)星RNA的負(fù)鏈，英文縮寫分別是sTRSV,sCYMVT,sARMV,均為單鏈RNA。 發(fā)夾核酶結(jié)構(gòu)模型 發(fā)夾核酶催化機(jī)制 金屬離子在催化反應(yīng) 中起結(jié)構(gòu)作用，其剪切活性比錘頭結(jié)構(gòu)核酶高。5個(gè)環(huán)和4個(gè)螺旋形成兩個(gè)結(jié)構(gòu)域剪切反應(yīng)發(fā)生在底物識別序列GUC的5端兩個(gè)內(nèi)部環(huán)中的堿基及在螺旋區(qū)的G11和底物中的G+1都是酶發(fā)揮作用所必需的。53 發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)模型剪切位點(diǎn)HDV RNA斧頭結(jié)構(gòu)模式 三個(gè)堿基對的莖需要二價(jià)陽離子，產(chǎn)生5-OH和 2,3-環(huán)磷酸剪切部位剪切部位GUACGGCCGGUGCCGGCUGGGGC

12、AUUCCGAGGGGAC CAAGUAAUGGCUCCCCUGcCGGGUCCAGCCU U C C G C C UCAGGUAAGCG35剪切位點(diǎn) HDV 核酶假結(jié)樣結(jié)構(gòu)L3L4J1/2 J1/4J2/4四個(gè)螺旋區(qū)，三個(gè)連接區(qū)，兩個(gè)環(huán)活性中心區(qū)： J1/4, J2/4, L3剪切位點(diǎn)：688/6892、異體催化剪切型RNA 核糖核酸酶P(RNaseP)是內(nèi)切核酸酶，是核糖核蛋白體復(fù)合物，能剪切所有tRNA前體的5端，除去多余的序列，形成3-OH 和 5-磷酸末端。 RNaseP由M1RNA和蛋白質(zhì)亞基組成。體外： M1RNA具催化作用，蛋白質(zhì)作為輔助因子 體內(nèi)： M1RNA和蛋白質(zhì)對酶活性

13、都是必需的。剪切機(jī)制: 依賴于Mg 2+結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系：M1RNA 5端完整結(jié)構(gòu)對維持催化活性是必需的。 RNaseP可剪切前體5端41nt, 5端成熟。不同tRNA的 5 端沒有順序共同性，剪切的準(zhǔn)確性與剪切部位周圍的核苷酸順序無關(guān)，表明在RNaseP的組分內(nèi)沒有引導(dǎo)序列， RNaseP所識別的是底物的高級結(jié)構(gòu)。RNaseP底物的二級結(jié)構(gòu)剪切位點(diǎn)影響核酶活性的因素1、pH值對活性的影響 pH7.0 - 7.5 時(shí)核酶活性最高。2、二價(jià)金屬陽離子對活性的影響Mg 2+ Mn 2+ 3、抗生素對活性的影響大多數(shù)為抑制效應(yīng)4、變形劑對活性的影響5、溫度對活性的影響在65范圍內(nèi)隨溫度升高而增加，3

14、7 時(shí)均有適宜的活性。四、脫氧核酶1、體外選擇技術(shù)篩選脫氧核酶分子脫氧核酶分子的體外選擇是通過優(yōu)先擴(kuò)增事先固定在固相載體上的具有自我裂解功能的活性分子來實(shí)現(xiàn)的。通過這一技術(shù)已有兩種具有RNA裂解活性的脫氧核酶被篩選出來。2、脫氧核酶催化特征 10-23裂解位點(diǎn)為嘌呤、嘧啶連接雙鏈穩(wěn)定性越高，酶活性越高 結(jié)合臂的長度影響酶催化轉(zhuǎn)換性 RNA-DNA 比 RNA-RNA 穩(wěn)定性差。 對Mg 2+,Zn 2+,Ca 2+,Mn 2+有依賴性 組氨酸，精氨酸促進(jìn)催化活性 極強(qiáng)的切割特異性（單堿基錯(cuò)配即可大幅降低切割活性）10-23型脫氧核酶作用機(jī)理RY RRNA substrate切割點(diǎn)R=A or

15、GY=C or Udeoxyribozyme 5 3手槍型脫氧核酶自我剪切作用機(jī)理莖II (催化部位)莖I(結(jié)合部位) 53 3 C A切割點(diǎn)102030 40BAA5BBABAPCRPCR555StreptavidinColumnNaOHcofactor體外選擇技術(shù)篩選具有自我裂解功能的DNA分子N50(DNA分子庫）五、三鏈DNA三鏈DNA在基因治療中的意義寡聚脫氧核苷酸（ODN）以DNA雙螺旋分子的專一性序列為靶子，通過與該序列形成三螺旋DNA來阻止轉(zhuǎn)錄作用機(jī)制合成脫氧寡核苷酸（ODN）（同聚嘌呤或同聚嘧啶）DNA分子中同聚嘌呤 同聚嘧啶ODN也被稱為TFO(triplex-formin

16、g oligo)六、核酶的應(yīng)用RNA干擾在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用作為高特異性RNA限制性內(nèi)切酶生命起源探索RNA干擾（RNA interference, RNAi）是指在多種生物細(xì)胞內(nèi)，由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）介導(dǎo)同源序列mRNA的特異性降解，從而導(dǎo)致基因沉默（gene silencing）的現(xiàn)象。因RNAi所致的基因沉默發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，所以被稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）。RNAi現(xiàn)象廣泛存在于大多數(shù)真核生物中，這種存在揭示了RNAi很可能是出現(xiàn)于生命進(jìn)化的早期階段。近年來，隨著對

17、RNAi研究的不斷深入，其作用機(jī)制正在逐步被闡明；同時(shí)作為阻斷基因表達(dá)的新手段，RNAi技術(shù)也日趨完善和成熟。 核酶在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用：通過識別特定位點(diǎn)而抑制目標(biāo)基因的表達(dá)，抑制效率高，專一性強(qiáng)。免疫源性低，很少引起免疫反應(yīng)。針對錘頭核酶而言，催化結(jié)構(gòu)域小，既可作為轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。在其他領(lǐng)域的應(yīng)用防治動(dòng)、植物 病毒侵害：馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒負(fù)鏈的多價(jià)核酶構(gòu)建，馬鈴薯卷葉病毒復(fù)制酶基因負(fù)鏈的突變核酶的克隆等核酶在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用1、核酶抗肝炎病毒的研究 目前人們已進(jìn)行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎病毒（ HBV）、丙型肝炎病毒（ HCV）以及

18、HDV作用的研究。人工設(shè)計(jì)核酶多為錘頭狀結(jié)構(gòu)，少部分是采用發(fā)夾狀核酶。2、抗人類免疫缺陷病毒型（HIV- )核酶 1998年，美國加利福尼亞大學(xué)Wong-Staal等利用發(fā)夾核酶抑制HIV- 基因表達(dá)，并率先進(jìn)入臨床期。3、抗腫瘤治療 核酶能在特定位點(diǎn)準(zhǔn)確有效地識別和切割腫瘤細(xì)胞的mRNA,抑制腫瘤基因的表達(dá)，達(dá)到治療腫瘤的目的。 基因治療（gene therapy）向有功能缺陷的細(xì)胞補(bǔ)充相應(yīng)功能基因，以糾正或補(bǔ)償其基因缺陷，從而達(dá)到治療的目的。對象： 體細(xì)胞 生殖細(xì)胞基因治療的必要條件發(fā)病機(jī)制在DNA水平上已經(jīng)清楚要轉(zhuǎn)移的基因已經(jīng)克隆分離，其表達(dá)產(chǎn)物有詳盡的了解該基因正常表達(dá)的組織可在體外進(jìn)

19、行遺傳操作理想的基因治療還必須：外源基因可有效導(dǎo)入靶細(xì)胞外源基因能在靶細(xì)胞中長期穩(wěn)定存留導(dǎo)入基因能適量表達(dá)導(dǎo)入基因的方法及載體對宿主細(xì)胞安全無害基因治療的主要策略基因標(biāo)記(gene labeling)Neo基因，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因置換（基因矯正）定位重組或同源重組糾正缺陷基因或異常序列基因添加（基因增補(bǔ)）導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本身不表達(dá)的基因?qū)胝５幕蜓a(bǔ)償缺陷基因的功能導(dǎo)入新的基因，利用表達(dá)產(chǎn)物治療基因干預(yù)(gene interference)指采用特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或者通過破壞某個(gè)基因而使之不表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。(mRNA,DNA)導(dǎo)入寡核苷酸抑制內(nèi)源基因的表達(dá)反

20、義核酸 封閉基因表達(dá)核酶 裂解特異的靶mRNA基因轉(zhuǎn)移的方法：生物學(xué)方法逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體，腺病毒相關(guān)病毒載體，單純皰疹病毒載體安全性問題：感染的可能性、污染的可能性、整合導(dǎo)致的基因突變非生物學(xué)方法脂質(zhì)體直接注射受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)其它方法(磷酸鈣共沉淀法、電穿孔法、顯微注射法、基因槍法)目前常用的靶細(xì)胞有：造血細(xì)胞皮膚成纖維細(xì)胞肝細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞淋巴細(xì)胞肌肉細(xì)胞腫瘤細(xì)胞反義RNA與特異的mRNA結(jié)合而調(diào)控其翻譯安全性高反義RNA設(shè)計(jì)和制備方便具有劑量調(diào)節(jié)效應(yīng)能直接作用于一些RNA病毒核酶應(yīng)用的優(yōu)勢核酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定可重復(fù)使用核酶的設(shè)計(jì) 靶序列無二級結(jié)構(gòu)切割位點(diǎn)GUN容易與其它RNA互補(bǔ)結(jié)合

21、核酶技術(shù)面臨的問題1、核酶催化切割反應(yīng)的可 逆性問題2、提高催化效率3、尋找合適載體將核酶高效、特異地導(dǎo)入靶細(xì)胞4、使核酶在細(xì)胞內(nèi)有調(diào)控地高效表達(dá)5、增強(qiáng)核酶在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性6、對宿主的損傷問題有待進(jìn)一步考察 2 核酶的體外分子進(jìn)化核酶的功能隨機(jī)RNA庫的構(gòu)建新酶的體外選擇一、核酶的功能與特定的蛋白質(zhì)（病毒顆粒）結(jié)合RNA的拼接切割DNA連接酶的功能自身催化與生物素(biotin)連接酰基化反應(yīng)磷酸激酶活性其他活性確定要進(jìn)化的區(qū)域 類內(nèi)含子二級結(jié)構(gòu)保守序列G結(jié)合位點(diǎn)剪接部位引導(dǎo)序列類內(nèi)含子二級結(jié)構(gòu)5 317位（ X ）的核苷酸殘基多數(shù)是C,不能是U,G.7位核苷酸殘基的置換不會(huì)對酶活性產(chǎn)生很大影響錘頭二級結(jié)構(gòu)7位核苷酸17位核苷酸RNaseP底物的二級結(jié)構(gòu)剪切位點(diǎn)二、隨機(jī)RNA庫的構(gòu)建添加T7 promoter序列隨機(jī)序列DNA庫的構(gòu)建體外轉(zhuǎn)錄體外篩選富集擴(kuò)增GCCGGATCCGGGCCTCATGTCGAA - (Nt)nT7promoterPCR合成DNA隨機(jī)DNA序列隨機(jī)序列DNA庫T7-promoter-PrimerPCR篩選特異RNA逆轉(zhuǎn)錄體外轉(zhuǎn)錄cDNA隨機(jī)RNA多輪篩選富集提高R