常見內(nèi)分泌遺傳病的基因檢測醫(yī)學(xué)教學(xué)課件

1、常見內(nèi)分泌遺傳病的基因檢測第1頁，共75頁。一、遺傳與人類疾病什么是遺傳??？遺傳病的分類什么是基因？什么是“基因突變”？二、為什么要建立基因檢測？三、如何檢測基因突變？四、常用的基因檢測技術(shù)平臺及特點(diǎn)五、基因檢測的臨床應(yīng)用目錄第2頁，共75頁。遺傳病是指由遺傳物質(zhì)發(fā)生改變而引起的或者是由致病基因所控制的疾病。單基因?。篢halassemias(地中海貧血)DMD(假肥大型肌營養(yǎng)不良)多基因病高血壓染色體病染色體數(shù)目/結(jié)構(gòu)改變Trisomy 21 Down syndromeTrisomy 18 Edward syndromeTrisomy 13 Plateau syndrome47,XXY Kl

2、inefelter syndrome45,X Turner syndrome69,XXXY Abortus異位 (平衡/不平衡)體細(xì)胞病體細(xì)胞遺傳物質(zhì)的改變，癌。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤線粒體基因病由于線粒體DNA（mtDNA）上的基因突變所致的遺傳病，呈母系遺傳，如MELAS。一、遺傳與人類疾病第3頁，共75頁。單基因遺傳病的遺傳方式常染色體顯性SCA1 , SCA2, SCA3, 常染色體隱性SRD5A2, CYP21A2X-連鎖顯性Rett綜合征(RETT syndrome)X-連鎖隱性雄激素不敏感綜合征(androgen insensitivity syndrome )Y-連鎖Y連鎖遺傳性耳聾(

3、Y-linked hereditary hearing impairment)線粒體母系遺傳： 線粒體病(MELAS, MERRF, etc.)第4頁，共75頁。染色體與基因第5頁，共75頁?；蚪M成第6頁，共75頁。一、遺傳與人類疾病什么是遺傳?。窟z傳病的分類什么是基因？什么是“基因突變”？二、為什么要建立基因檢測？三、如何檢測基因突變？四、常用的基因檢測技術(shù)平臺及特點(diǎn)五、基因檢測的臨床應(yīng)用目錄第7頁，共75頁。疾病概述出生缺陷的危害死亡率大幅升高導(dǎo)致兒童和成人殘疾給本人、家庭造成極大的不幸，帶來極為沉重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，將有礙于提高人口素質(zhì)。9.12中國預(yù)防出生缺陷日二、為什么要建立基因檢

4、測？第8頁，共75頁。疾病概述遺傳因素環(huán)境因素或二者的共同作用出生缺陷的發(fā)生原因第9頁，共75頁。疾病概述出生缺陷預(yù)防措施第10頁，共75頁。疾病概述降低出生缺陷的武器第11頁，共75頁。基因檢測的意義1： -有效的遺傳咨詢，降低出生缺陷確診遺傳咨詢產(chǎn)前診斷第12頁，共75頁?；驒z測的意義2：-指導(dǎo)治療腫瘤的個(gè)體化治療預(yù)防：藥物性致聾可治性/部分可治性遺傳病遺傳代謝?。篜KU，希特林蛋白缺乏癥，伴有高同型半胱氨酸血癥MMA肝豆?fàn)詈俗冃?，低鉀性周期性癱瘓，原發(fā)性震顫發(fā)作性非運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙原發(fā)性肌張力障礙先天性肌強(qiáng)直手術(shù)治療原發(fā)性高草酸尿癥神經(jīng)纖維瘤結(jié)節(jié)硬化癥第13頁，共75頁。一、遺傳與人

5、類疾病什么是遺傳?。窟z傳病的分類什么是基因？什么是“基因突變”？二、為什么要建立基因檢測？三、如何檢測基因突變？四、常用的基因檢測技術(shù)平臺及特點(diǎn)五、基因檢測的臨床應(yīng)用目錄第14頁，共75頁。遺傳病檢查基因突變蛋白質(zhì)改變代謝異常臨床表現(xiàn)基因檢測酶活性測定質(zhì)譜檢測臨床診斷第15頁，共75頁。 微小突變 拷貝數(shù)變異復(fù)雜變異DMD多巴反應(yīng)性肌張力障礙肝豆?fàn)詈俗冃灾|(zhì)沉積性肌病脆性綜合征遺傳共濟(jì)失調(diào)亨廷頓病FSHDOPMDPWS綜合征Angelman地貧Down syndrome如何檢測基因突變？遺傳病都是從基因突變開始的第16頁，共75頁。基因檢測的目的與策略目的1：有無突變？策略1：直接檢測突變策略

6、2：連鎖分析間接檢測有無攜帶突變目的2：何種突變？策略：直接檢測突變第17頁，共75頁。突變類型方法舉例微小突變錯(cuò)義/無義突變剪接突變調(diào)控區(qū)序列突變小缺失/插入基因測序(Sanger測序、二代測序NGS)熔點(diǎn)曲線地貧血友病乙肝病毒拷貝數(shù)變異簡單拷貝復(fù)雜拷貝定量PCR/片段分析PCR; TP-PCR; TP-msPCR; msPCR強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良肯尼迪病大片段插入/缺失連接酶依賴性探針擴(kuò)增（MLPA技術(shù)）Southern blotFISHaCGH假肥大型肌營養(yǎng)不良脊肌萎縮癥復(fù)雜的重排長片段PCR血友病表觀遺傳變異msPCR; ms-MLPA天使綜合征基因檢測方法第18頁，共75頁。直接診斷策略

7、-直接檢測基因的各種突變 微小突變（“點(diǎn)突變”） 第一代(Sanger)測序 苯丙酮尿癥 甲基丙二酸血癥 肝豆?fàn)詈俗冃?拷貝數(shù)變異片段分析Southern blot脆性綜合征遺傳共濟(jì)失調(diào)亨廷頓病FSHD復(fù)雜變異MLPAFISHPWS綜合征地貧下一代測序NGS基因芯片 CMA第19頁，共75頁。高級的診斷技術(shù)-CMA和NGS測序“高密度，靈活定制，微量樣品”數(shù)千美元測定全基因組第20頁，共75頁。間接診斷策略-多態(tài)性連鎖分析、關(guān)聯(lián)分析 連鎖分析例子間接診斷基因尚未被定位或闡明找不到突變產(chǎn)前診斷多態(tài)性連鎖分析尋找具有基因缺陷的染色體、相關(guān)基因的等位基因型和單倍體型等，并判斷受檢者是否存在。第21頁

8、，共75頁。CREDIT: JOE SUTLIFF Science, Vol 291: 1221.Fishing in a More Effective Way!選擇哪種技術(shù)，要看具體想解決的問題第22頁，共75頁。一、遺傳與人類疾病什么是遺傳??？遺傳病的分類什么是基因？什么是“基因突變”？二、為什么要建立基因檢測？三、如何檢測基因突變？四、常用的基因檢測技術(shù)平臺及特點(diǎn)五、基因檢測的臨床應(yīng)用目錄第23頁，共75頁。經(jīng)典的直接測序方法，基因突變檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”；主要檢測微小的基因突變（包括點(diǎn)突變、微小缺失或重復(fù)）；僅適用于單基因遺傳病檢測，無法檢測多基因遺傳病；常用的基因檢測技術(shù)平臺及特點(diǎn)3、一

9、代測序：Sanger測序1、多重連接酶依賴性探針擴(kuò)增技術(shù)（MLPA）探針與靶序列DNA進(jìn)行雜交，通過探針的特異化連接、PCR擴(kuò)增，收集數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析；可應(yīng)用于缺失、重復(fù)突變檢測；2、基于PCR的片段分析技術(shù)以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)；主要檢測動(dòng)態(tài)突變（指DNA中的核苷酸（主要為三核苷酸）重復(fù)序列的拷貝數(shù)發(fā)生擴(kuò)增而產(chǎn)生的突變）；第24頁，共75頁。4、下代測序/高通量測序(NGS)：革命性技術(shù)發(fā)展對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，通過邊合成邊測序，一次可并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定；可對多個(gè)基因共同作用引起遺傳病進(jìn)行測度檢測，能更好、更快確診各種遺傳??；主流平臺： Roche 454焦磷酸測序

10、； Illumina Solexa 合成測序； ABI SOLiD連接法測序；第25頁，共75頁。疾病概述（一）MLPA技術(shù)介紹/WebForms/WebFormMain.aspx原理：利用可與樣本DNA正確雜交并被連接酶連接的探針進(jìn)行擴(kuò)增和定量分析。MLPA的典型特點(diǎn)是，它不是擴(kuò)增靶序列，而是擴(kuò)增與靶序列結(jié)合的MLPA探針。第26頁，共75頁。MLPA技術(shù)特點(diǎn)第27頁，共75頁。MLPA應(yīng)用范圍染色體異常（數(shù)目、重排、染色體亞端粒區(qū)域的基因拷貝數(shù)變化 ）遺傳疾病基因缺失、重復(fù)分析單核苷酸多態(tài)性(SNP)和突變檢測 基因甲基化檢測腫瘤診斷與治療方面的應(yīng)用mRNA研究等第28頁，共75頁。案例一

11、第29頁，共75頁。第30頁，共75頁。第31頁，共75頁。第32頁，共75頁。（二）片段分析技術(shù)第33頁，共75頁。 動(dòng)態(tài)突變：動(dòng)態(tài)突變是指DNA中的核苷酸（主要為三核苷酸）重復(fù)序列的拷貝數(shù)發(fā)生擴(kuò)增而產(chǎn)生的突變。動(dòng)態(tài)突變伴隨著世代的傳遞而不斷擴(kuò)增，重復(fù)序列的拷貝數(shù)越來越多，在達(dá)到一定的倍數(shù)后就導(dǎo)致疾病的發(fā)生，其發(fā)病率和疾病的嚴(yán)重性也逐代升高加重。eg:脆性X綜合征是由FMR1基因（Xq27.3）的CGG重復(fù)數(shù)擴(kuò)增而引起的，正常人重復(fù)數(shù)為645次，前突變?yōu)?5-200，全突變則200次。需聯(lián)合應(yīng)用std-PCR及TP-PCR技術(shù)診斷脆性X綜合征。第34頁，共75頁。特殊PCR方法std-PCR

12、原理由正反向引物擴(kuò)增包含了重復(fù)序列的目的片段，檢測目的片段的長度，從而計(jì)算出重復(fù)區(qū)的重復(fù)次數(shù)。TP-PCR原理PCR的反向引物被設(shè)計(jì)與致病基因的重復(fù)序列進(jìn)行雜交。各種大小不一的序列在三重PCR反應(yīng)中被擴(kuò)增出來。如果重復(fù)數(shù)量增加了，一個(gè)明顯的PCR產(chǎn)物輪廓（梯形輪廓）會(huì)在峰圖中出現(xiàn)。第35頁，共75頁。 片段分析主要適用項(xiàng)目（動(dòng)態(tài)突變）SCA（脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)）FRDA（Friedreich共濟(jì)失調(diào)）HD（亨廷頓舞蹈?。㎏D（肯尼迪?。〥M（強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良）FraX（脆性X綜合征）第36頁，共75頁。SCA3片段分析第37頁，共75頁。（三）Sanger測序確定一條染色體片斷上的堿基順序。Sa

13、nger法：在PCR時(shí)加入熒光標(biāo)記的復(fù)制終止劑，比如ddA,ddT,ddC,ddG（相應(yīng)于4種堿基）ddX的兩個(gè)作用：可以當(dāng)作正常堿基參與復(fù)制一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接電泳誰終止，堿基就是誰此方法獲1974年的Nobel獎(jiǎng)第38頁，共75頁。分析流程記錄SNP編號和命名是否突變命名查數(shù)據(jù)庫錯(cuò)義突變Polyphen預(yù)測非編碼區(qū)同義突變剪接位點(diǎn)預(yù)測Google查詢圖形質(zhì)量判斷查SNP位點(diǎn)合格結(jié)果解釋測序圖形數(shù)據(jù)分析第39頁，共75頁。BTD基因測序結(jié)果父親患兒母親c.637delCc.1387TGc.1387TGc.637delC正常型正常型第40頁，共75頁。（四）高通量測序 高通量

14、測序技術(shù)（High-throughput sequencing）又稱“下一代”測序技術(shù)（“Next-generation” sequencing technology），以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定和一般讀長較短等為標(biāo)志。 NGS主流平臺包括Roche 454焦磷酸測序、Illumina Solexa 合成測序、ABI SOLiD連接法測序、單分子測序技術(shù)以及由life techlogies 公司推出的Ion Torrent PGM（PersonalGenomeMachine個(gè)體化操作基因組測序儀）半導(dǎo)體測序技術(shù)。第41頁，共75頁。傳統(tǒng)的分子遺傳檢測一個(gè)項(xiàng)目檢測一種疾

15、病某些復(fù)雜遺傳病十分復(fù)雜，十分難以有效檢測：ALS智力障礙肢帶型肌營養(yǎng)不良第42頁，共75頁。酶學(xué)分析粘多糖癥腦白質(zhì)病-ASAKrabbe病肌肉病理LGMD免疫組化染色體與分子生化 與酶學(xué)形態(tài)分子通量 檢測能力 第43頁，共75頁。Life: Ion torrent PGM; Ion protonIllumina miseq高通量測序平臺nextseq 500第44頁，共75頁。由Illumina開發(fā)，TruSight One Sequencing Panel全面覆蓋4,813個(gè)與臨床表型相關(guān)的基因。實(shí)驗(yàn)室可分析panel上的全部基因，或有選擇地關(guān)注特定亞群。通過這種方式，單個(gè)panel可有效

16、代表整個(gè)新一代測序組合。Illumina miseq第45頁，共75頁。一、遺傳與人類疾病什么是遺傳??？遺傳病的分類什么是基因？什么是“基因突變”？二、為什么要建立基因檢測？三、如何檢測基因突變？四、常用的基因檢測技術(shù)平臺及特點(diǎn)五、基因檢測的臨床應(yīng)用目錄第46頁，共75頁。金域檢驗(yàn)基因檢測項(xiàng)目介紹針對疾病遺傳物質(zhì)變異方式：多種檢測平臺整合針對臨床不同檢測需求：單一項(xiàng)目和套餐項(xiàng)目設(shè)置第47頁，共75頁。疑難遺傳病基因檢測方案適用情況：臨床已排除常見病因，高度懷疑是遺傳病，但是患者癥狀不典型或者癥狀設(shè)計(jì)多個(gè)系統(tǒng)，臨床無法明確診斷，僅懷疑為遺傳病解決方案：金域能根據(jù)臨床提供患者癥狀和病例，選擇與疾病

17、相關(guān)基因進(jìn)行檢測，提供個(gè)性化檢測服務(wù)第48頁，共75頁。常見遺傳病基因檢測方案適用情況：患者癥狀典型，臨床能明確診斷疾病類型或者具體疾病亞型，如腓骨肌萎縮病或者腓骨肌萎縮病1型等解決方案：金域可針對臨床診斷進(jìn)行相關(guān)基因檢測常見遺傳病基因檢測系列列表骨骼肌基因基因檢測系列線粒體相關(guān)基因檢測系列周圍神經(jīng)疾病基因檢測系列神經(jīng)系統(tǒng)先天畸形基因檢測系列阿茲海默癥基因檢測系列神經(jīng)皮膚綜合征基因檢測系列遺傳性共濟(jì)失調(diào)基因檢測系列微量元素與金屬代謝障礙基因檢測系列智力發(fā)育障礙基因檢測系列遺傳代謝病基因檢測系列癲癇基因檢測系列.第49頁，共75頁。臨床僅能判斷為遺傳病無法明確為哪種遺傳病可送檢疑難遺傳病基因檢測

18、項(xiàng)目，一次檢測與臨床表現(xiàn)相關(guān)的基因臨床能明確為哪種遺傳代謝病，如能判斷為糖原累積癥，但是無法明確為糖原累積癥的哪種亞型臨床可送檢糖原累積癥整體檢測項(xiàng)目，一次檢測與糖原累積癥相關(guān)基因臨床能具體診斷為哪種疾病，如能明確為21羥化酶缺乏癥臨床可送檢CYP21A2基因檢測項(xiàng)目（MLPA檢測、測序） 基因檢測送檢流程臨床送檢思路第50頁，共75頁?；驒z測流程步驟采樣對象說明申請-申請人、醫(yī)生簽署知情同意書、收費(fèi)。為便于實(shí)驗(yàn)室與臨床醫(yī)生交流，希望醫(yī)生留電話號碼和e-mail。先證者檢測先證者先證者父母通常先證者的樣本都是必須的。當(dāng)先證者的樣本無法獲得時(shí)，也可以檢測肯定攜帶者。例如，X連鎖隱性遺傳患者的女

19、兒。父母的樣本僅作備用。當(dāng)先證者結(jié)果為“未發(fā)現(xiàn)異?！睍r(shí)，不對父母的樣本進(jìn)行檢測。家系研究先證者父母其他家屬有針對性地檢測父親和/或母親、其他家屬的樣本。根據(jù)實(shí)際情況收費(fèi)，例如：測序項(xiàng)目僅需檢測特定的位點(diǎn)，按位點(diǎn)數(shù)目收費(fèi)；MLPA項(xiàng)目，同先證者的收費(fèi)遺傳咨詢-建議憑檢測結(jié)果到具有資質(zhì)的機(jī)構(gòu)進(jìn)行遺傳咨詢第51頁，共75頁?；驒z測的樣本類型第52頁，共75頁。第53頁，共75頁。DNA提取PCR儀ABI9700瓊脂糖凝膠電泳 (伯樂)毛細(xì)管電泳(ABI3500 xl)結(jié)果分析MutationInterpret樣本處理數(shù)據(jù)分析 結(jié)果解釋突變命名SNP查找未知突變分析 SplicePort: 剪接分析

20、Polyphen2: 蛋白分析家系研究Important ReferencesPubmedGeneReviewsOMIMClinical communicationMLPA 測序基因檢測流程第54頁，共75頁。基因總樣本數(shù)陽性樣本數(shù)陽性率WT113215.4%NR5A1711/7NR0B1(DAX1)261350%LHGCR1011/10CYP11B1911/9HSD3B2311/3CYP17A116956.3%POR1033/10HSD17B3511/5SRD5A2722940.3%AR351542.9%STAR322/3CYP21A224512450.6%CYP21A2 MLPA181266.7%性別發(fā)育相關(guān)基因MLPA檢測16531.3%2012年5月2014年5月性別發(fā)育障礙相關(guān)基因陽性率總匯第55頁，共75頁。遺傳代謝遺傳病新生兒糖尿病青少年發(fā)病的成年型糖尿病糖原累積癥溶酶體貯積癥肉堿循環(huán)缺陷相關(guān)基因黏多糖癥線粒體相關(guān)疾病智力發(fā)育障礙過氧化物酶體